一种普洱茶提取物HPLC指纹图谱的建立及检测方法与流程

本发明涉及植物检测领域，尤其是涉及普洱茶的检测和指纹图谱的建立。

背景技术：

中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。

目前，指纹图谱技术也已进入茶叶相关研究领域，茶叶科研人员借鉴用于鉴别中药真伪和质量控制的指纹图谱技术，将茶叶样品经过适当处理后，利用气相色谱(GC)、高相液相色谱(HPLC)、红外及近红外光谱(IR&NIR)、核磁共振(NMR)等的技术，得到能够标示茶叶特征成分的谱图；在此基础上运用主成分分析法(PCA)、聚类分析法(Classification Analysis)、人工神经网络(BP)等的数据信息处理技术对所得茶叶指纹图谱进行分析，从而对茶叶品质做出可量化的评价，有效弥补了感官审评的缺陷。

需要建立一种普洱茶提取物的指纹图谱，以便对普洱茶提取物进行质量监控和辨别。

技术实现要素：

本发明提供了一种HPLC测定普洱茶提取物中有效成分的方法。

本发明还提供了一种普洱茶提取物指纹图谱的建立方法。

本发明提供的普洱茶提取物HPLC有效成分测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

分别称取表没食子酸儿茶素，儿茶素，表儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯，加甲醇-水，得到含表没食子酸儿茶素，儿茶素，表儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的混合对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备

取普洱茶提取物，加入纯水，室温下超声使普洱茶提取物完全溶解，过滤膜，即得供试品溶液。

(3)测定法：

吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中相应成分的含量。

根据本发明，超高效液相色谱仪的色谱条件如下：

色谱柱选自：C18柱，

流动相：A相为乙腈，B相为0.01％-0.1％磷酸水溶液，进行梯度洗脱，流动相的流速为0.8-1.2mL/min，柱温25-35℃，

检测波长：200-220nm。

本发明所述的普洱茶提取物，可以按照现有技术制备，为了更好的发挥本发明的疗效，本发明的普洱茶提取物是按照专利公开号CN101961061A、CN101961061B、CN101961425A、CN101961425B、CN101961060A、CN101961059A、CN101961059B制备。例如，可按照如下制备方法进行制备：

步骤1，普洱茶叶加水煎煮提取2-4次，每次0.5～2小时，6-12倍体积的水；提取液过滤，滤液在≤70℃条件下减压浓缩至茶叶重量：浓缩液体积＝1：2-1：3，

步骤2，浓缩液用离心机离心，离心液减压浓缩至45-65℃比重1.1—1.25，浓缩膏喷雾干燥或微波干燥，即得。

根据本发明的实施方式之一，步骤(1)中甲醇-水的体积比为1:1，混合对照品溶液中表没食子酸儿茶素，儿茶素，表儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的浓度范围分别为0.25-0.75mg/ml，0.076mg/ml-0.38mg/ml，0.076mg/ml-0.38mg/ml，0.2mg/ml-1.0mg/ml，0.1mg/ml-0.5mg/ml。

本发明的普洱茶提取物，可以提取自普洱生茶或普洱熟茶，优选自如下几种来源：(1)云南普洱茶生态茶园优质普洱茶原料(特有叶组拼配)；(2)普洱市高海拔生态茶园种植大叶普洱茶原料(科学配比不同茶山、不同季节、不同质级的大叶种普洱茶)；以及(3)百年以上、经自然陈化4年以上的普洱茶古树茶原料。普洱茶原料各5个批次进行混合，制备得到普洱茶提取物样品。

根据本发明的实施方式之一，流动相A相为乙腈，B相为0.05％磷酸水溶液，梯度程序如下：

每次进下一样品之前，可以用2％A相、98％B相平衡色谱柱15min。

根据本发明，步骤(3)中，溶液的进样量为10μL。流动相的流速为1.0mL/min，柱温30℃。

优选地，本发明最佳检测波长为210nm。普洱茶中主要成分儿茶素的最大吸收波长278nm，但是经过研究，发现在210nm处，可以获得更全面的色谱峰，且色谱峰紫外吸收较大，基线较为平稳，故优选的检测波长确定为210nm。

