一种检测人受体酪氨酸激酶的磷酸化抗体芯片试剂盒的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种磷酸化抗体芯片试剂盒，尤其是涉及一种人受体酪氨酸激酶的磷酸化抗体芯片试剂盒。
背景技术：
：蛋白质磷酸化是指细胞内蛋白质在外界信号刺激下、在特定的氨基酸位点上由蛋白激酶催化发生磷酸化发生、而产生磷酸化的蛋白将依次激活下游各级信号分子、通过级联反应最终实现生物学效应。一个蛋白质可以在一个或者多个位点上，由多个蛋白激酶产生磷酸化。细胞膜受体egfr家族包括egfr/erbb1/her1、erbb2/her2、erbb3/her3和erbb4/her4四种不同蛋白。在正常的生理状态下，erbb受体对于调节细胞增殖、分化、运动与凋亡的信号转导起着至关重要的作用。egf受体家族在不同的受体中显示着明显差异，也显示大的交叉性。其中，erbb1在家族成员中最多配偶体，并具有最高比率的结合多个配偶体的受体酪氨酸残基；erbb3特征化为多个磷脂酰肌醇-3-激酶(pi3k)结合位点；erbb2具有很少的关联配偶体，shc是最常的一个；erbb1与erbb4具有结合grb2或grb2和shc多种磷酸受体酪氨酸残基，并显示着比erbb2与erbb3更大范围的配偶体；erbb1与erbb2通常在癌细胞中过表达或放大，使得它们在药物使用或开发中成为重要的目标蛋白。磷酸化的正常与否，也常常预示着细胞信号传导是否出现异常，而异常的传导通路经常又导致一些疾病。因此，对磷酸化的研究呈现出很重要的生物和临床价值。由于磷酸化位点的多样性，如何来快速有效地了解细胞内的磷酸化状态，一直是困扰广大科研工作者的一个难题。在没有抗酪氨酸磷酸化抗体之前，蛋白质和酶的酪氨酸磷酸化只能通过非常危险的并且很费时的放射性实验来检测。而利用抗酪氨酸磷酸化抗体，则可以通过westernblot或其它免疫学方法轻松地检测到磷酸化信号。常规的检测方法包括：用抗酪氨酸磷酸化抗体在westernblot上检测内源或外源表达的磷酸化蛋白。如果目标蛋白的含量较低，也可利用免疫沉淀的方法先富集发生磷酸化的酪氨酸蛋白，再检测目标蛋白的水平。可见，检测受体酪氨酸激酶的磷酸化操作繁琐，成本高；另外，由于科学家研究的通常是采用新的磷酸化位点，而制备蛋白特定位点的磷酸化抗体往往比一般抗体的制备更加费时费力，效果也不好。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种人受体酪氨酸激酶(rtk)的磷酸化抗体芯片试剂盒，该rtk磷酸化抗体芯片试剂盒能够通过一次实验迅速、简捷和准确地测定rtk通路中71个蛋白质的磷酸化情况，通过监测实验模型系统中的蛋白磷酸化变化，便能快速检测到细胞中的途径激活作用，而不需要经过繁琐的免疫沉淀法与印迹法(westernblotting)。本发明所述的检测人受体酪氨酸激酶的磷酸化抗体芯片试剂盒包括：固相载体，为包被特异性抗体的标准膜片或玻片；洗涤液，包括含0.1％吐温20的20x浓缩洗涤液以及其稀释液；样本稀释液；用于稀释抗体和hrp-链亲和素的稀释液；生物素化的检测抗体混合物；300x浓缩荧光素-链亲和素溶液；样本处理液，为2x细胞裂解液；其中，所述特异性抗体是针对选自以下71种蛋白质的抗体：abl1、ack1、alk、ax1、blk、bmx、btk、csk、dtk、egfr、epha1、epha1、epha2、epha3、epha4、epha5、epha6、epha7、epha8、ephb1、ephb2、ephb3、ephb4、ephb6、erbb2、erbb3、erbb4、fak、fer、fgfr1、fgfr2、fgfr2(α型)、fgr、frk、fyn、hck、hgfr、igf-1r、insulinr、itk、jak1、jak2、jak3、lck、ltk、lyn、matk、m-csfr、musk、ngfr、pdgfr-a、pdgfr-b、pyk2、ret、ror1、ror2、ros、ryk、scfr、srms、syk、tec、tie-1、tie-2、tnk1、trkb、txk、tyk2、tyro10、vegfr2、vegfr3、zap70。