专利名称：稀土掺杂碱土金属氟化物纳米材料及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种稀土掺杂无机纳米材料及其制备与应用，尤其是涉及一种水溶性稀土掺杂碱土金属氟化物纳米荧光标记材料的合成及其在荧光生物检测与生物成像领域的应用。
背景技术：
近年来稀土掺杂无机发光材料得到广泛关注，这些材料在一些传统领域例如无汞荧光灯、平板显示器、固态激光器、光存储、LED、太阳能电池等方面都体现出极大的应用价值，其中最引人注目的是最近兴起的稀土掺杂无机纳米材料在荧光生物标记方面的应用。与传统的荧光标记材料(例如荧光染料与量子点)相比，稀土掺杂无机纳米材料具有高化学稳定性、长荧光寿命、低毒性、可调谐荧光发射波长和更大的组织穿透深度等综合优势，是目前普遍看好的新一代荧光生物标记材料。然而，荧光标记材料对纳米颗粒的尺寸、形貌、分散性、水溶性以及生物相容性等都有着极高的要求，尤其对单分散的10 nm以下的纳米颗粒有着特别的需求。因此，制备单分散、形貌尺寸均匀、水溶性好以及生物相容的小尺寸纳米颗粒是该类材料应用于荧光生物标记的一个前提。目前已报道的材料体系中，氟化物由于高的化学稳定性、低声子能量(300-SOOcnT1)，是一类理想的稀土掺杂基质材料。其中，碱土金属氟化物(CaF2、SrF2、BaF2)作为高效的上转换与下转换发光材料，它的生物相容性极佳，因而备受关注。合成单分散、形貌尺寸均匀的碱土金属氟化物纳米颗粒目前主要有两种方法:溶剂热与三氟乙酸盐热分解的方法(参考文献:Li Yadong et al., Upconversion Luminescence of MonodisperseCaF2:Yb3VEr3+ Nanocrystals, J.Am.Chem.Soc., 131，14200-14201 (2009) ; YanChunhua et al., Uniform Alkaline Earth Fluoride Nanocrystals with DiverseShapes Grown from Thermolysis of Metal Trifluoroacetates in Hot SurfactantSolutions, Cryst.Growth & Des., 9，2013-2019 (2009))。溶剂热法需要特殊的反应装置(高压釜)，且反应时间较长(12-36小时)，更耗能；另外溶剂热法无法进行核壳结构的生长，这对于小纳米颗粒的上转换发光很不利，往往颗粒越小，表面的基团对稀土离子的上转换发光猝灭就越厉害，而在原有核的基础上包覆一个壳层是一个很好的提高上转换发光的方案，但溶剂热的方法还无法做到这一点。三氟乙酸盐热分解的方法在反应过程中会释放出氟化氢等有毒气体，这对于人体以及环境都是一种很大的伤害。此外，由于稀土离子在碱土金属氟化物中是异价掺杂，因此进行不同浓度的稀土掺杂会导致纳米晶的形貌、尺寸发生很大的变化(参考文献:Wang Yuansheng et al., Modifying the Size andShape of Monodisperse Bifunctional Alkaline-Earth Fluoride Nanocrystals throughLanthanide Doping, J.Am.Chem.Soc., 132，9976-9978 (2010))。针对上述问题，本发明采取简单、绿色、环保的合成方法，利用油酸作表面活性剂，钠离子作为成核剂与电荷补偿剂，通过高温共沉淀的方法合成了 10 nm以下的稀土掺杂碱土金属氟化物及其核壳结构纳米颗粒。合成出的碱土金属氟化物纳米颗粒 表面带有油酸根基团，可以很好地分散在环己烷、氯仿、甲苯等非极性有机溶剂中；由于钠离子的作用，所制得的纳米颗粒的形貌、尺寸不随掺杂稀土离子的种类与浓度发生大的变化，且纳米颗粒的晶化与发光性能都得到了很大的提高；在核的基础上进行外延生长，可制得核壳结构纳米颗粒，从而显著增强上转换发光；利用磷酸乙醇胺等亲水性表面活性剂交换纳米颗粒表面的油酸，可以使其表面修饰上大量的氨基或羧基官能团，从而实现水溶性；同时可进一步偶联生物分子，应用于生物检测与生物成像等领域。
