一种带鱼指纹图谱的构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种带鱼指纹图谱的构建方法，将带鱼制备成供试品溶液，经过高效液相色谱仪奋力检测，获得带鱼的指纹图谱；所述方法包括供试品溶液的制备、高效液相色谱测定、标准指纹图谱的确定。本发明利用HPLC色谱法建立了带鱼的指纹图谱，方法性考察表明该方法可靠、重复性较好，符合指纹图谱的要求；本发明检测带鱼产地的方法操作简单、检测效率高、检测结果可靠性好、快速、精确度高，准确率高达92.7%以上。
【专利说明】一种带鱼指纹图谱的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种操作简单、检测效率高、检测结果可靠性好、快速、精确度高基于 高效液相色谱的带鱼指纹图谱的构建方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 带鱼（rricAia/YAs 又称牙带、白带鱼、刀鱼等，属鱼纲S卢形目带鱼科动 物，为暖温性中下层集群洄游鱼类，栖息于水深60-100m泥质海底，以各种鱼类、毛虾和乌 贼等为主要食物，有明显的昼夜垂直移动现象，广泛分布于世界的温、热带海域（以印度洋 和西太平洋居多）。
[0004] 带鱼鱼体显著侧扁，延长成带状，尾细长如鞭，一般体长6(Γ120厘米、体重 20(Γ400克。头窄长而侧扁，前端尖突。两颌牙发达而尖锐。眼大、位较高，眼间隔平坦、中 间微凹。体表光滑，鳞退化成表皮银膜，全身呈富有光泽的银白色，背部及背鳍、胸鳍略显青 灰色。背鳍长，起点于鳃孔后上角沿背部齐长，臀鳍不明显，只有鳍棘刺尖外露。无腹鳍。
[0005] 带鱼肉嫩体肥、味道鲜美，只有中间一条大骨，无其他细刺，食用方便，营养价值 高，是倍受人们喜爱的一种海洋鱼类。具有补虚、解毒、止血等功效，可用于体虚、乳汁分泌 不足、外伤出血等症。同时，从带鱼表皮银膜中提取的咖啡因，可做照相工业和医药工业原 料；提取的6-硫代鸟嘌呤制成药或治急性白血病，胃癌及淋巴肿瘤等，带鱼肉还可制取水 解蛋白注射液。 带鱼是我国四大经济鱼类之一，我国东海、黄海、渤海、南海和北部湾均产，其中以东海 产量最大（70%，2006)，南海产量较少，浙江、山东沿海是产量较多的海区。1990年以前，东 海区最高年产量为52. 8万吨（1974年)，浙江省为34万吨，占东海区的64%，1974年后产 量开始滑坡，全省产量在20-30万吨之间，1989年降至最低，只有19. 5万吨。自1989年开 始，实施产卵带保护区，并开发外海带鱼资源，1995年又开始伏季拖网和帆张网休渔措施， 是90年代以来的带鱼产量增长较快，从1990年24万吨1995年上升到58万吨，超过历史 最高水平，2000年达到65万吨，2010年达118万吨。但是，带鱼产量的增长，并不意味着带 鱼资源的好转，带鱼个体小型化，低龄化严重，冬汛捕捞群体当龄鱼比例从1967年20. 5%， 1982年上升到59. 3%，90年代前期平均为71. 1%，90年代后期达到78. 2%，目前达到82. 3%， 可见带鱼捕捞群体以当龄的捕捞群体为主，带鱼产量的增长靠强化捕捞所得，带鱼资源处 于生长型过度捕捞状态。
[0006] 舟山带鱼，由于其所处海域独特的地理位置和水文环境，鲜度和质地同其他地区 相比独占鳌头，是全国首批海鲜类地理标志证明商标的拥有者。但是，一些不法商贩为牟取 利益，常以其他产地的带鱼冒充舟山带鱼，以次充好，严重损害了消费者利益，破坏了舟山 海鲜的商誉。
[0007] 于1997年9月发表水产学报第21卷第3期中有一篇关于东海带鱼种群鉴别研究 的报道，通过对取样于东海不同海区29批2168尾带鱼鱼体的各项形态性状的观察、计测、 并应用数学方法对性状差异进行统计比较和群体间聚类分析，结合有关资料进行综合分 析。结果表明：东海带鱼，不论近海或外海的群体，相互间的形态特征基本酷似，呈现出密切 的关系，从而确认它们为同一种群。这种方法来检测带鱼产地或者带鱼种群时间花费过久。 [0008]
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于为了解决现有带鱼产地难确定、没有一种快速有效检测带鱼产 地方法的缺陷而提供一种操作简单、检测效率高、检测结果可靠性好、快速、精确度高基于 高效液相色谱法的带鱼指纹图谱的构建方法。