根据本发明所述的检测人受体酪氨酸激酶的磷酸化抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述固相载体为多孔纤维膜，选自：硝酸纤维素膜、纤维过滤膜、聚偏氟乙烯膜(pvdf)或者尼龙膜。优选地，所述多孔膜是0.05至0.1％的表面活性剂或者在强氧化条件下形成亲水基团后在20至26℃，40％湿度条件下与特异性抗体紧密结合的。更优选地，所述多孔膜是经过非离子表面活性剂处理的pvdf膜。根据本发明所述的检测人受体酪氨酸激酶的磷酸化抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述固相载体为玻片。优选地，所述玻片是通过戊二醛或多聚赖氨酸、烷基糖苷或者apes粘附剂处理后在20至26℃条件下与特异性抗体紧密结合的。更优选地，所述玻片是经过亲水试剂烷基糖苷处理的玻片。更优选地，所述亲水试剂为质量分数为0.01～0.2％的烷基糖苷、0.01～0.1％的甘油，0.01～0.05％的聚乙二醇4000的超纯水溶液；亲水试剂处理玻片的方法为将玻片在亲水试剂中浸泡3～5分钟，晾干即可。最优选地，所述亲水试剂为质量分数为0.1％的烷基糖苷、0.05％的甘油，0.01％的聚乙二醇4000的超纯水溶液；亲水试剂处理玻片的方法为将玻片在亲水试剂中浸泡3分钟，晾干即可。更优选地，所述检测抗体混合物在24℃、40％的湿度条件下点样到固相载体上。根据本发明所述的检测人受体酪氨酸激酶的磷酸化抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述样本处理液为包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的ripa缓冲液。优选地，所述磷酸酶抑制剂是选自：na3vo4、naf。本发明所述的抗体芯片试剂盒可通过类似于夹心法elisa的检测方法来测定rtk磷酸化蛋白。其操作步骤包括：1)用样本稀释液稀释相应浓度的样本于反应槽中孵育；2)洗涤，加入稀释的生物素化的检测抗体孵育；3)洗涤，加入稀释的荧光素标记的链亲和素溶液孵育；4)洗涤，于激光扫描仪对玻片进行成像并判断结果。用含cy3通道的激光扫描仪对反应结束的玻片进行扫描成像，选用合适的激光扫描参数使芯片上最高信号接近饱和，所得图像存储为tiff文件。然后用芯片读数软件将每个点的荧光信号转化为数码信号。通过稀释的rtk磷酸化蛋白参照物的数码信号绘制每个样本的信号，然后通过相应的标准参照值判断出rtk磷酸化蛋白在样品中的表达水平。优选地，结果判定根据以下计算方式：x(ny)＝x(y)*p1/p(y),减去背景信嗓值后，其中p1表示阳性对照在参考组中的信号强度，p(y)表示阳性对照在反应组中的信号强度，x(y)表示样本在反应组中的信号强度，表示样本在反应组中的检测值。当检测值大于参考值1.5倍或者小于参考值0.65倍，可分别判定为阳性或者阴性。由于本发明采用点样液的优良特性，即特异性抗体与含有0.5至1.5％酪蛋白的ph7.4磷酸盐缓冲液混合形成抗体混合物，使本发明所述的抗体芯片试剂盒将特异性抗体固定于玻片的步骤得到极大的简化，无须现有技术(免疫沉淀法或者普通的elisa法)中普遍采用的点样后封闭玻片上的有效成分的操作步骤。在本发明的一个实施例中，步骤(1)的点样操作中，采用美国伯乐(bio-rad)公司或铂金艾尔默(perkinelmer)公司生产的全自动点样仪器。各特异性抗体芯片点阵排布于膜片，而在具体的操作过程中，各特异性抗体的排布可以按照实验设计需要进行调整，根据不同的抗体芯片排布阵列，控制全自动点样仪，制备出所需要的中间产品。