专利名称：一种血液rna表面增强拉曼光谱检测方法
技术领域：
本发明涉一种血液RNA表面增强拉曼光谱的检测方法，更具体的说是从人的血液中提取RNA分子，滴加于银纳米薄膜上，然后通过表面增强拉曼光谱来检测RNA分子的拉曼 (SERS)光谱信号，属于生物医学光学技术在生命科学中的应用领域。
背景技术：
理想的癌症早期筛查试验要求高灵敏度，高特异性，快速及低损伤的检验效果，才能有效的阻止癌症的继续发展和减少癌症的死亡率。但是目前没有一种方法能符合这种理想的筛选技术。如用于检测结肠癌的常用的方法有乙状结肠镜，钡灌肠，全结肠镜检查等，虽然灵敏度和特异性相对较高，但这些检查是侵入性的，而且费用较高。与之相比，粪便隐血试验是一种无损伤的检测，但这种方法既不灵敏也不特异。因此，为了克服这些局限性，需要寻求一种简单，准确，安全及快速的方法来检测癌症，不仅能为临床医生提供迅速和客观的诊断信息，也会大大地提高患者的生存率。自1948年由Mandel和Metais发现循环核酸以来，越来越多的科学家致力于循环核酸的研究，循环核酸对于肿瘤的早期发现，诊断以及治疗具有重要的价值，为非侵入性肿瘤检测提供了可能性。肿瘤标志物mRNA检测是目前循环核酸领域研究最多且最深入的。近年来，新发现的miRNA是一类内源性非蛋白质编码的RNA分子，与癌症的发生发展有着重要的关系，研究表明在结肠癌组织和血清中的特异性miRNA可用于筛查结肠癌，以及动态监测预癌症的复发。自从Fleischmarm等人发现表面增强拉曼散射现象以来，表面增强拉曼散射已经成为分子吸收、单分子检测等最为灵敏的检测技术之一。许多超低浓度的分析物，包括化学、生物和医学分子均可以通过SERS检测出来。当目标分子吸附在银或者金的纳米结构上时，非共振的拉曼信号会被增强到IO14倍。如今SERS光谱的检测技术在生物医学领域得到广泛的应用，癌症的SERS光谱的检测已成为研究的热点。目前有报道对组织和细胞中的生物大分子如DAN、RNA的检测，并获得较好的SERS光谱，但尚未见对人体血液中RNA的SERS 光谱检测的研究报道，如果这一研究应用于实际，将有益于对人结肠癌或其它癌症的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用不同SERS光谱增强基底，特别是采用银纳米薄膜基底来检测血液中RNA分子的SERS光谱的检测技术。为实现本发明的目的采用的技术方案是 1.血液中提取RNA分子
从人的全血中分离出血清并放到-80°C冰箱保存，以防RNA的裂解。使用Trizol LS reagent从血清中提取RNA，用30μ1的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA，并用微量紫外分光光度计(NanoDrop ND) 1000定量RNA，浓度为18. 8到56. 4ng/mL,提取的RNA样品备用。2. SERS光谱增强基质银纳米粒子的制备
采用柠檬酸钠还原方法，制备银溶胶增强基质，取10 mg硝酸银溶于50mL去离子水中， 加热至100°C使之沸腾，然后将1 ml浓度为1%的柠橄酸三钠逐滴加入，并快速搅拌，滴加完后继续保持沸腾6小时得到银溶胶溶液。银溶胶溶液自然冷却后，用离心机离心分层，将上层清液丢弃，得到银溶胶浓缩液。3. SERS光谱增强基底银纳米薄膜的制备
取银溶胶浓缩液滴加到矩形铝片上扩散成胶体膜，然后将0. IM的MgSO4溶液滴加到胶体膜上，银溶胶迅速发生聚集，待聚集的银溶胶在室温下自然凉干之后，再用移液枪向其滴加5μ1 RNA样品；室温下孵育3 min后再进行SERS光谱检测。这种方法与一些文献中报道的胶体与样品直接混合不一样，经MgSO4溶液聚集的银胶在室温下自然凉干之后，会形成一层银纳米薄膜，与样品结合后会产生很强的电磁增强效应和额外的化学吸附作用，从而得到很强的SERS光谱信号。4. RNA样品的SERS检测
使用共聚焦显微拉曼光谱仪测量样品的拉曼光谱，测量条件为激发光波长785 nm，激发光功率为50 %，CCD取谱时间10 s，在20 X物镜下测量样品的拉曼信号，拉曼光谱取谱范围为^O-lSOOcnr1，对每条光谱的原始数据通过软件进行多项式拟合扣除荧光背景，从而获取SERS光谱。5. SERS光谱数据的收集与分析
