专利名称：亚精胺在作为缺氧预适应生物标记物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及亚精胺在作为缺氧预适应生物标记物中的应用，特别涉及检测亚精胺含量的仪器或/和物质在制备鉴定动物或细胞是否处于缺氧预适应状态的产品中的应用。
背景技术：
缺氧作为生命的ー种基本病理生理过程，不同程度地存在于多种疾病中，如短暂性脑缺血、冠心病与心绞痛等心脑血管疾病，哮喘、肺气肿和慢性肺阻塞等肺疾患，癫痫、帕金森病和Alzheimer病等脑退 行性疾患或精神障碍、癌症等，在航天航空、高原或深海作业等过程中也都伴有不同程度的缺氧发作和相应的组织细胞损伤，严重时可导致器官损伤或功能障碍。缺氧预适应则是不同种类需氧生物的ー种生物进化上的内源性细胞保护机制，动物或细胞经过非致死量缺氧后，可对随后出现的严重缺氧产生耐受，从而减轻对动物或细胞的损伤，即产生缺氧预适应的保护作用。其机制可能与内源性保护机制的激活、抗缺氧活性物质的产生等因素有夫。生物标志物是指可供客观测定和评价的ー个普通生理或病理生理或治疗过程中的某种特征性的细胞学、生物化学或分子指标，通过对它的測定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。检查ー种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到帮助作用。寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的ー个重要热点。生物标志物是生物体受到严重损害时，在不同化学和生物学水平(分子、细胞和个体等)上因受内外环境影响而产生的特异性信号指标。它可以对严重毒性伤害和疾病提供早期警报。这种信号指标可以是细胞分子结构和功能的变化，可以是某一生化代谢过程的变化或生成异常的代谢产物或其含量，可以是某一生理活动或某一生理活性物质的异常表现，也可以是个体表现出的异常现象。如果能够掲示出缺氧预适应的生物标志物，将对更加深入的了解缺氧预适应的机制以及在临床上对相关疾病做出提前诊断和治疗具有很大的帮助。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测亚精胺含量的仪器或/和物质的新用途。本发明所提供的检测亚精胺含量的仪器或/和物质的新用途具体为用于检测如下I)-4)中任一所述的仪器或/和物质在制备鉴定或辅助鉴定动物或细胞是否处于缺氧预适应状态的产品中的应用I)亚精胺、肌酸和缬氨酸的含量；2)亚精胺和肌酸的含量；3)亚精胺和缬氨酸的含量；4)亚精胺的含量。在本发明中，所述缺氧预适应是指动物或细胞经过非致死性缺氧后，对再次遭遇的缺氧产生耐受，从而减轻缺氧对动物或细胞的损伤；所述耐受具体可体现为对相同的缺氧状态的耐受时间延长。本发明中，所述仪器为色谱质谱联用仪(液相色谱质谱联用仪)；所述物质可为任何可用于检测亚精胺、肌酸和缬氨酸这三种物质中任一种的物质或同时检测这三种物质。所述色谱质谱联用仪中的色谱仪可为高效液相色谱仪；在本发明的一个实施例中，具体为Agilent HPllOO型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；所述质谱仪具体为LCQDeca XP离子讲质谱仪(美国Thermo Finnigan公司)。
本发明的再ー个目的是提供鉴定或辅助鉴定动物或细胞是否处于缺氧预适应状态的广品。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定动物或细胞是否处于缺氧预适应状态的产品具体为用于检测如下1)-4)中任一所述的仪器或/和物质I)亚精胺、肌酸和缬氨酸的含量；2)亚精胺和肌酸的含量；3)亚精胺和缬氨酸的含量；4)亚精胺的含量。本发明中，所述仪器为色谱质谱联用仪(液相色谱质谱联用仪)；所述物质可为任何可用于检测亚精胺、肌酸和缬氨酸这三种物质中任一种的物质或同时检测这三种物质。