发明内容
本发明的目的在于提出一种通过高温共沉淀与配体交换两步合成水溶性稀土掺杂碱土金属氟化物纳米荧光标记材料的方法。本发明采用如下技术方案:具有如下组分的水溶性稀土掺杂碱土金属氟化物纳米材料:xLn3+-yNa+-[1- (x+y) ]MF2，其中 Ln3+ 选自 Ce3+、Yb3+、Er3+、Tm3+、Ho3+、Eu3+、Gd3+、Tb3+、Dy3+、Sm3+、Nd3+ 或 Pr3+ 中的一种或任意多种；M 选自 Ca、Sr 或 Ba ;0〈x = 50 mo I %, 0<y = 50 mo I %。所述材料的平均尺寸小于10 nm。所述的纳米材料用于荧光生物检测与生物成像。所述的纳米材料的制备方法，包括如下步骤:(I)制备油溶性稀土掺杂碱土金属氟化物纳米颗粒:以碱土金属醋酸盐与稀土醋酸盐为原料，然后加入油酸与十 八烯，在惰性气体保护下加热溶解，形成溶液A，并降温至70°C以下；另将氟化钠或者氟化铵与氢氧化钠溶解在甲醇中形成溶液B，将溶液B加入溶液A中形成混合溶液C，然后加热排除甲醇，升温至250-300°C保温一段时间后降至室温，加丙酮或乙醇沉淀分离并洗涤，即获得油溶性稀土掺杂碱土金属氟化物纳米颗粒；(2)利用步骤(I)制得的纳米颗粒制备所述的水溶性的稀土掺杂碱土金属氟化物纳米材料。前述制备过程中，反应物的加入摩尔量比例(相对于金属醋酸盐总量)为:碱土金属醋酸盐:0.5^1 ；稀土醋酸盐:0、.5;氟化钠:广3;氟化铵:广3;氢氧化钠:0 3 ;油酸:3 10;十八烯:0 20。本发明还提供具有如下组分的水溶性稀土掺杂碱土金属氟化物纳米材料:xLn3+-yNa+-[1- (x+y) ]MF2，其中 Ln3+ 选自 Ce3+、Yb3+、Er3+、Tm3+、Ho3+、Eu3+、Gd3+、Tb3+、Dy3+、Sm3+、Nd3+ 或 Pr3+ 中的一种或任意多种；M 选自 Ca、Sr 或 Ba ; 0〈x = 50 mo I %, 0〈y = 50 mo I % ；该材料为核壳结构。所述的纳米材料的制备方法，包括如下步骤:(I)制备油溶性稀土掺杂碱土金属氟化物纳米颗粒内核:以碱土金属醋酸盐与稀土醋酸盐为原料，然后加入油酸与十八烯，在惰性气体保护下加热溶解，形成溶液A，并降温至70°C以下；另将氟化钠或者氟化铵与氢氧化钠溶解在甲醇中形成溶液B，将溶液B加入溶液A中形成混合溶液C，然后加热排除甲醇，升温至250-300°C保温一段时间后降至室温，力口丙酮或乙醇沉淀分离并洗涤，然后溶解在5-20 mL环己烷中，形成溶液D ;(2)制备油溶性稀土掺杂碱土金属氟化物核壳结构纳米颗粒:以碱土金属醋酸盐与稀土醋酸盐为原料，然后加入油酸与十八烯，在惰性气体保护下加热溶解，形成透明溶液E并降温，同时将如步骤(I)所述溶液D加入E中并排除环己烷再降至室温，另将氟化铵溶解在甲醇中形成透明溶液F，将溶液F加入溶液E中形成混合溶液G，然后加热排除甲醇，升温至250-300°C保温一段时间后降至室温，加丙酮或乙醇沉淀分离并洗涤，即获得油溶性稀土掺杂碱土金属氟化物核壳结构纳米颗粒；(3)利用步骤(2)制得的纳米颗粒制备所述的水溶性稀土掺杂碱土金属氟化物纳米材料，该材料为核壳结构。所述纳米材料的表征。通过X射线粉末衍射(XRD)检测表明制备出的油溶性碱土金属氟化物纳米材料均为纯的立方相结构。X射线能谱分析(EDS)结果证实合成出的材料中含有Ca/Sr/Ba、F以及所 掺杂的Na与稀土元素。透射电镜(TEM)测试显示得到的是平均尺寸为4 nm的超小的单分散纳米颗粒与平均尺寸为6-10 nm的核壳结构纳米颗粒。