检测不同RNA样品的SERS光谱，并建立表面增强拉曼光谱数据库，采用合适的统计软件对所述表面增强拉曼光谱数据库进行统计分析，建立表面增强拉曼光谱分析模型。本发明优势在于通过制备银纳米薄膜的SERS增强基底，得出这种增强基底检测 RNA分子所获得的信息最多且强度最高，得到RNA样品高质量的SERS光谱，从而易于对获得的表面增强拉曼光谱进行分析处理，获得有价值的信息。
图1是本发明对不同条件所测得的RNA的SERS光谱图。图2是本发明分别对银纳米粒子和银纳米薄膜所测的的透射电镜图和扫描电镜图。图3是本发明对不同条件下所测的各种样品的紫外可见吸收光谱图。图4是本发明对正常人和结直肠癌患者血液RNA分析判别的LDA积分图。图1中d表示样品本底SERS光谱，可以看出基本上没有什么信号出现，说明DEPC 水本底不会对RNA光谱信号的测量产生干扰；c表示银胶没有凉干就滴加RNA样品的SERS 光谱图，可以看出只有少量的几个峰出现；b表示当银胶自然凉干后再滴加RNA样品，与c 比较发现多了一些新的峰，而且峰的强度明显增强了许多，说明银胶自然凉干后对样品的增强效果要强得多；a表示当银胶中加入微滴的MgSO4溶液时，且自然凉干后所得的SERS光谱图，MgSO4溶液使银胶迅速地聚集且颜色变黑，从SERS光谱图中可以看出拉曼峰的强度急剧增强，且又出现了许多新的拉曼峰，说明晾干后的MgSO4溶液聚集的银胶能够得到更多更强的RNA样品的拉曼峰，充分反应样品信息。这种用MgSO4溶液聚集的银胶干后可形成一层银纳米薄膜，这种膜能够大大地增强吸附在它上面的生物大分子的信号，所以当RNA分子吸附在它上面时会产生很强的SERS效应。图2中A表示本发明制备的柠檬酸三钠溶液还原的银纳米粒子TEM显微图，可以看出粒径约为70-80 nm,且分散均勻；B表示经MgSO4溶液聚集的银胶的SEM显微图，从图中可以看出一个个银纳米粒子交联在一起形成立体空间结构，产生了主要的电磁场增强和额外的化学吸附作用，使得吸附在上面的分子产生较强的SERS信号。图3中a表示纯的RNA样品的紫外可见吸收光谱，可以看出RNA在可见光波长范围内有很强的吸收，吸收峰约为四6 nm ；b表示纯银纳米粒子的吸收光谱，吸收峰约为417 nm，和文献中的420 nm非常接近；c表示银胶与RNA混合后的吸收峰，当加入银胶后RNA的吸收峰强度增强，但是银胶的强度有所下降，长波方向并没有出现一个新的等离子共振吸收峰，当滴加微量的MgSO4溶液时，如图中d所示，在长波方向可以看到一个新的等离子共振吸收峰，这个峰大约在753 nm处，这说明加入MgSO4溶液后会使银胶发生强烈的聚集，而且颜色也发生了明显的变化，这也说明加入MgSO4聚集溶液后胶体和样品可能发生更强的化学吸附作用。图4中(2)代表正常人(Normal)的LDA积分，(1)代表结直肠癌患者(Cancer)的 LDA积分，其中正常人只有2个点被判为癌症患者，结直肠癌患者有4个被判为正常人，说明可以较好地区分正常人与结直肠癌患者血液RNA分子。通过上面的分析可以得出这种经MgSO4溶液聚集后银胶对于检测低浓度的大分子 RNA样品具有较高的灵敏度和特异性。所以，我们可以利用表面增强拉曼光谱技术这一高通量方法来定性、定量分析复杂样品中核酸的信息，为进一步的研究打下坚实的基础。
具体实施例方式为了说明本发明在拉曼光谱检测上优势，现结合附图和其它方法的比较来对本发明做进一步的说明。实施例1
1.分别从结肠癌患者及正常人的全血中分离出血清，两小时内必须放到-80°C冰箱保存，以防RNA的裂解，使用Trizol LS reagent从血清中提取RNA，用30μ DEPC水溶解RNA， 放到_80°C冰箱中保存备用，用NanoDrop ND 1000定量RNA，浓度为18. 8到56. 4ng/mL。2.取10 mg的硝酸银溶于50 ml去离子水中，加热至100°C使之沸腾，然后将1 ml 浓度为1%的柠橄酸三钠逐滴加入，并快速搅拌，滴加完后继续保持沸腾6小时得到银溶胶， 银溶胶自然冷却后，用离心机将上述银溶胶以IOOOOrpm离心IOmin使银溶胶分层，将上层清液丢弃，取下层浓缩的银溶胶。3.