所述色谱质谱联用仪中的色谱仪可为高效液相色谱仪；在本发明的一个实施例中，具体为Agilent HPllOO型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；所述质谱仪具体为LCQDeca XP离子讲质谱仪(美国Thermo Finnigan公司)。在实际应用中，为了提高检测结果的准确率，也可以将本发明的方法配合其他检测手段一同使用。本发明的实施例具体选择小鼠(如ICR小鼠)作为所述动物，用于检测亚精胺、肌酸和缬氨酸的含量，检测部位具体为所述动物(如小鼠)的脑组织。本发明利用高效液相色谱的高分离能力和质谱的高灵敏度检测能力对提取液进行全面分析，最終发现亚精胺、肌酸和缬氨酸这三种物质可作为缺氧预适应的标记物。具体表现为，缺氧预适应后(I)亚精胺在脑组织中含量明显增加。(2)肌酸在脑组织中含量明显增加。(3)缬氨酸在脑和心脏中含量升高，缬氨酸作为重要的分解供能氨基酸，这将有利于动物能量的供给和免疫力的增强。缺氧预适应生物标志物的掲示将对更加深入的了解缺氧预适应的机制在临床上对缺氧相关疾病做出早期诊断和干预治疗有很大帮助。
图I为小鼠的缺氧耐受时间与缺氧处理次数之间的关系。图2为在正离子检测模式的ESI电离条件下，脑组织样品的总离子流色谱图。其中，A为空白对照样品(对照组小鼠水提液样品)出为小鼠缺氧耐受的脑组织样品(缺氧6次组小鼠的水提液样品)。图3为对照组小鼠和缺氧6次组小鼠脑组织样品(水提液样品)的得分图。图4为缺氧预适应生物标志物与标准品的色谱图和多级质谱碎片图谱。其中，Al为缴氨酸色谱图；A2为缴氨酸质谱图；B1为肌酸色谱图；B2为肌酸质谱图；C1为亚精胺色谱图；C2为亚精胺质谱图。图5为对照组、缺氧3次和缺氧6次组中缺氧预适应生物标志物在脑中的含量变化。其中，A为缴氨酸；B为肌酸；C为亚精胺。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明 ，均可从商业途径得到。I、仪器和材料LCQ Deca XP离子讲质谱仪(美国Thermo Finnigan公司)，配置有ESI源,离子阱质量分离器，Tune Plus工作软件。Agilent HPllOO型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括G1379A在线脱气机；G1312A双元泵；G1313A自动进样器及Agilent色谱数据化学工作站。色谱柱Waters Symmetry C18 3· 5 μ m(2. ImmX 100mm, i. d. 3· 5 μ m,美国 Waters公司)。千分之ー电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；SIGMA 3K15型低温高速离心机(德国SIGMA公司)；KQ-100E医用超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；T18高速匀浆机(广州仪科实验室技术有限公司);Vortex. Genie2旋涡混合器(美国scientificindustries公司)；lml注射器(上海米沙瓦医科エ业有限公司)；125ml广ロ瓶。2、药品和试剂甲醇为色谱纯(美国Fisher科技公司)，甲酸为色谱纯(北京迪马试剂公司)；流动相用水为娃哈哈饮用纯净水(杭州娃哈哈集団有限公司)，三氯こ酸(北京化学试剂公司)。标准品缬氨酸(批号=140681-200401);肌酸(货号C0780，美国sigma公司)；亚精胺(货号85561,美国sigma公司)。3、实验动物健康雄性ICR小鼠，体重18_22g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(动物号SCXX (京)2006-0009)。实施例I、小鼠缺氧预适应动物模型的获得将ICR小鼠饲养于清洁室内，实验前禁食12小时不禁水。将30只小鼠随机分成3组，分别为对照组、缺氧3次组和缺氧6次组，每组10只。称重后将缺氧3次组和缺氧6次组的小鼠置于125ml的广ロ瓶中，将瓶ロ用涂有凡士林的橡胶塞塞紧密封，开始计时(缺氧耐受时间的起点)并观察小鼠的反应。当小鼠出现喘呼吸现象时，记录时间(缺氧耐受时间的终点)。立即将小鼠取出放入另ー个充满新鲜空气的125ml广ロ瓶中后，立即将瓶ロ用涂有凡士林的橡胶塞塞紧密封，重新开始下一轮计时，记录该次缺氧处理的缺氧耐受时间。共重复缺氧处理3次或6次。小鼠在缺氧3次或6次后立即断头处死，然后在冰上迅速取出小鼠的脑组织和心脏组织，用滤纸将血迹吸干，放到液氮中保存待用。而对照组小鼠不进行缺氧处理，直接断头处死，在冰上迅速取出小鼠的脑组织和心脏组织，用滤纸将血迹吸干，放到液氮中保存待用。