[0010] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种带鱼指纹图谱的构建方法，将带鱼制备成供试品溶液，经过高效液相色谱仪奋力 检测，获得带鱼的指纹图谱； 所述方法包括如下步骤： a) 供试品溶液的制备：取不同产地的带鱼样品，以提取溶剂回流提取，离心，取上清液 加在碱性氧化铝层析柱上，收集过柱液，再以水洗脱，合并过柱液及水洗脱液，过滤，作为供 试品溶液； b) 高效液相色谱测定：吸取步骤a)得到的供试品溶液至高效液相色谱仪测定，得到不 同产地的带鱼指纹图谱； c) 标准指纹图谱的确定：测定了 5个不同产地的带鱼共28个带鱼样品高效液相色谱 指纹图谱并进行比较，得到由其共有峰构成的带鱼样品高效液相色谱指纹图谱，该指纹图 谱具有的共有特征峰有13个与7个特征峰。
[0011] 在本技术方案中，水产品的营养成分及含量与特定的水生环境密切相关，品种相 同的产品可能产地不同，对不同产地产品特征因子进行分析，有利于原产地产品特色的形 成，并进一步制定相应的保护措施。文献中报道较多的是利用高效液相色谱法（HPLC)技术 对中药产地和真伪进行研究，中药指纹图谱是现代中药质量控制和品质鉴定的新技术，为 样品质量评价问题和产地归属问题提供了新的方法和思路，而利用高效液相色谱法对水产 品指纹图谱研究较少。
[0012] HPLC色谱法分离度高，能把复杂的化学成分进行分离并进行分析，这些高低不同 的色谱峰包含着众多的信息，出峰的位置及高度（或峰面积）分别代表着特定化学物质及 其含量的多少，故而整个色谱图可表征该样品所含有化学成分的多少及含量的大小。
[0013] 分别把各产地带鱼HPLC色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版 (2004)(国家药典委员会），建立各产地带鱼HPLC指纹图谱共有模式。根据相似度评价，得 到各产地带鱼HPLC参考指纹图谱，确立了 13个共有峰和7个特征峰，通过各产地带鱼主要 共有峰相对保留时间及相对峰面积的比较，发现样品间相对保留时间差异较小，而相对峰 面积有着显著差异，说明了各产地带鱼含有物质至少有13种以上相同，但是化学成分含量 因海域不同存在着差异。
[0014] 作为优选，步骤a)中带鱼样品选择体表富有光泽、腮呈鲜红、粘液透明、眼球饱满、 角膜清晰的带鱼，取1. 5-5. 0g带鱼背部肌肉样品在0到-10°c下干燥12-18h，备用；然后加 入5-6倍带鱼质量的去离子水搅拌均与得到带鱼肉浆，用带鱼质量的0. 36-0. 97%的内切蛋 白酶与鱼肉浆质量的0. 2-0. 33%的壳聚糖，35-40°C下搅拌30-240min，pH为5. 5-8. 5 ;搅拌 结束后，调节pH至10-11. 2,保持30-45min后将pH调节至中性，然后4000rpm下离心，取上 清液，将上清液完全干燥后得到带鱼样品固体，将带鱼样品固体加入至提取溶剂中回流提 取，离心，取上清液加在碱性氧化铝层析柱上，收集过柱液，再以水洗脱，合并过柱液及水洗 脱液，过滤，作为供试品溶液。
[0015] 在本技术方案中，在带鱼样品用提取溶剂提取前，先对带鱼进行内切蛋白酶酶解， 使得在后续提取工艺中可以更快速的将需要的成分提取出来，以便在高效液相色谱分析 时，得到更准确的数据与指纹图谱。
[0016] 作为优选，提取溶剂为无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿中的一种。
[0017] 作为优选，高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18柱， 5 μ m，4. 6 mmX 250 mm ;流动相：A相为0. 05-0. 07%的乙酸丁酯或0. 2-0. 5%的乙二醇，B相为 0· 2-0. 5%磷酸二氢钾溶液；检测波长210-320nm，柱温为38-40°C，流速：1. 1-1. 5mL/min。
[0018] 作为优选，内切蛋白酶为木瓜蛋白酶、Neutrase或Alcalase。
[0019] 作为优选，步骤a)中过滤的孔径为0· 22-0. 43 μ m。
[0020] 作为优选，步骤a)中，带鱼样品与提取溶剂的料液比为1 :50_150。
[0021] 作为优选，带鱼的产地为舟山、大连、青岛、漳州、印度洋。
[0022] 本发明的有益效果： 1) 本发明利用HPLC色谱法建立了带鱼的指纹图谱，方法性考察表明该方法可靠、重复 性较好，符合指纹图谱的要求； 2) 本发明检测带鱼产地的方法操作简单、检测效率高、检测结果可靠性好、快速、精确 度高，准确率高达92. 7%以上。