另，本发明流动相A选择乙腈而不选择甲醇，是因为甲醇截止波长为205nm，乙腈截止波长为190nm，本发明的最佳检测波长为210nm，故选择乙腈可以保证基线稳定。流动相B选择含有0.05％磷酸的水，而不是其它的酸，例如乙酸，是因为在紫外波长范围内，磷酸的紫外吸收干扰比乙酸弱。若用210nm低波长，最好用磷酸，乙酸在220nm左右有吸收，会 干扰吸收峰。

采用本发明所提供的方法得到的指纹图谱有11个主要特征峰，保留时间分别为：11.5±0.2min，13.2±0.2min，18.3±0.2min，24.9±0.2min，27.0±0.2min，29.3±0.2min，32.5±0.2min，34.3±0.2min，37.1±0.2min，43.1±0.2min，44.6±0.2min。(参见图1)采用本发明所提供的方法得到的指纹图谱，其11个主要特征峰均可以得到很好地分离。

本发明还提供了一种普洱茶提取物HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

分别取表没食子酸儿茶素，儿茶素，表儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯，加体积比为1:1的甲醇-水，得到含表没食子酸儿茶素，儿茶素，表儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的混合对照品储备液，表没食子酸儿茶素，儿茶素，表儿茶素，表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的浓度分别0.3mg/ml，0.152mg/ml，0.152mg/ml，0.4mg/ml和0.2mg/ml。

(2)供试品溶液的制备

取云南普洱茶生态茶园优质普洱茶原料、普洱市高海拔生态茶园种植大叶普洱茶原料以及百年以上、经自然陈化4年以上的普洱茶古树茶原料，各5个批次进行混合，制备得到普洱茶提取物供试品，称取0.15g，置50ml容量瓶中，加入超纯水，搅拌、室温下超声使普洱茶提取物完全溶解，定容，摇匀，过0.45μm滤膜，即得供试品溶液。

(3)获得色谱图

以对照品溶液作为参照物，将供试品溶液和对照品溶液注入超高效液相色谱仪，得到色谱图，

其中，超高效液相色谱仪的色谱条件如下：

色谱柱选自：C18柱，规格250mm×4.6mm，

流动相：流动相A相为乙腈，B相为0.05％磷酸水溶液，梯度程序如下：

每次进下一样品之前，用2％A相、98％B相平衡色谱柱15min；溶液的进样量为10μL，流动相的流速为1.0mL/min，柱温30℃，

检测波长：210nm。

(4)生成指纹图谱：

样品分析后，对色谱图进行积分处理，调整积分参数，去除咖啡碱峰，即得到每个样品的待分析图谱，其中11个主要特征峰的保留时间分别为11.5±0.2min，13.2±0.2min，18.3±0.2min，24.9±0.2min，27.0±0.2min，29.3±0.2min，32.5±0.2min，34.3±0.2min，37.1±0.2min，43.1±0.2min，44.6±0.2min。

本发明的普洱茶提取物HPLC指纹图谱的建立及检测方法，更具体地可以包括如下步骤：

1、建立普洱茶提取物HPLC标准指纹图谱；

2、建立待测普洱茶样品的HPLC指纹图谱；

3、将待测普洱茶样品的HPLC指纹图谱与普洱茶提取物标准指纹图谱进行对比，判断二者的相似度。

其中，步骤1，建立普洱茶提取物HPLC标准指纹图谱，具体方法为：

A、样品的选择：分别选用上述三种来源的普洱茶原料各5个批次进行混合，来制备得到普洱茶提取物样品。

B、样品处理：取上述普洱茶提取物样品，称取0.1500g，置50ml容量瓶中，加入超纯水，搅拌、室温下超声使普洱茶提取物完全溶解，定容，摇匀，过0.45μm滤膜，作为供试品溶液。

C、将供试品溶液注入高效液相色谱，其中，色谱条件如下：

色谱柱：Synergi 4u Hydro-RP 80A C18柱(250mm×4.6mm ID,Phenomenex)；

流动相：A:乙腈－B:水(含0.05％磷酸)；

梯度洗脱：0→50min，2％A：98％B→25％A：75％B；

50→55min，25％A：75％B→2％A：98％B；

进下一样之前2％A：98％B平衡色谱柱15min；

检测波长：210nm；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样量：10μL。

D、数据分析并获得本发明普洱茶提取物的HPLC标准指纹图谱。

其中数据分析为：样品分析后，对色谱图进行积分处理，调整积分参数，去除咖啡碱峰，既得本发明普洱茶提取物的HPLC标准指纹图谱。参见图1。本发明普洱茶提取物的HPLC指纹图谱具有如下11个主要特征峰，保留时间分别为：11.5±0.2min，13.2±0.2min，18.3±0.2min，24.9±0.2min，27.0±0.2min，29.3±0.2min，32.5±0.2min，34.3±0.2min，37.1±0.2min，43.1±0.2min，44.6±0.2min。