取5μ1的浓缩后的银溶胶滴到矩形铝片上，然后滴加5μ1的DEPC水，待测样品静置Imin后，采用拉曼光谱进行检测，得到样品本底SERS光谱，作为对照。 4.取5μ1的浓缩后的银溶胶滴到矩形铝片上，然后滴加5μ1的RNA样品，在室温下孵育3 min后，采用拉曼光谱进行检测，得到银胶-RNA样品SERS光谱。5.取5μ1的浓缩后的银溶胶滴到矩形铝片上，待自然凉干后滴加5μ1的RNA样品，在室温下孵育3 min后，采用拉曼光谱进行检测，得到干银胶-RNA样品SERS光谱。6.取5μ1的浓缩后的银溶胶滴到矩形铝片上，然后滴加2μ1的0. 1 M的MgSO4溶液，会看到胶体发生明显的聚集，且胶体的颜色发生显著的变化，待自然凉干后，滴加5μ1 的RNA样品，室温下孵育3 min后，采用拉曼光谱进行检测，得到MgSO4聚集的银胶-RNA样品SERS光谱。7.用正常人和结肠癌症患者血液的RNA样品重复上一步，建立表面增强拉曼光谱数据库，采用主成分分析方法(PCA)和线性判别分析方法(LDA)对所述表面增强拉曼光谱数据库进行统计分析，建立表面增强拉曼光谱分析模型，获得正常人与结肠癌患者血液 RNA样品对应的线性判别分析积分图，从而可区分正常人与结肠癌患者血液RNA的表面增强拉曼光谱，进而区分正常人与结肠癌患者，可应用于开展结肠癌普查。
权利要求
1.一种血液RNA表面增强拉曼光谱检测方法，其特征在于首先从血液中提取RNA分子， 而后制备SERS光谱增强基质银纳米粒子，最后制备出SERS光谱增强基底银纳米薄膜，用于 RNA样品的SERS检测。
2.根据权利要求1所述的一种血液RNA表面增强拉曼光谱检测方法，其特征是从血液中提取RNA分子时，是从人的全血中分离出血清并使用Trizol LS reagent提取RNA样品
3.根据权利要求1所述的一种血液RNA表面增强拉曼光谱检测方法，其特征是所述的 SERS光谱增强基质银纳米粒子的制备时，取10 mg硝酸银溶于50mL去离子水中，加热至 100°C使之沸腾，然后将1 ml浓度为1%的柠橄酸三钠逐滴加入，并快速搅拌，滴加完后继续保持沸腾6小时得到银溶胶溶液；银溶胶溶液自然冷却后，用离心机离心分层，将上层清液丢弃，得到银溶胶浓缩液。
4.根据权利要求1所述的一种血液RNA表面增强拉曼光谱检测方法，其特征是所述的银纳米薄膜过程是(1)取银溶胶浓缩液滴加到矩形铝片上扩散成胶体膜，然后将0.IM的MgSO4溶液滴加到胶体膜上，银溶胶迅速发生聚集，并在室温下自然凉干；(2)用移液枪向胶体膜上滴加RNA样品；(3)室温下孵育3min后再进行SERS光谱检测。
5.根据权利要求1所述的一种血液RNA表面增强拉曼光谱检测方法，其特征是所述的 RNA样品的SERS检测时，使用共聚焦显微拉曼光谱仪测量样品的拉曼光谱。
6.根据权利要求5所述的一种血液RNA表面增强拉曼光谱检测方法，其特征是所述的共聚焦显微拉曼光谱仪测量时，测量条件为激发光波长785 nm，激发光功率为50 %，CCD取谱时间10 s，在20 X物镜下测量样品的拉曼信号，拉曼光谱取谱范围为AOO-lSOOcnr1，对每条光谱的原始数据通过软件进行多项式拟合扣除荧光背景，从而获取SERS光谱。
全文摘要
本发明涉及一种用于RNA表面增强拉曼光谱检测的银纳米薄膜的制备方法，属于医学检测技术领域。该方法是先将血液中的RNA提取出来，通过所制备的银纳米薄膜的作为增强基底，从而获得信号较强，谱峰较多的SERS光谱，充分体现RNA分子的信息。同时，将这种方法制备的增强基底和各种不同的增强基底对比，得出这种增强基底检测RNA分子所获得的信息最多且强度最高，得到高质量的SERS谱图。进而可利用这种高质量的光谱图进行统计分析，得出病人与正常人之间的差异，从而为SERS检测应用于临床诊断打下基础。本发明的优点是需要测量和分析的时间短，样品用量少，检测便捷、准确。
文档编号G01N21/65GK102175664SQ201110039399
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月17日 优先权日2011年2月17日
发明者冯尚源, 席刚琴, 林多, 林筱茜, 陈希文, 陈燕坪, 陈荣 申请人:福建师范大学