[0023]
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1是实施例1同一份带鱼的HPLC指纹图谱。
[0025] 图2是实施例2的HPLC指纹图谱。
[0026] 图3是不同产地带鱼样品HPLC指纹图谱的聚类结果。
[0027]
【具体实施方式】
[0028] 以下通过具体实施例，对本发明做进一步的解释： 本发明中，若非特指，所采用的原料均可从市场购得或是本领域常用的，下述实施例中 的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0029] 构建不同产地带鱼标准指纹图谱的来源见下表。
[0030] 表1、不同产地带鱼样品来源
【权利要求】
1. 一种带鱼指纹图谱的构建方法，其特征在于，将带鱼制备成供试品溶液，经过高效液 相色谱仪奋力检测，获得带鱼的指纹图谱； 所述方法包括如下步骤： a) 供试品溶液的制备：取不同产地的带鱼样品，以提取溶剂回流提取，离心，取上清液 加在碱性氧化铝层析柱上，收集过柱液，再以水洗脱，合并过柱液及水洗脱液，过滤，作为供 试品溶液； b) 高效液相色谱测定：吸取步骤a)得到的供试品溶液至高效液相色谱仪测定，得到不 同产地的带鱼指纹图谱； c) 标准指纹图谱的确定：测定了 5个不同产地的带鱼共28个带鱼样品高效液相色谱 指纹图谱并进行比较，得到由其共有峰构成的带鱼样品高效液相色谱指纹图谱，该指纹图 谱具有的共有特征峰有13个与7个特征峰。
2. 根据权利要求1所述的一种带鱼指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤a)中带鱼 样品选择体表富有光泽、腮呈鲜红、粘液透明、眼球饱满、角膜清晰的带鱼，取1. 5-5. Og带 鱼背部肌肉样品在0到-l〇°C下干燥12-18h，备用；然后加入5-6倍带鱼质量的去离子水搅 拌均与得到带鱼肉浆，用带鱼质量的〇. 36-0. 97%的内切蛋白酶与鱼肉浆质量的0. 2-0. 33% 的壳聚糖，35-401：下搅拌30-2401^11，？!1为5.5-8.5;搅拌结束后，调节？!1至10-11.2，保 持30-45min后将pH调节至中性，然后4000rpm下离心，取上清液，将上清液完全干燥后得 到带鱼样品固体，将带鱼样品固体加入至提取溶剂中回流提取，离心，取上清液加在碱性氧 化铝层析柱上，收集过柱液，再以水洗脱，合并过柱液及水洗脱液，过滤，作为供试品溶液。
3. 根据权利要求1或2所述的一种带鱼指纹图谱的构建方法，其特征在于，提取溶剂为 无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿中的一种。
4. 根据权利要求1所述的一种带鱼指纹图谱的构建方法，其特征在于，高效液相色谱 仪的色谱条件为：色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18柱，5 μ m，4. 6 mmX 250 mm ;流动相：A相 为0. 05-0. 07%的乙酸丁酯或0. 2-0. 5%的乙二醇，B相为0. 2%磷酸二氢钾溶液；检测波长 210-320nm，柱温为 38-40 °C，流速：1· 1-1. 5mL/min。
5. 根据权利要求2所述的一种带鱼指纹图谱的构建方法，其特征在于，内切蛋白酶为 木瓜蛋白酶、Neutrase或Alcalase。
6. 根据权利要求1所述的一种带鱼指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤a)中过滤 的孔径为〇· 22-0. 43 μ m。
7. 根据权利要求1所述的一种带鱼指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤a)中，带鱼 样品与提取溶剂的料液比为1 :50_150。
8. 根据权利要求1或2或4或5或6或7所述的一种带鱼指纹图谱的构建方法，其特 征在于，带鱼的产地为舟山、大连、青岛、漳州、印度洋。
【文档编号】G01N30/02GK104101659SQ201410187249
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】周宇芳, 郑斌, 肖金星, 相兴伟, 杨会成, 孟志娟, 徐珊 申请人:浙江省海洋开发研究院