对缺氧6次组小鼠的缺氧耐受时间与缺氧处理次数之间的关系进行分析，得到如图I所示的小鼠缺氧耐受时间曲线，从中可以看出小鼠缺氧耐受时间随着缺氧预适应次数的增多而大幅延长，从缺氧第I次的大约15min到缺氧第6次能够延长到约80-90分钟，可见，小鼠对缺氧产生了一定的适应性，即处于缺氧预适应状态。实施例2、缺氧预适应生物标记物的发现一、脑组织和心脏样品的处理及质控样品的设置
1、脑组织和心脏组织样品的处理代谢组学样品处理，遵循尽可能保留所有代谢物信息的原则，本实施例中为了使得到的代谢物信息更加全面，采取了两步提取法。先用水提取，再用80%甲醇提取，提取液供之后分别进行检测和数据统计分析用。具体操作如下将实施例I获得的脑组织和心脏组织从液氮中取出置于冰上，称重，按照每克组织5ml的用量，分别加入冰冷的O. lmol/L的三氯こ酸溶液，在冰浴环境下匀浆(18000rpm，30s)。之后在4°C离心20min，转速为13000rpm。取上清液，用O. 22 μ m的滤膜过滤，得到脑组织和心脏组织的水提液样品。两个样品均保存在4°C冰箱中待測。将经上述水提后残余的脑组织和心脏组织分别称重，按照每克组织5ml的用量，用80% (v/v)甲醇充分混勻，fC, 13000rpm离心20min。取上清液,用O. 22 μ m的滤膜过滤，得到脑组织和心脏组织的醇提液样品。两个样品保存在4°C冰箱中待測。2、质控样品的设置上述步骤I中四个样品的质控(QC)样品均为对应的对照组小鼠样品和对应的缺氧6次组小鼠样品共20份，从每个样品中取100 μ I混合作为QC样品。ニ、对步骤一的样品进行LC-MS分析对步骤一获得的三个样品进行LC-MS分析及相关数据处理I、色谱条件和质谱条件色谱条件Agilent HP1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司),Waters Symmetry C18 色谱柱(2. ImmX 100mm, i. d. 3· 5 μ m,美国 Waters 公司)，柱温为室温,流动相为含O. 05% (v/v)甲酸的甲醇-水，采用线性梯度洗脱(甲醇和水的体积比从5 95至95 5)，流速为O. 2ml/min,时间为20min，进样量为10 μ I。每次进样前用初始流动相(甲醇和水的体积比为5 95，且含有体积百分含量为O. 05%的甲酸)，平衡15min。在进样前将相应的QC样品连续进样3次，之后每5个样品进一次QC样品。质谱条件LCQ Deca XP离子讲质谱仪(美国Thermo Finnigan公司),电喷雾离子化(ESI)源；正离子扫描方式。鞘气和辅助气均为氮气，分别设为60psi和5psi ;喷雾电压5kV;毛细管电压28V;离子传输管温度350°C。其他參数由仪器自动优化进行设置。质量扫描范围为O-lOOOm/ζ，采用全扫描ー级质谱方式进行測定。在正离子检测模式的ESI电离条件下，缺氧6次组小鼠和对照组小鼠的脑组织水提液样品的总离子流色谱图(total ion mass chromatograms, TICs)如图2所示。2、数据处理(I)数据的预处理通过上述步骤I的LC-MS分析后,用Xalibur软件将原始数据文件(· raw格式)转换为netCDF格式。将其导入至开源数据处理软件XCMS中进行峰识别、保留时间的非线性拟合、峰滤过与峰对齐等预处理。最终获得3个參数指标(包括质荷比(m/z)、保留时间(Retention time)和峰面积)的ニ维数据阵。结果显示，以对照组小鼠和缺氧6次组小鼠为研究对象，用XCMS软件对数据进行预处理后，从脑组织水提液样品和脑组织醇提液样品数据中分别获得393和423个变量，其中脑组织水提液样品和脑组织醇提液样品P < O. 05的变量分别有106和81个。(2)多变量统计分析对上述步骤⑴获得的脑组织水提液样品和脑组织醇提液样品P < O. 05的变量进行多变量统计分析，将数据导入SIMCA-P (Versionl2. O, Umetrics AB,Umea, Sweden)软件。