荧光光谱测试表明，分散在环己烷中的CaF2:Ce/Tb/Na和CaF2:Eu/Na油溶性纳米颗粒均具有较强的可见下转换发光，且钠离子的掺杂显著提高了 CaF2:Ce/Tb的发光并拉长了其荧光寿命。在980 nm激光激发下，分散在环己烷中的CaF2:Er/Yb/Na和CaF2:Tm/Yb/Na油溶性核壳结构纳米颗粒均具有较强的可见上转换发光。表面改性后水溶性纳米颗粒和生物偶联的纳米颗粒可以由红外、热重、电势等表征。热重分析(TGA)结果显示了油溶性纳米颗粒与磷酸乙醇胺(AEP)包覆的水溶性纳米颗粒有明显不同的失重温度范围，表明纳米颗粒表面状态发生了明显变化。傅立叶变换红外光谱(FTIR)表明，配体交换过后纳米颗粒表面有很明显的对应于磷酸乙醇胺的红外振动吸收峰:1078 CnT1是对应于P-O的振动吸收峰；1642 CnT1则是对应于-NH2的振动吸收峰，而对应于油酸长链的-CH2-的振动吸收峰2854及2924 cm-1在配体交换过后强度明显减弱，这些结果表明纳米颗粒表面已经成功修饰上了磷酸乙醇胺；生物素化的纳米颗粒在1678 cm-1处出现了明显的酰胺键振动峰，表明纳米颗粒表面连接了生物素分子。电势表明在配体交换后，纳米颗粒带有+46.8 mV的正电势，证明磷酸乙醇胺能很好地包覆在纳米颗粒表面；生物素化与偶联尿激酶氨基末端片段(ATF)蛋白后，纳米颗粒的4 -电势分别变为+24.5 11^和+9.4 mV，表明了生物素与ATF蛋白都能成功地结合在纳米颗粒表面。所述纳米材料的荧光生物检测应用可通过生物分子的异相时间分辨荧光(TRPL)检测与均相时间分辨荧光共振能量传递(TR-FRET)检测证明；TRPL检测结果表明，待检测的生物分子(如亲和素蛋白)在一定浓度范围与纳米材料的荧光信号呈比例关系；TR-FRET检测结果表明，待检测生物分子(如亲和素蛋白和ATF蛋白)分别在一定浓度范围与荧光素和纳米材料的荧光信号强度的比值呈比例关系。生物成像应用则通过肿瘤细胞的靶向成像来证明；细胞成像结果表明，在尿激酶受体(uPAR)高表达的人肺腺癌细胞H1299，由于所述纳米材料对肿瘤细胞的特异性识别，可观察到所述纳米材料的荧光信号；而在对照的uPAR低表达的人胚肺成纤维细胞HELF中，由于不存在特异性识别，因此无法看到所述纳米材料在该类细胞中的发光。通过本发明制备了水溶性稀土掺杂碱土金属氟化物及其核壳结构纳米材料，制备过程简单、合成条件容易控制、重复性好。本发明中油溶性纳米颗粒的制备与目前国内外现有的溶剂热与三氟乙酸盐热分解两种方法相比，更节能、环保，且操作简单，制备的纳米颗粒分散性更好，粒径更加均匀可控，利用表面改性后的氨基或羧基可与各种生物分子偶联，进一步应用于荧光生物检测与生物成像等领域。
以下掺杂样品均为摩尔百分比。附图1: (a) CaF2、(b) CaF2: 5%Eu, 5%Na、(c) CaF2: 5%Ce, 5%Tb, 10%Na 和(d)CaF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na纳米颗粒的X射线粉末衍射图。仪器型号为MiniFlex2，厂家为Rigaku，铜靶辐射波长为λ = 0.154187 nm。附图2: CaF2纳米颗粒的透射电镜图。仪器型号为JEM-2010，厂家为JE0L。附图3: CaF2: 5%Eu, 5%Na纳米颗粒的透射电镜图。仪器型号为JEM-2010，厂家为 JEOL。附图4: CaF2: 5%Ce, 5%Tb, 10%Na纳米颗粒的透射电镜图。仪器型号为JEM-2010，厂家为 JEOL。附图5: CaF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na纳米颗粒的透射电镜图。仪器型号为JEM-2010，厂家为 JEOL。
