本申请要求2011年6月6日提交的美国序列号13/153,934的优先权，其内容通过引用并入本文中。
技术领域：
本发明涉及样品中配体(更具体地，特异性结合受体的配体)浓度的测定。
背景技术：
：在过去几十年中，免疫测定使用荧光、化学发光或产生响应于分析物的信号的其他方法来进行。目前，许多免疫测定通过测量反应混合物的总量中产生的光信号的强度来进行。所产生的光信号可通过光学方法来测量，其中所产生的光信号由大量分子发出。在一个典型的实施方案中，这些免疫测定可通过将怀疑含有抗原的样品与包含附着于固体载体(例如，珠、微粒)的第一抗体的试剂混合以形成反应混合物来实现。所述抗原，如果存在于样品中，特异性结合第一抗体。缀合物，其包含具有附着于其上的标记的第二抗体，被引入到反应混合物中，并特异性地结合至抗原，该抗原特异性结合第一抗体，如前所述，该第一抗体附着在固体载体上。这种免疫测定被称为夹心免疫测定或免疫计量试验。这种类型的免疫测定示意性地示于图1中。然后将未结合的缀合物从反应混合物中移除(典型地通过洗涤步骤进行)后，测量由标记引起的信号。测量反应混合物的总量所产生的信号，然后与校准曲线对比以确定样品中存在的抗原的浓度。另一种类型的免疫测定被称为竞争性免疫测定。在一个典型的实施方案中，未标记抗原和标记抗原竞争相同的抗体位点。或者，抗体和标记抗体竞争相同的抗原位点。在前者的实例中，使用标记抗原和未标记抗原。将固体载体用能特异性地结合至标记抗原或未标记抗原的抗体包被。将固体载体、标记抗原和怀疑含有抗原的患者样品混合。当然，患者样品中的任何抗原都是未标记的。标记抗原和未标记抗原竞争固体载体上的抗体位点。只有当标记抗原附着于固体载体上的抗体才能产生信号，因为只有标记抗原可以产生信号。患者样品中的抗原量与信号的产生量成反比。这种类型的免疫测定示意性地示于图2中。在使用不同的光学方法进行免疫测定时，大量参数必须加以考虑。这些参数包括进行免疫测定所需要的时间、进行免疫测定所需要的样品量、进行免疫测定所需要的其他试剂的量、完成免疫测定所需要的步骤数、免疫测定的灵敏度和免疫测定的动态范围。该动态范围通常可以覆盖三个或更多个数量级。几十年来，利用磁微粒的免疫测定已显示可为前面提到的大部分参数提供足够的值。磁微粒允许结合至缀合物的分析物以简单的方式与未结合的缀合物和其它试剂分离。磁微粒的另一有吸引力的特性是可以在溶液中容易地控制它们以允许固相上的分析物或缀合物在相对短的时间内结合。通过利用磁性吸引力，可移动和洗涤磁微粒以提供仅结合至磁微粒的分析物的信息。使用任何微粒作为固体载体的主要缺点是关于包被在微粒上的抗体的量，微粒与微粒之间缺乏均一性。另一个缺点是缀合物与微粒的不期望的相互作用。这种不期望的相互作用可能会影响免疫测定的结果，因此，可能需要对用于在免疫测定分析仪中使用的由不同制造商制造的大量不同微粒进行广泛研究。当在反应器中进行免疫测定时，自身存在另一个缺点。缀合物可结合至反应器的表面，这是不希望的。这些缺点不仅限制了免疫测定的灵敏度，也可能对分析物的检测产生错误的结果。免疫测定中可能出现的其他问题涉及(a)缀合物与固体载体的非特异性结合和(b)试剂的聚合。这些问题是试验的开发者所主要关注的。典型地，减少非特异性结合的方法不仅涉及试剂的调整(tailoring)，还涉及以适当的比例将它们混合以提供所需结果。这些方法需要显著量的反复试验(trialanderror)，往往会导致使试验的开发成为漫长的过程，以及使试验的开发成为实验性(empirical)过程，结果是从一批到另一批试剂经常变化。此外，缀合物的非特异性结合所产生的信号可能比缀合物与分析物特异性结合所产生的信号更高，从而限制了免疫测定的灵敏度。可仅通过使用不含任何分析物的样品进行校准来评估实际试验过程中非特异性结合的影响。典型的免疫测定的另一个潜在缺点是进行试验后，试验的唯一记录是信号的值。如果可获取新的分析方法，没有机会重新检查样品的缺陷或获取更多的信息。将不仅没有固相的性质的记录，也没有办法使用新开发的算法来核查记录的数据。使用历史数据来提取新信息的能力是不可能的。因此，存在开发用于解决当从试验中同步获取数据时，在给定试验中固相的非特异性结合和非期望性能的分析仪器和方法以提高试验的灵敏度的需求。存在减少试剂的使用并为实验室设置和即时设置的使用提供足够的测量时间的需求。原则上，由于试验正在进行，这种方法也能提供实时质量控制。此外，期望缓解生成新的校准曲线并减少从一批到另一批的试剂的变化的需求。还期望以这种方式保持试验的记录，因为这些方法变为可获取的，故可在稍后的日期通过使用不同方法进行核查。新的检测方法可配备来自纳米技术和微流体的新兴领域的设备以为生物样品中分析物的检测和测量提供更小、更有效和更灵敏的试验。技术实现要素：本发明提供一种用于分析配体-受体结合试验的方法，其包括以下步骤：(a)使配体-受体结合试验的至少一个信号合格；和(b)提供配体-受体结合试验结果。更具体地，该配体-受体结合试验涉及混合适当的试剂(其中受体附着于固体载体，例如，微粒)、怀疑含有配体(例如，分析物)的样品和包含标记的缀合物以形成复合物，其中标记以与样品中存在的配体量直接成正比的浓度存在。