其中，步骤2，建立待测茶叶HPLC指纹图谱：以与步骤1相同的方法及色谱条件进行待测普洱茶样品的处理以及HPLC谱图的采集，得到待测普洱茶样品的HPLC指纹图谱。(参见图1)

其中，步骤3，将待测普洱茶样品的HPLC指纹图谱进行积分处理，调整积分参数，去除咖啡碱峰，积分后色谱图以AIA格式导出，导出数据导入到国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)，以普洱茶标准指纹图谱为参照，进行相似度分析。

其中，当待测普洱茶样品的HPLC指纹图谱与普洱茶提取物标准指纹图谱进行对比，相似度大于0.9时，可判断为同一产品，或同一产品不同批次之间质量稳定。否则，为其它普洱茶产品，或本批次产品质量不合格。

本发明的方法是经过验证的。

方法学验证

1稳定性实验

取本发明普洱茶提取物样品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，置于室温下，分别在0，2，4，6，12，24h检测指纹图谱，结果参见图1，显示本发明普洱茶提取物中主要成分：表没食子酸儿茶素(EGC，峰4)，儿茶素(C，峰5)，表儿茶素(EC，峰7)，表没食子儿茶素没食 子酸酯(EGCG，峰8)和表儿茶素没食子酸酯(ECG，峰10)峰面积的RSD分别为0.91％，1.22％，0.91％，0.99％和0.60％，保留时间的RSD分别为0.19％，0.22％，0.20％，0.21％和0.14％，结果参见图2，表明供试液在24h内测定的指纹图谱是稳定的。

同时将24h稳定性考察的色谱峰进行相似度比较，表1同样表明普洱茶提取物样品溶液在室温下24h内测定指纹图谱是稳定的。

表1普洱茶提取物相似度结果

2重复性实验

取普洱茶提取物样品，按供试品溶液制备方法制备试品溶液，制备5份平行供试品溶液，检测指纹图谱，结果显示普洱茶提取物中主要成分EGC(峰4)，C(峰5)，EC(峰7)，EGCG(峰8)和ECG(峰10)峰面积的RSD分别为0.68％，1.06％，0.85％，1.05％和0.43％，保留时间的RSD分别为0.10％，0.10％，0.13％，0.10％和0.08％，结果参见图3，表明供试液日内重复指纹图谱是稳定的。

同时将日内重复性考察的色谱峰进行相似度比较，表2同样表明普洱茶提取物样品溶液日内测定指纹图谱是稳定的。

表2普洱茶提取物日内稳定性相似度结果

取普洱茶提取物样品，按供试品溶液制备方法制备试品溶液，连续5天，每天制备一份平行供试品溶液，检测指纹图谱结果显示普洱茶提取物中主要成分EGC(峰4)，C(峰5)，EC(峰7)，EGCG(峰8)和ECG(峰10)峰面积的RSD分别为1.66％，1.73％，3.46％，1.40％和1.02％，保留时间的RSD分别为0.36％，0.19％，0.21％，0.17％和0.23％，结果参见图4，表明供试液日间重复指纹图谱是稳定的。

同时将日间重复性考察的色谱峰进行相似度比较，表3同样表明甘醇样品溶液日间测定指纹图谱是稳定的。

表3普洱茶提取物日间稳定性相似度结果

本发明采用HPLC技术建立普洱茶提取物指纹图谱，来比较每批次生产普洱茶提取物与标准提取物的相似度，同时与市场上存在的竞品普洱茶产品进行比较，以建立普洱茶提取物质量监控、竞品辨别方法。

本发明的有益效果：

普洱茶提取物为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，本发明建立的普洱茶提取物HPLC指纹图谱能较为全面地反映普洱茶提取物中所含化学成分的种类与数量，进而对产品的稳定性及质量进行监控，另外，也可与市场上存在的其他同类产品进行判别，方法简便，快速可靠。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面 的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1本发明提供的普洱茶提取物标准指纹图谱；