附图6: SrF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na纳米颗粒的X射线粉末衍射图。仪器型号为MiniFlex2,厂家为Rigaku,铜祀福射波长为λ = 0.154187 nm。附图7: BaF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na纳米颗粒的X射线粉末衍射图。仪器型号为MiniFlex2,厂家为Rigaku,铜祀福射波长为λ = 0.154187 nm。附图8: SrF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na纳米颗粒的(a)透射电镜图和(b)高分辨透射电镜图。仪器型号为JEM-2010，厂家为JE0L。附图9: BaF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na纳米颗粒的(a)透射电镜图和(b)高分辨透射电镜图。仪器型号为JEM-2010，厂家为JE0L。附图10: (a) CaF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na 内核与(b) CaF2: 0.5%Er, 18%Yb,18%NaiCaF2 (c) CaF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na@CaF2@CaF2 以及(d) CaF2: 0.5%Er, 18%Yb,18%NaiCaF2iCaF2iCaF2核壳结构纳米颗粒的X射线粉末衍射图。仪器型号为MiniFlex2，厂家为Rigaku，铜靶辐射波长为λ = 0.154187 nm。附图11: CaF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na@CaF2单层核壳结构纳米颗粒的透射电镜图。仪器型号为JEM-2010，厂家为JE0L。附图12: CaF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na@CaF2@CaF2双层核壳结构纳米颗粒的透射电镜图。仪器型号为JEM-2010，厂家为JE0L。附图13 =CaF2: 0.59ffir，18%Yb, 18%Na纳米颗粒的X射线能谱分析图。仪器型号为 JSM-6700F，厂家为 JE0L。附图14 =SrF2: 0.59ffir，18%Yb, 18%Na纳米颗粒的X射线能谱分析图。仪器型号为 JSM-6700F，厂家为 JE0L。附图15 =BaF2: 0.59ffir，18%Yb, 18%Na纳米颗粒的X射线能谱分析图。仪器型号为 JSM-6700F，厂家为 JE0L。
附图16: CaF2: 5%Eu, 5%Na纳米颗粒的下转换激发与发射光谱图。仪器型号为FLS920，厂家为Edinburgh，激发光源为氙灯。附图17: CaF2: 5%Ce, 5%Tb, 10%Na纳米颗粒的下转换激发与发射光谱图。仪器型号为FLS920，厂家为Edinburgh，激发光源为氙灯。附图18: CaF2: 5%Ce, 5%Tb 与 CaF2: 5%Ce, 5%Tb, 10%Na 纳米颗粒的发射光谱图。仪器型号为FLS920，厂家为Edinburgh，激发光源为氙灯。附图19: CaF2: 5%Ce, 5%Tb 与 CaF2: 5%Ce, 5%Tb, 10%Na 纳米颗粒的荧光衰减曲线。仪器型号为FLS920，厂家为Edinburgh，激发光源为氙灯。附图20: CaF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na@CaF2核壳结构纳米颗粒的上转换发射光谱图(激发波长为980 nm)。仪器型号为FSP920-C，厂家为Edinburgh，激发光源为980_nm半导体激光器。