本发明所述的人受体酪氨酸激酶(rtk)的磷酸化抗体芯片试剂盒，具有以下优点：(1)能够同时检测出71项蛋白磷酸化水平，并且能够实现多样本多指标的并行检测，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、需有费仪器、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化；(2)本发明所采用的磷酸化抗体芯片适合于采用全自动点样仪来点样，因此具有高通量、多位点的特定；(3)本发明优选采用多孔纤维膜作为固相载体，并在点样和包被过程中对膜片进行了优化处理，从而提高了该抗体芯片试剂盒在灵敏度、准确性、高通量等方面的性能。综上所述，本发明所述的人受体酪氨酸激酶(rtk)的磷酸化抗体芯片试剂盒特别适用于生物学、医学、药物研发、疾病治疗及其相关领域检测。附图说明图1为本发明所述的检测人受体酪氨酸激酶的磷酸化抗体芯片试剂盒的膜芯片(采用膜片作为固相载体)的点样阵列图。图2为为本发明所述的检测人受体酪氨酸激酶的磷酸化抗体芯片试剂盒的玻璃芯片(采用玻片作为固相载体)的点样阵列图。图3为a431细胞在芯片的检测结果；左图显示egf未诱导的a431细胞在芯片的检测结果；右图显示egf已诱导的a431细胞在芯片的检测结果。此实施例采用的是膜芯片。图4为本发明所述的人rtk磷酸化抗体芯片试剂盒检cont-odn和gal-1-odn处理的滋养层细胞的结果图。此实施例采用的是玻璃芯片。具体实施方式实施例1：最佳抗体芯片载体的筛选。常规的抗体芯片多以玻片为载体，由于玻片易碎且检测设备昂贵，不适合小规模应用，也为诊断领域的试剂运输带来难题。而传统的硝酸纤维素膜易碎背景高，结果波动大。我们筛选了市面上不用活性方法处理的膜片及玻片，经过大量的筛查得出无论是膜片还是玻片，温度及表面的活性试剂成分才是决定点样效果的关键。(1)膜片的筛选为了使抗体固定在膜片表面，我们筛选了不同方法处理膜片，如下表。再用全自动点样仪把发光液点在在膜片的表面，然后用uv扫描仪来读数。各组膜片的处理方法如下：第1组：硝酸纤维素膜片，购于fisher公司，货号为lc2009。第2组：聚偏氟乙烯(pvdf)膜，购于whatman公司，货号为10485289。第3组：将第2组中的pvdf膜浸泡于0.02％至0.075％的非离子表面活性剂tween80的水溶液中。第4组：将第2组中的pvdf膜加入含催化剂的双氧水进行强氧化反应，再加入h2so4形成亲水基团。分别将特异性抗体按梯度稀释点于上述4组膜片上，然后加入二抗及底物进行检测，根据点样的孔径均一性，检测限及背景情况选择选择最合适的点样膜，结果见下表1。表1：不同处理方法膜片性能的比较膜的类型均一性背景最低检测限1点样孔均一性较差较清晰0.4ng/ml2点样孔径均一无扩散有杂点0.2ng/ml3点样孔径均一无扩散清晰0.2ng/ml4点样孔径均一清晰0.4ng/ml由上表可见，经过表面活性剂处理的pvdf膜具有较高的均一性及最低的检测限，经过强氧化剂处理的pvdf膜的检测限较未处理的低，但背景较清晰。而普通nc膜的蛋白吸附性差，灵敏度较低。综合以上指标，本发明优先选择经过非离子表面活性剂处理的pvdf膜作为固相载体。(2)玻片的筛选各组玻片的处理方法如下：第1组的氨基化玻片：购自康宁公司，货号为ultragaps40019。第2组的醛基化玻片：将第1组的玻片加入戊二醛浸泡40分钟制作醛基化玻片。第3组的apes玻片：将普通玻片加入丙酮稀释的apes中浸泡0.5至1分钟，再用纯丙酮清洗制成apes玻片。第4组的多聚赖氨酸玻片：将普通玻片加入pbs稀释的多聚赖氨酸浸泡0.5至1个小时，再用纯水清洗制成多聚赖氨酸玻片。第5组的经亲水试剂处理的玻片：将普通玻片用亲水试剂处理，亲水试剂为0.01至0.1％的烷基糖苷。各种玻片的点样效果不尽相同，加入亲水涂层的玻片点样效果较明显，点样效果较未处理过的高。其中经过氨基化及亲水处理的玻片较其他的类型效果较高。在20至26度条件下，膜玻/片点样效果较清晰，背景值低；而在27至30度条件下，无论何种膜/玻片的点样效果都出现扩散现象，温度湿度越高，扩散越明显。