图2普洱茶提取物稳定性指纹图谱；

图3普洱茶提取物日内重复指纹图谱；

图4普洱茶提取物日间重复性指纹图谱；

图5普洱茶提取物标准指纹图谱与部分不同批次甘醇型普洱茶提取物指纹图谱；

图6普洱茶提取物标准指纹图谱与不同批次清香型普洱茶提取物指纹图谱；

图7普洱茶提取物标准指纹图谱与不同批次古茶型普洱茶提取物指纹图谱；

图8本发明普洱茶提取物标准指纹图谱与不同厂家茶珍指纹图谱。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

实施例1

A、样品的选择：样品的选择：分别选用下述(1)～(3)三种来源的普洱茶原料各5个批次进行混合，并用本发明说明书中公开的普洱茶提取物制备方法制备得到普洱茶提取物，即普洱茶提取物样品。

(1)云南普洱茶生态茶园种植的优质普洱茶原料，特有叶组拼配；(2)普洱市高海拔地区生态茶园种植茶叶为原料，科学配比不同茶山、不同季节、不同质级的大叶种普洱茶；以及(3)百年以上、经自然陈化4年以上的普洱茶古树茶原料。

B、样品处理：取上述得到的普洱茶提取物样品，称取0.1500g，置50ml容量瓶中，加入超纯水，搅拌、室温下超声使普洱茶提取物完全溶解，定 容，摇匀，过0.45μm滤膜，作为供试品溶液。

C、将供试品溶液注入高效液相色谱，其中，色谱条件如下：

色谱柱：Synergi 4u Hydro-RP 80A C18柱(250mm×4.6mm ID,Phenomenex)；

流动相：A:乙腈－B:水(含0.05％磷酸)；

梯度洗脱：0→50min，2％A：98％B→25％A：75％B；

50→55min，25％A：75％B→2％A：98％B；

进下一样之前2％A：98％B平衡色谱柱15min；

检测波长：210nm；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样量：10μL。

D、对色谱图进行积分处理，调整积分参数，去除咖啡碱峰，既得本发明普洱茶提取物的HPLC标准指纹图谱。参见图1。

实施例2

选用云南普洱茶生态茶园种植的优质普洱茶原料，特有叶组拼配，并用本发明说明书中公开的普洱茶提取物制备方法制备普洱茶提取物，即得甘醇型普洱茶提取物。

取43个批次的甘醇型普洱茶提取物，分别为：

甘醇2011I02；甘醇2011J14；甘醇2011J16；甘醇2012B06；甘醇2012C21；甘醇2012E16；甘醇2013H06；甘醇2013I04；甘醇2013L04；甘醇2013L06；甘醇PE2012E09(Z)；甘醇PE2012G02；甘醇PE2013G01；甘醇PE2013G02；甘醇PE2013G03；甘醇PE2013I03；甘醇PE2013I08；甘醇PE2013L02；甘醇PE2013L03；甘醇PE2013L05；甘醇PE2014A01；甘醇PE2014A02；甘醇PE2014A03；甘醇PE2014A03；甘醇PE2014A04；甘醇PE2014A05；甘醇PE2014A06；甘醇PE2014A07；甘醇PE2014A08；甘醇PE2014B04；甘醇PE2014B05；甘醇PE2014B06；甘醇PE2014B07；甘醇PE2014C01；甘醇PE2014C02；甘醇PE2014C03；甘醇PE2014C04；甘醇PE2014C05；甘醇PE2014C07；甘醇PE2014C08；甘醇PE2014C09； 甘醇PE2014C10，云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司质量部提供。

分别称取每个批次的甘醇型普洱茶提取物样品0.1500g，置50ml容量瓶中，加入超纯水，搅拌、室温下超声使普洱茶提取物完全溶解，定容，摇匀，过0.45μm滤膜，作为供试品溶液。