由于获得原始数据阵后要对获得的数据进行中心化(centering)，而每种数据标度化方法均具有各自的优缺点，因此在选择标度化(scaling)方法时，应综合考虑以下三个因素需要解决的生物学问题、数据矩阵的特性以及采用的数据分析方法。本研究选择了帕累托标度化(pareto scaling)方法，该方法既可避免将噪音选为差异变量，又可避免丢失重要且丰度较小的差异变量。首先将QC样品数据和待测样品数据放在一起，采用主成分分析(Principalcomponent analysis, PCA)方法,进行无监瞀的数据分析,观察各组数据的聚类情况并且去除异常点。然后选用偏最小ニ乘判别分析(Partial least squares discriminateanalysis, PLS-DA)，对待测样品进行有监瞀的数据分析。经PCA分析和PLS-DA分析得到对照组小鼠和缺氧6次组小鼠脑组织水提液样品的得分图，如图3所示。从得分图中可以看到，QC样品分布集中，表明检测体系稳定、数据可靠。所有样品的得分图中对照组和缺氧6次组均明显分为两簇，说明对照组和缺氧6次组之间的物质含量存在明显的差别。经PLS-DA分析之后，SIMCA-P 返回各变量的 VIP (Variable Importance Plot)值，通常认为，其变量的VIP值大于I. O被认为该变量对该模型有较大影响，即对各组间的差异贡献较大。本研究中将VIP大于I的变量作为可能的缺氧预适应生物标志物。结果显示，以对照组小鼠和缺氧6次组小鼠脑样品为研究对象，通过分析得到VIP大于I的变量分别有46个和33个。3、生物标记物的结构鉴定与表征对上述步骤2获得的VIP大于I的变量(潜在的缺氧预适应生物标志物)进行结构鉴定。具体如下首先，通过LC-MS对潜在缺氧预适应生物标志物进行不同轰击能量下的多级MS检测，获得相关的MS/MS图谱。其色谱条件和质谱条件如下色谱条件Agilent HP1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司),Waters Symmetry C18 色谱柱(2. ImmX 100mm, i. d. 3· 5 μ m,美国 Waters 公司)，柱温为室温,流动相为含0.05% (v/v)甲酸的甲醇-水，采用线性梯度洗脱(甲醇和水的体积比从5 95至95 5)，流速为0. 2ml/min,时间为20min，进样量为10 μ I。每次进样前用初始流动相(甲醇和水的体积比为5 95，且含有体积百分含量为0.05%的甲酸)，平衡15min。在进样前将相应的QC样品连续进样3次，之后每5个样品进一次QC样品。质谱条件LCQ Deca XP离子讲质谱仪(美国Thermo Finnigan公司),电喷雾离子化(ESI)源；正离子扫描方式。鞘气和辅助气均为氮气，分别设为60psi和5psi ;喷雾电压5kV;毛细管电压28V;离子传输管温度350°C。其他參数由仪器自动优化进行设置。质量扫描范围为O-lOOOm/ζ，采用全扫描ー级质谱方式进行測定。然后通过HMDB(Human Metabolome Database,http://www. hmdb. ca)和 METLIN数据库(http://metlin. scripps. edu)进行物质结构的检索,利用数据库中提供的精确分子量和上述所得的MS/MS图谱缩小来自内源性的潜在缺氧预适应生物标志物与数据库结构物质的可能范围，提高两者的匹配程度。最終通过购买标准品，用标准品的分子量、色谱保留时间和相应的多级MS裂解谱比对，进行潜在缺氧预适应生物标志物的结构表征和确认。