各组的玻片结合抗体后加入二抗及底物，在不同的温度及湿度条件下的灵敏度(ng/ml)筛选结果如下表2。表2：综合以上指标，选择经过亲水试剂烷基糖苷处理的玻片作为固相载体。实施例2：试剂盒的制备。本发明所述的抗体芯片试剂盒包括以下组份：固相载体：包被抗体的标准膜片或玻片。洗涤液：含吐温20的20x浓缩洗涤液。1x洗涤液为ph7.2，含0.1％吐温20、0.1mol/l的磷酸盐缓冲液。稀释液：2瓶用于稀释样本的15ml5x浓缩稀释液d，1瓶用于稀释抗体和hrp-链亲和素的15ml5x浓缩稀释液b。1x稀释液b为15mm,ph7.4的pbs缓冲液，溶质及其在所述稀释液b中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：0.5％酪蛋白，2-4％蔗糖，150mmnacl。1x稀释液d为15mm,ph6.5的pbs缓冲液，溶质及其在所述标本稀释液中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：2-4％蔗糖，150mmnacl。检测抗体：生物素化的检测抗体混合物。200μl300x浓缩荧光素-链亲和素溶液。样本处理液：2x细胞裂解液10ml，1x细胞裂解液包含10mmph7.5，tris.hcl，25mmnacl，1％脱氧胆酸钠，1％tritonx-100，包含磷酸酶及蛋白酶抑制剂。在固相载体上包被的特异性抗体为针对选自如下71种蛋白质的抗体(参见表3)。这些抗体均可商业购买，例如购自r&dsystems、peprotech、raybiotech等公司。表3：特异性抗体所针对的抗原蛋白质名称这些特异性抗体通过全自动点样仪完成点样操作，将特异性抗体固定于点样膜的方法包括以下步骤：1)特异性抗体与含有0.5至1.5％酪蛋白的ph7.4磷酸盐缓冲液混合形成抗体混合物；2)于抗体混合物中将每个抗体含量以0.01至2ng固定于所述点样孔，每个抗体设置2至4个重复孔；3)抗体芯片点阵排布于膜片，膜片每平方厘米点10至100个特异性抗体。各特异性抗体的排布可以按照实验设计需要进行调整，根据不同的抗体芯片排布阵列，通过控制全自动点样仪，制备出所需要的中间产品。特异性抗体的一种点阵顺序可参见图2。所述膜片还包括阳性对照和阴性对照。阳性对照孔为对应特异性抗体的具有相应浓度的生物素化igg抗体，每个反应的生物素化的igg抗体的浓度一致，以便于标准化检测。阴性对照孔为具有相应浓度的生物素化的无关抗体，每个反应的生物素化的无关抗体的浓度一致，以便于标准化检测。根据实施例1的筛选结果，固相载体采用多孔纤维膜，包括：硝酸纤维素膜，纤维过滤膜，玻璃纤维基片，聚偏氟乙烯膜(pvdf)或者尼龙膜。纤维膜在高温，高压及酸碱条件下易水解，也易被微生物分解，长时间保存也易失水而干燥，带电荷并变脆，耐久性较差。因此，本发明通过0.05至0.1％的表面活性剂，0.1至0.5％的叠氮化钠处理多孔膜,在18至22℃条件下与特异性抗体紧密结合，最终形成的点样孔清晰完整。本实施例中，全自动点样仪为美国伯乐公司或铂金艾尔默公司生产的产品；玻片为美国康宁公司产品。当然，在发明技术方案的上述步骤中，仪器和材料的采用并不局限于本实施例的列举，而是以能够解决本发明的技术问题，并实现相应的技术效果为依据。实施例3：用实施例2的试剂盒检测rtk磷酸化蛋白将底膜放于配套方盒内，由于本实施例的底膜上分布有多个芯片点阵，故而在本实施例中方盒设置有8个方格，通过方盒之间的方格将每个芯片点阵划分为相互独立的反应区，本实施例中采用的设置有8个方格方盒，向每个方格内加2毫升封闭液后放置于室温下培养30分钟，而后依次进行如下各步骤的操作：1、加样吸出每个方格中的封闭液，将100微升～5毫升经封闭液稀释过的样品放入有膜的方格内，然后放在摇床上室温下摇动1至2小时，或者亦可在4℃下反应12-18小时。2、洗膜洗涤液i清洗：从方格内吸出样品，用1～5毫升1倍的洗涤液i清洗，之后放在摇床上室温摇动5分钟，再重复此清洗步骤两次。