将供试品溶液注入高效液相色谱，其中，色谱条件如下：

色谱柱：Synergi 4u Hydro-RP 80A C18柱(250mm×4.6mm ID,Phenomenex)；

流动相：A:乙腈－B:水(含0.05％磷酸)；

梯度洗脱：0→50min，2％A：98％B→25％A：75％B；

50→55min，25％A：75％B→2％A：98％B；

进下一样之前2％A：98％B平衡色谱柱15min；

检测波长：210nm；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样量：10μL。

每个样品做3个平行实验，检测结果经积分处理(积分中调整积分参数，去除咖啡碱峰)后数据按AIA格式导出，将导出的数据(AIA格式)导入到中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)，以普洱茶提取物标准指纹图谱为参照，对不同批次甘醇普洱茶提取物样品进行相似度分析，分析结果如图5、表4。

表4不同批次甘醇型普洱茶提取物样品相比于普洱茶提取物标准指纹图谱相似度结果

分析结果显示(表4)：除了甘醇2011I02(0.805)、甘醇2012B06(0.606)、甘醇PE2014A06(0.644)、甘醇PE2014C07(0.699)相比于普洱茶提取物标准指纹图谱相似度小于0.900，其余甘醇样品与普洱茶提取物标准指纹图谱相比，相似度均大于0.900(0.904-0.991)，表明公司每批甘醇提取物样品基础物质种类和含量差别小，产品稳定。

实施例3

选用普洱市高海拔地区生态茶园种植茶叶为原料，科学配比不同茶 山、不同季节、不同质级的大叶种普洱茶，并用本发明说明书中公开的普洱茶提取物制备方法制备普洱茶提取物，即得清香型普洱茶提取物。

分别取33个批次的清香型普洱茶提取物，分别为：

清香20100455；清香20100508；清香2011J02；清香2011K09；清香2011L01；清香2012B24；清香2012B40；清香2012B41；清香2012D01；清香2012D05；清香2012E06；清香2013H02；清香2013H03；清香2013I01；清香2013I02；清香2013I05；清香2013I06；清香2013I07；清香2013I09；清香2013I10；清香2013K01；清香20130302；清香PE2013K01；清香PE2013K02；清香PE2013K03；清香PE2013K04；清香PE2013K05；清香PE2014B01；清香PE2014B02；清香PE2014B03；清香PE2014C06；清香PE2014D06；清香PE2014D07，云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司质量部提供。

分别称取每个批次的清香型普洱茶提取物0.1500g，置50ml容量瓶中，加入超纯水，搅拌、室温下超声使普洱茶提取物完全溶解，定容，摇匀，过0.45μm滤膜，作为供试品溶液。

将供试品溶液注入高效液相色谱，其中，色谱条件如下：

色谱柱：Synergi 4u Hydro-RP 80A C18柱(250mm×4.6mm ID,Phenomenex)；

流动相：A:乙腈－B:水(含0.05％磷酸)；

梯度洗脱：0→50min，2％A：98％B→25％A：75％B；

50→55min，25％A：75％B→2％A：98％B；

进下一样之前2％A：98％B平衡色谱柱15min；

检测波长：210nm；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样量：10μL。

每个样品做3个平行实验，检测结果经积分处理(积分中调整积分参数，去除咖啡碱峰)后到出数据AIA格式，将导出的数据(AIA格式)导入到中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)，以普洱茶提取物标准指纹图谱为参照，对不同批次清香型普洱茶提取物进行相似度分析，分 析结果如图6、表5。

表5不同批次清香型普洱茶提取物相比于普洱茶提取物标准指纹图谱相似度结果

分析结果显示(表5)：除了清香20100455、清香2011L01相比于标准指纹图谱相似度小于0.900(20100455为0.899；2011L01为0.649)，其余清香样品与标准指纹图谱相比，相似度均大于0.900(0.903-0.995)，表明公司每批清香型普洱茶提取物基础物质种类和含量差别小，产品稳定。

实施例4

选用百年以上、经自然陈化4年以上的普洱茶古树茶原料，并用本发明说明书中公开的普洱茶提取物制备方法制备普洱茶提取物，即得古茶型普洱茶提取物。

分别取18个批次的古茶型普洱茶提取物，分别为：

古茶100J；古茶1800J；古茶20100129；古茶20100206；古茶20100306；古茶20100405；古茶2011H04；古茶2012C24；古茶2012C26；古茶2012D09；古茶2013H05；古茶2013I01；古茶2013I02；古茶PE2013J01；古茶PE2013K07；古茶PE2013L01；古茶PE2013L07；古茶PE2014D03，云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司质量部提供。