结果如图4所示，其中鉴定表征的3个化合物，即亚精胺、肌酸和缬氨酸的色谱保留时间与标准品的保留时间一致，并且其多级质谱碎片信息与标准品的结构特征相吻合。 将亚精胺、肌酸和缬氨酸这三个物质作为缺氧预适应的生物标志物。实施例3、亚精胺、肌酸和缬氨酸在脑组织中含量变化的检测本实施例以实施例2步骤ー I中获得的对照组、缺氧3次组和缺氧6次组的小鼠脑为实验材料，检测随着缺氧处理次数的増加，亚精胺、肌酸和缬氨酸这三个物质的含量所发生的变化。具体操作如下将对照组、缺氧3次组和缺氧6次组的小鼠的脑组织进行称重，然后按照实施例2-1中的方法，制备得到三组小鼠的脑组织水提液样品作为待测样品(亚精胺、肌酸和缬氨酸存在于脑组织水提液中)。将亚精胺、肌酸和缬氨酸标准品稀释成系列浓度，进行LC-MS分析，同时将上述获得的3份水提液样品也进行LC-MS分析，色谱条件和质谱均如下色谱条件Agilent HPllOO型高效液相色谱仪(美国Agilent公司),Waters Symmetry C18 色谱柱(2. ImmX 100mm, i. d. 3· 5 μ m,美国 Waters 公司)，柱温为室温,流动相为含O. 05% (v/v)甲酸的甲醇-水，采用线性梯度洗脱(甲醇和水的体积比从5 95至95 5)，流速为O. 2ml/min,时间为20min，进样量为10 μ I。每次进样前用初始流动相(甲醇和水的体积比为5 95，且含有体积百分含量为O. 05%的甲酸)，平衡15min。在进样前将相应的QC样品连续进样3次，之后每5个样品进一次QC样品。质谱条件LCQ Deca XP离子讲质谱仪(美国Thermo Finnigan公司),电喷雾离子化(ESI)源；正离子扫描方式。鞘气和辅助气均为氮气，分别设为60psi和5psi ;喷雾电压5kV;毛细管电压28V;离子传输管温度350°C。其他參数由仪器自动优化进行设置。质量扫描范围为O-lOOOm/ζ，采用全扫描ー级质谱方式进行測定。然后以得到的亚精胺、肌酸或缬氨酸标准品的峰面积(y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标，用加权最小二乗法进行回归运算，即得各待测物质的线性回归方程。结果如表I所示，在测定浓度范围内各被测物质线性良好。表I缺氧生物标志物的LC-MS数据
权利要求
1.用于检测如下I)-4)中任一所述的仪器或/和物质在制备鉴定或辅助鉴定动物或细胞是否处于缺氧预适应状态的产品中的应用 1)亚精胺、肌酸和缬氨酸的含量； 2)亚精胺和肌酸的含量； 3)亚精胺和缬氨酸的含量； 4)亚精胺的含量。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述仪器为色谱质谱联用仪。
3.鉴定或辅助鉴定动物或细胞是否处于缺氧预适应状态的产品，为用于检测如下I)-4)中任一所述的仪器或/和物质 1)亚精胺、肌酸和缬氨酸的含量； 2)亚精胺和肌酸的含量； 3)亚精胺和缬氨酸的含量； 4)亚精胺的含量。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于所述仪器为色谱质谱联用仪。
全文摘要
本发明公开了亚精胺在作为缺氧预适应生物标记物中的应用。本发明所述应用具体为用于检测如下1)-4)中任一所述的仪器或/和物质在制备鉴定或辅助鉴定动物或动物是否处于缺氧预适应状态的产品中的应用1)亚精胺、肌酸和缬氨酸的含量；2)亚精胺和肌酸的含量；3)亚精胺和缬氨酸的含量；4)亚精胺的含量。实验证明，缺氧预适应后，脑组织中亚精胺、肌酸和缬氨酸的含量明显升高；可见，亚精胺、肌酸和缬氨酸这三种物质可作为缺氧预适应的标记物，缺氧预适应生物标志物的揭示将对更加深入的了解缺氧预适应的机制以及在临床上对缺氧相关疾病做出早期诊断和干预治疗有很大帮助。
文档编号G01N30/72GK102662011SQ20121013512
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月2日 优先权日2012年5月2日
发明者崔灿, 汪明明, 程海婷, 苏甦, 薛明 申请人:首都医科大学