附图21: CaF2: 0.5%Tm, 18%Yb, 18%Na@CaF2核壳结构纳米颗粒的上转换发射光谱图(激发波长为980 nm)。仪器型号为FSP920-C，厂家为Edinburgh，激发光源为980_nm半导体激光器。附图22:油溶性和水溶性CaF2纳米颗粒纳米颗粒的热重曲线，仪器型号为STA449C，厂家为 Netzsch。附图23:油溶性、水溶性和生物素化CaF2纳米颗粒的傅立叶变换红外光谱，仪器型号为750,厂家为Magna。附图24:水溶性、生物素化以及偶联ATF蛋白CaF2纳米颗粒的ζ_电势，仪器型号为 Nano ZS ΖΕΝ3600，厂家为 Malvern。附图25:生物素化的 CaF2 = Ce, Tb, Na纳米材料对亲和素蛋白(avidin)的异相TRPL检测:(a) TRPL检测原理图；(b) TRPL光谱；(c)标准曲线。仪器型号为Synergy 4，厂家为 BioTek0附图26:生物素化和偶联ATF的CaF2:Ce，Tb，Na纳米材料分别对亲和素蛋白与尿激酶受体(suPAR)的均相TR-FRET检测:(a) TR-FRET检测原理图；(b)检测亲和素的TR-FRET光谱；(c)检测亲和素的标准曲线；(d)检测尿激酶受体的TR-FRET光谱；(e)检测尿激酶受体的标准曲线。仪器型号为Synergy 4,厂家为BioTek。附图27:偶联ATF的CaF2 = Ce, Tb, Na纳米材料对肿瘤细胞的靶向成像:(a) uPAR高表达的人肺腺癌细胞H1299的成像示意图；(b) uPAR低表达的人胚肺成纤维细胞HELF的成像示意图。仪器型号为FV1000,厂家为Olympus。
具体实施例方式本发明所提供的水溶性稀土掺杂碱土金属氟化物及其核壳结构纳米材料的制备方法，其实质特点和初步应用可以通过以下实施例子予以进一步体现。(以下掺杂样品均为摩尔百分比)实例1:CaF2: 5%Eu, 5%Na纳米材料的制备。称取0.167 g Ca (CH3COO) 2.H2O 与 0.02g Eu (CH3COO) 3.4H20,然后加入 5 mL 油酸与15 mL十八烯，通氮气加热至160 ° C并保温30分钟，形成透明溶液A，降至室温；另将
0.084 g NH4F与0.084 g NaOH溶解在10 mL甲醇中形成透明溶液B，将溶液B加入溶液A中形成混合溶液C，然后加热至60 ° C并保温30分钟排除甲醇，升温至280 ° C保温I小时后降至室温，加入30 mL丙酮沉淀分离并洗涤即得平均尺寸为4 nm的油溶性CaF2: 5%Eu,5%Na纳米颗粒。将油溶性纳米颗粒分散在10 mL环己烷中，向其中加入10 mL溶有30 mg四氟硼酸亚硝的二氯甲烷溶液，混合反应30分钟后离心，将得到的沉淀重新分散在10 mL二甲基甲酰胺中，加入0.1 g磷酸乙醇胺搅拌反应30分钟后，离心得到沉淀，用二甲基甲酰胺和水交替洗涤数遍即可得到平均尺寸为4 nm的水溶性CaF2: 5%Eu, 5%Na纳米材料。实例2:CaF2: 5%Ce, 5%Tb, 10%Na纳米材料的制备。以 0.158 g Ca(CH3COO)2.Η20、0.02g Ce (CH3COO) 3.4Η20和0.02g Tb (CH3COO) 3.4Η20为原料，合成步骤如实例1，最终制得平均尺寸为4nm的水溶性CaF2: 5%Ce, 5%Tb, 10%Na纳米材料。实例3 =CaF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na 纳米颗粒的制备。以 0.144 gCa (CH3COO) 2.Η20、0.002g Er (CH3COO) 3.4H20 和 0.076g Yb (CH3COO) 3.4H20 为原料，合成步骤如实例I，最终制得平均尺寸为4nm的水溶性CaF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na纳米材料。