分别称取每个批次的古茶型普洱茶提取物0.1500g，置50ml容量瓶中，加入超纯水，搅拌、室温下超声使普洱茶提取物完全溶解，定容，摇匀，过0.45μm滤膜，作为供试品溶液。

将供试品溶液注入高效液相色谱，其中，色谱条件如下：

色谱柱：Synergi 4u Hydro-RP 80AC18柱(250mm×4.6mm ID,Phenomenex)；

流动相：A:乙腈－B:水(含0.05％磷酸)；

梯度洗脱：0→50min，2％A：98％B→25％A：75％B；

50→55min，25％A：75％B→2％A：98％B；

进下一样之前2％A：98％B平衡色谱柱15min；

检测波长：210nm；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样量：10μL。

每个样品做3个平行实验，检测结果经积分处理(积分中调整积分参数，去除咖啡碱峰)后到出数据AIA格式，将导出的数据(AIA格式)导入到中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)，以普洱茶提取物标准指纹图谱为参照，对不同批次古茶型普洱茶提取物进行相似度分析，分析结果如图7、表6。

表6不同批次古茶型普洱茶提取物相比于普洱茶提取物标准指纹图谱相似度结果

分析结果显示(表6)：除了古茶100J、古茶PE2013J01、古茶PE2013L07、古茶PE2014D03相比于标准指纹图谱相似度小于0.900(0.812-0.894)，其余古茶样品与古茶标准品相比，相似度均大于0.900(0.909-0.993)，表明公司每批古茶茶珍样品基础物质种类和含量差别小，产品稳定。

实施例5

选取20个竞品普洱茶样品，分别为：

佛莲山普洱茶粉普洱天福生物科技发展有限公司；国汉醉爽速溶茶云南、云县国汉生态茶业有限公司；乐淳快时尚即溶茶广东正源华茶生物工程有限公司；科洱健即溶普洱茶珍云南万红扬茶业有限公司；七彩云南醇品普洱茶珍昆明七彩云南沣祥茶业股份有限公司；熟茶普洱茶云南松德生物科技开发有限公司；临毫普洱临沧千年古茶有限公司；精烁普洱茶珍云南龙润茶业贡献公司；和泰之春固态速溶茶贵州和泰春茶叶科技有限公司；版比腊告速溶普洱茶楚雄州百草岭药业发展有限公司； 御香君国风普洱茶膏云南贡润茶业有限公司；国道固态速溶茶(蓝)云南大唐汉方制药有限公司；国道固态速溶茶(金)云南大唐汉方制药有限公司；茶褐素云南、红河唐人生物发展有限公司；八角亭和灵普洱速溶茶珍云南省黎明农工商联合公司茶厂；滇泊洱普洱茶珍云南滇泊洱生物科技有限公司；净末普洱茶珍云南海湾茶叶有限公司；云南大叶乔木古茶粉普洱市思茅区玥树茶庄；龙御轩昆明万维新商务有限公司；宝文堂昆明宝文堂商贸有限公司。

分别称取每个竞品0.1500g，置50ml容量瓶中，加入超纯水，搅拌、室温下超声使普洱茶提取物完全溶解，定容，摇匀，过0.45μm滤膜，作为供试品溶液。

将供试品溶液注入高效液相色谱，其中，色谱条件如下：

色谱柱：Synergi 4u Hydro-RP 80AC18柱(250mm×4.6mm ID,Phenomenex)；

流动相：A:乙腈－B:水(含0.05％磷酸)；

梯度洗脱：0→50min，2％A：98％B→25％A：75％B；

50→55min，25％A：75％B→2％A：98％B；

进下一样之前2％A：98％B平衡色谱柱15min；

检测波长：210nm；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

每个样品做3个平行实验，检测结果经积分处理(积分中调整积分参数，去除咖啡碱峰)后到出数据AIA格式，将导出的数据(AIA格式)导入到中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)。

以本发明普洱茶提取物标准指纹图谱为参照，对不同生产厂家的茶珍样品进行相似度分析，分析结果如图8、表7。

表7不同厂家茶珍相比于本发明普洱茶提取物标准指纹图谱相似度结果

以本发明普洱茶提取物标准指纹图谱为参照，对19个厂家的20个样品进行相似度分析，分析结果显示：19个厂家的20个茶珍样品与本发明普洱茶提取物标准指纹图谱相比，相似度均低于0.800(0.065-0.767)。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。