洗涤液ii清洗：从方格内吸出残液，用1～5毫升1倍的洗涤液ii清洗，之后放在摇床上室温摇动5分钟，再重复此清洗步骤一次。3、加入标记有生物素的抗体混合液向每个方格加入生物素标记的,混合有针对表1中所列抗原蛋白质的特异性抗体的混合液500微升～2毫升,然后放在摇床上室温摇动1至2小时。亦可在4℃下反应12-18小时。而后从方格内吸出标记有生物素的抗体混合液，重复步骤2的洗膜步骤。4、加入hrp-streptavidin向每个方格加入500微升～2毫升稀释过的辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白链菌素(hrp-streptavidin),然后放在摇床上室温条件下摇动1至2小时，亦可在4℃下反应12-18小时。而后从方格内吸出hrp—streptavidin，重复步骤2的洗膜步骤。hrp—streptavidin商购自bd公司(产品号554066)，实验前，需要用封闭液进行20,000倍稀释。需要说明的是，在本实施的步骤1至步骤4中，用到如下容易，其成分可配制方法如下：2mtris缓冲液(ph7.5)：trizmabase484g、纯化水1.3l，调节酸碱度至7.5，纯化水加至2l。封闭液的配制方法如下：先将20×pbs(kcl16g,nacl640g,kh2po416g,na2hpo492g,溶解于2.6l纯化水后,再加纯化水至4升)稀释成1×pbs(20×pbs200ml，纯化水3800ml)，然后配制10％bsa(bsa400g，1×pbs加至4升)，最后配制封闭液(10％bsa4升，casein4升，混匀)。20×洗涤液ii(20×tbs)配分如下：2mtris缓冲液(ph7.5)800ml，5mnacl4800ml(nacl1461g,纯化水3.3升，溶解后纯化水加至5升)，混匀后，纯化水加至8升。使用时，将20×洗涤液ii倍比稀释即可。20×洗涤液i(2％tween/20×tbs)配分如下：20×洗涤液ii1l，tween20ml,混匀。使用时，将20×洗涤液ii倍比稀释即可。5、检测用镊子夹出底膜并置于垂直状态使多余的液体滴干；而后将膜放在清洁的塑料片上，保证底膜固定有抗体的一面朝上；加入500微升配制好的(a:b＝1:1)发光液(商购自biofx公司，产品号lumb-0500-01)到每张底膜上并在室温下放置2分钟，此过程必须确保发光液完全覆盖到整张膜；再用另一张干净的塑料片覆盖于底膜表面，小心地将塑料片中的气泡挤压出去，在将塑料片中的气泡挤压出去的过程中应当避免在膜上用力。上述步骤后，将底膜放在室温下5到10秒成像，拍摄时采用低温ccd，并采用相配套的uv扫描仪中读取数据。实施例4：试剂盒的应用1)鳞表皮细胞癌细胞a431经血清饥饿过夜处理后暴露于37℃，100ng/ml的egf10分钟，对照细胞同样经饥饿处理但不暴露于egf中。两组细胞经裂解后加入抗体芯片中孵育，再加入生物素标记的抗磷酸化受体酪氨酸抗体来检测激活受体上的磷酸化受体酪氨酸。经过荧光染料作用后，采用激光扫描仪检测信号。图3的左图显示egf未诱导的a431细胞在芯片的检测结果；图3的右图显示egf已诱导的a431细胞在芯片的检测结果。结果显示：经过egf诱导的a431细胞的egfr,erbb2,erbb3蛋白的表达量比未诱导的高。2)本发明所述的人rtk磷酸化抗体芯片试剂盒检测cont-odn和gal-1-odn处理的滋养层细胞。gal-1通过调节胚胎滋养细胞上hla-g的表达，在妊娠期母体免疫调节中发挥关键作用。gal-1水平可以作为预测流产的因子。人受体酪氨酸激酶磷酸化抗体芯片可监控gal-1对细胞蛋白磷酯化水平的作用。胚胎滋养细胞细胞(cont-odn)及其抑制gal-1表达的滋养层细胞(gal-1-odn)经过裂解并分别加入人受体酪氨酸激酶磷酸化抗体芯片，充分洗涤后，再加入生物素标记的抗磷酸酪氨酸抗体，hrp标记物链霉素及发光底物。结果显示：fgfr2、srms、txk蛋白的表达受到不同程度的抑制。当前第1页12