实例4:CaF2: 0.5%Tm, 50%Yb, 50%Na 纳米材料的制备。以 0.0872 gCa (CH3COO) 2.Η20、0.002g Tm(CH3COO)3.4H20 和 0.21 Ig Yb (CH3COO) 3.4H20 为原料，合成步骤如实例I，最终制得平均尺寸为4nm的水溶性CaF2: 0.5%Tm, 18%Yb, 50%Na纳米材料。实例5:SrF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na 纳米材料的制备。以 0.168 gSr (CH3COO) 2.0.5 H20、0.002g Er (CH3COO) 3.4H20 和 0.076g Yb (CH3COO) 3.4H20 为原料，合成步骤如实例I，最终制得平均尺寸为4nm的水溶性SrF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na纳米材料。实例6 =BaF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na 纳米材料的制备。称取 0.208 gBa (CH3COO) 2、0.002g Er (CH3COO) 3.4H20 和 0.076g Yb (CH3COO) 3.4H20,然后加入 20 mL 油酸，通氮气加热至240 ° C并保温I小时，形成透明溶液A，降至室温；另将0.084 g NH4F与0.084 g NaOH溶解在10 mL甲醇中形成透明溶液B，将溶液B加入溶液A中形成混合溶液C，然后加热至60 ° C并保温30分钟排除甲醇，升温至280 ° C保温I小时后降至室温，加入30 mL丙酮沉淀分离并洗涤即得平均尺寸为8 nm的油溶性BaF2: 0.5%Er, 18%Yb,18%Na纳米颗粒。将油溶性纳米颗粒分散在10 mL环己烷中，向其中加入10 mL溶有25 mg四氟硼酸亚硝的二氯甲烷溶液，混合反应30分钟后离心，将得到的沉淀重新分散在10 mL二甲基甲酰胺中，加入0.1 g磷酸乙醇胺搅拌反应30分钟后，离心得到沉淀，用二甲基甲酰胺和水交替洗涤数遍即可得到平均尺寸为8 nm的水溶性BaF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na纳米材料。实例7: CaF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na@CaF2核壳结构纳米材料的制备。首先，如实例3制备CaF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na油溶性纳米颗粒，并取一半溶于10 mL环己烷中形成透明溶液A ;接着，称取0.176 g Ca(CH3COO)2* H2O,然后加入5 mL油酸与15 mL十八烯，通氮气加热至160 ° C并保温30分钟，形成透明溶液B，降至80 ° C ;将A加入B中形成混合溶液C，在80 ° C下保温30分钟排除环己烷，降至室温；另将0.084 g NH4F溶解在10 mL甲醇中形成透明溶液D，将溶液D加入溶液C中形成混合溶液E，然后加热至60 ° C并保温30分钟排除甲醇，升温至280 ° C 保温I小时后降至室温，加入30 mL丙酮沉淀分离并洗涤即得平均尺寸为7 nm的油溶性CaF2: 0.5%Er, 18%Yb@CaF2核壳结构纳米颗粒。将油溶性纳米颗粒分散在10 mL环己烷中，向其中加入10 mL溶有20 mg四氟硼酸亚硝的二氯甲烷溶液，混合反应30分钟后离心，将得到的沉淀重新分散在10 mL 二甲基甲酰胺中，加入0.1 g磷酸乙醇胺搅拌反应30分钟后，离心得到沉淀，用二甲基甲酰胺和水交替洗涤数遍即可得到平均尺寸为7 nm的水溶性CaF2: 0.5%Er, 18%Yb, 18%Na@CaF2核壳结构纳米材料。实例8: CaF2: 5%Ce, 5%Tb, 10%Na纳米材料的异相TRPL检测。检测步骤如下:首先，将待检测的100 μ L溶解在包被液中的不同浓度亲和素蛋白加入到高亲板中并在4° C下孵育一晚后，用磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤三遍；接着，往孔加入100 μ L封闭液并在37 ° C下孵育2小时后，倒掉封闭液；然后往孔中加入100 UL (50 μ g/mL)所述的生物素化的纳米材料并在37 ° C下孵育2小时，用PBST洗涤三遍后，在荧光读板机上检测时间分辨荧光信号。由于亲和素蛋白与生物素的特异性结合，使得高亲板上结合与亲和素蛋白对应数量的纳米颗粒，通过纳米颗粒的荧光强度来定量亲和素蛋白的浓度。检测结果表明，亲和素蛋白在0.1-20纳摩尔浓度范围与纳米颗粒的荧光信号强度呈线性关系，证明了所述纳米材料可用于微量生物分子的异相TRPL检测。实例9: CaF2: 5%Ce, 5%Tb, 10%Na纳米材料的均相TR-FRET检测。检测步骤如下:首先，将溶有I mg尿激酶受体(suPAR)的500 μ L碳酸盐缓冲液与溶有0.2 mg的异硫氰酸荧光素(FITC) 100 μ L 二甲亚砜(DMSO)缓冲液充分混合，并在4 ° C下避光反应一夜，然后4 ° C下透析48小时，使得FITC与suPAR偶联在一起并去除多余FITC^flOOμ L不同浓度连有FITC的suPAR溶液加入96孔微孔板中，接着加入100 μ L (50 μ g/mL)所述的偶联ATF的纳米材料，并在37 ° C下孵育半小时，然后在荧光读板机上检测时间分辨荧光信号。由于ATF与suPAR的特异性结合，拉近了所述纳米材料与FITC的 距离，使得纳米颗粒将能量传递给FITC并使之发射荧光；FITC与所述纳米材料荧光信号的相对强度与所加入的suPAR浓度有关，因此可定量分析suPAR浓度。TR-FRET检测结果表明，suPAR蛋白在0.3-800纳摩尔浓度范围与FITC和所述纳米材料荧光信号的相对强度呈比例关系，证明了所述纳米材料可用于微量生物分子的均相TR-FRET检测。实例10: CaF2: 5%Ce, 5%Tb, 10%Na纳米材料的肿瘤细胞靶向成像。实验步骤如下:首先，分别将uPAR高表达的人肺腺癌细胞H1299以及uPAR低表达的人胚肺成纤维细胞HELF加入到培养板中并用培养液37 ° C下培育24小时后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤数遍；然后加入含有500 μ g/mL所述偶联上ATF纳米材料的培养液37 ° C下孵育2小时，再用PBS洗涤数次去除未连接到细胞的纳米颗粒；接着，加入DAPI染核5分钟，并用PBS洗涤数次；最后，利用共焦荧光显微镜观察所述纳米材料对肿瘤细胞的靶向识别情况。细胞成像结果表明，在uPAR高表达的人肺腺癌细胞H1299中，由于ATF与uPAR的特异性结合，可观察到较强的所述纳米材料的发光；而在uPAR低表达的人胚肺成纤维细胞HELF，由于缺乏这种特异性结合，无法监测到纳米材料的发光。这些结果表明，所述纳米材料经过偶联特定的生物分子，可用于肿瘤靶向生物成像。
权利要求
1.具有如下组分的水溶性稀土掺杂碱土金属氟化物纳米材料:XLn3+-yNa+-[l-(X+y)]MF2，其中 Ln3+ 选自 Ce3+、Yb3+、Er3+、Tm3+、Ho3+、Eu3+、Gd3+、Tb3+、Dy3+、Sm3+、Nd3+ 或 Pr3+ 中的一种或任意多种；M 选自 Ca、Sr 或 Ba ;0〈x = 50 mo I %, 0〈y = 50 mo I %。
2.根据权利要求1所述的材料，其特征在于:所述材料的平均尺寸小于10nm。
3.权利要求1或2所述的纳米材料的制备方法，包括如下步骤: (1)制备油溶性稀土掺杂碱土金属氟化物纳米颗粒:以碱土金属醋酸盐与稀土醋酸盐为原料，然后加入油酸与十八烯，在惰性气体保护下加热溶解，形成溶液A，并降温至70°C以下；另将氟化钠或者氟化铵与氢氧化钠溶解在甲醇中形成溶液B，将溶液B加入溶液A中形成混合溶液C，然后加热排除甲醇，升温至250-300°C保温一段时间后降至室温，加丙酮或乙醇沉淀分离并洗涤，即获得油溶性稀土掺杂碱土金属氟化物纳米颗粒； (2)利用步骤(I)制取的纳米颗粒制备所述的水溶性稀土掺杂碱土金属氟化物纳米材料。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:合成油溶性纳米颗粒过程引入钠离子以及反应物的加入摩尔量比例(相对于金属醋酸盐总量): 碱土金属醋酸盐:0.5"!； 稀土醋酸盐:0 0.5 ； 氟化钠:广3 ； 氟化铵:广3 ； 氢氧化钠:(Γ3 ； 油酸:3 10 ； 十八烯:(Γ20。
5.具有如下组分的水溶性稀土掺杂碱土金属氟化物纳米材料:XLn3+-yNa+-[l-(X+y)]MF2，其中 Ln3+ 选自 Ce3+、Yb3+、Er3+、Tm3+、Ho3+、Eu3+、Gd3+、Tb3+、Dy3+、Sm3+、Nd3+ 或 Pr3+ 中的一种或任意多种；M选自Ca、Sr或Ba ； 0〈x ^ 50 mol%,0<y ^ 50 mol% ;该材料为核壳结构。
6.权利要求5所述的纳米材料的制备方法，包括如下步骤: (O制备油溶性稀土掺杂碱土金属氟化物纳米颗粒内核:以碱土金属醋酸盐与稀土醋酸盐为原料，然后加入油酸与十八烯，在惰性气体保护下加热溶解，形成溶液A，并降温至70°C以下；另将氟化钠或者氟化铵与氢氧化钠溶解在甲醇中形成溶液B，将溶液B加入溶液A中形成混合溶液C，然后加热排除甲醇，升温至250-300°C保温一段时间后降至室温，加丙酮或乙醇沉淀分离并洗涤，然后溶解在5-20 mL环己烷中，形成溶液D ; (2)制备油溶性稀土掺杂碱土金属氟化物核壳结构纳米颗粒:以碱土金属醋酸盐与稀土醋酸盐为原料，然后加入 油酸与十八烯，在惰性气体保护下加热溶解，形成透明溶液E并降温，同时将如步骤(I)所述溶液D加入E中并排除环己烷再降至室温，另将氟化铵溶解在甲醇中形成透明溶液F，将溶液F加入溶液E中形成混合溶液G，然后加热排除甲醇，升温至250-300°C保温一段时间后降至室温，加丙酮或乙醇沉淀分离并洗涤，即获得油溶性稀土掺杂碱土金属氟化物核壳结构纳米颗粒； (3)利用步骤(2)制取的纳米颗粒制备所述的水溶性稀土掺杂碱土金属氟化物纳米材料，该材料为核壳结构。
7.权利要求1或2或5所述的纳米材料用于荧光生物检测与生物成像，包括异相时间分辨荧光(TRPL)检测、均相时间分辨荧光共振能量传递(TR-FRET)检测、异相上转换荧光(UCL)检测和均相上转换荧光共振能量传递(`UC-FRET)检测以及肿瘤靶向生物成像等。
全文摘要
本发明公开一种具有如下组分的水溶性稀土掺杂碱土金属氟化物纳米材料xLn3+-yNa+-[1-(x+y)]MF2，其中Ln3+选自Ce3+、Yb3+、Er3+、Tm3+、Ho3+、Eu3+、Gd3+、Tb3+、Dy3+、Sm3+、Nd3+或Pr3+中的一种或任意多种；M选自Ca、Sr或Ba；0<x≦50 mol％，0<y≦50 mol％。该材料具有较好的水溶性和发光性能，可应用于生物检测与生物成像等领域。
文档编号C09K11/61GK103224787SQ201310138548
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月19日 优先权日2013年4月19日
发明者陈学元, 郑伟, 涂大涛, 刘永升, 朱浩淼 申请人:中国科学院福建物质结构研究所