缀合物的标记附着于第二受体，所述第二受体不同于附着于固体载体的受体。或者，该配体-受体结合试验涉及混合适当的试剂进行配体-受体结合试验，其中附着于固体载体(例如，微粒)的受体、怀疑含有配体(例如，分析物)的样品与包含标记的缀合物形成复合物，其中标记以与样品中存在的分析物量成反比的浓度存在。缀合物的标记附着于配体，所述配体与怀疑存在于样品中的配体是相同的配体。为提高免疫测定的灵敏度，可采用任选的反应步骤和任选的洗涤步骤以减少非特异性结合并清除任何过量的缀合物。另一替代方法是一步均相免疫测定，其不需要分离步骤。在一个实施方案中，将在其表面上带有受体的微粒、怀疑含有分析物(即配体)的样品以及包含附着于第二受体的标记的缀合物(其中所述第二受体不同于附着于微粒的那些受体)引入到反应器中并使其反应，借此形成包含发射光信号的标记的复合物。反应器能够使包含发射光信号的标记的复合物记录在图像中。能够存储所得到的图像以供稍后时间使用。在被用作测量分析物的浓度前使来自图像的光信号合格。该图像包括大量像素，并以逐个像素(pixel-by-pixel)为基础使该图像合格和定量该图像。使合格涉及将分析限制在复合物所在位置的那些图像部分并测量图像中复合物所发射的光的强度值。适于使来自图像中复合物的光信号合格的算法包括以下步骤：(a)获取第一荧光图像以确定复合物中第一缀合物的位置；(b)在图像中选择像素进行分析；(c)计算并记录步骤(b)中所选择的像素的每像素计数的平均值和方差；(d)省略计数大于或小于方差的指定水平的分析像素；和(e)计算剩余像素的每像素计数的平均值。从步骤(e)中获取的数据，可确定样品中分析物的浓度。在任选的步骤中，可获取反应混合物的白光图像以确定附着于固体载体的复合物的位置。在另一个任选的步骤中，可获取第二荧光图像以确定复合物中第二缀合物的位置。对于确定样品中分析物浓度，第二荧光图像可用于增加灵敏度。对于夹心免疫测定，附着于固体载体的受体通常被称为捕获抗体。附着于标记的第二受体通常被称为检测抗体。反应器可以是微孔板的微孔。在典型的夹心免疫测定中，将反应混合物孵育一段规定的时间后，通常洗涤反应混合物以移除任何过量的检测抗体和其它未结合的物质。然后残留在反应器中的复合物通过例如配备有数码相机的荧光显微镜进行成像。然后确定每像素的光强度的平均值。然后由此确定的值可以用来确定样品中抗原的浓度。对于某些类型的竞争性免疫测定，附着于固体载体的受体也可被视为捕获抗体。然而，当抗原附着于标记，并且怀疑样品含有该抗原时，这种特定类型的竞争性免疫测定不具有检测抗体。反应器可以是微孔板的微孔。在这种特定类型的竞争性免疫测定中，将反应混合物孵育一段规定的时间后，通常洗涤反应混合物以除去过量的标记抗原和残留在反应混合物中的任何其它物质。然后残留在反应器内的物质通过例如配备有数码相机的荧光显微镜进行成像。然后确定每像素的光强度的平均值。然后所确定的值用于确定样品中抗原的浓度。如前面所述，可以进行其他类型的免疫测定以提供进行本发明的成像方面所需要的结果。在另一个实施方案中，配体可以是核酸的单链，例如，DNA、RNA，且受体可以是核酸的互补链，例如，DNA、RNA。在该实施方案中，配体-受体结合反应可用于鉴定基因或特定核酸序列的存在，例如，DNA序列、RNA序列。用于提供关于上述配体-受体结合试验的其他信息的替代方法涉及达到或超过至少一种所选标准的微粒或荧光斑点的数量的计数以用于计算强度。这种替代方法能够为指示试验的合适性能提供内部控制。原则上，可对试验与试验之间的结果进行对比以确保每个试验可靠，即，足够灵敏和足够精确。相对于每像素的强度值，每个微粒的荧光强度平均值可用来确定配体的浓度。这两个值都应该与校准品的值一致，由此产生可用于确定分析物浓度的两个统计量度。本文所述的方法还能以与保持x射线和组织病理学记录类似的方式保持试验的记录。因为图像为离线获取并存储，即通过计算机数据存储，其不适于在无人工干预下经系统要求立即使用，可在稍后的时间采用用于分析的不同程序。该特点的优势是能够实现在不同时间取自同一患者的样品的试验结果的直接对比。在该方式下，实际样品及其试验的信息不会丢失，并且可以在稍后的时间进行共享或核查。本文所述的方法通过进行配体-受体结合试验后生成包含微粒的复合物的荧光图像，解决了总信号的测量中的固有问题。在本文所述的方法中，从样品总量所发射的光强度的测量被替换为含有来自样品的分析物的复合物的图像分析以提高试验的灵敏度。通过合并常规配体-受体结合试验中未包含的空间信息，试剂的聚集和非特异性结合可以从产生的信号中消除，且可使样品中的分析物合格并同时或随后进行定量。例如，关于使合格，与固相相关的不期望的人工制品，例如，微粒，可被检查出并在使用强度信息之前移除。或者，如果期望测量蛋白质的聚集程度，可测量上述聚集相关的空间信息，而不是从生成的信号中移除。例如，淀粉样蛋白的聚集是阿尔茨海默病的指标。此外，关于定量，本文所述的方法允许省略非特异性结合至反应器的壁上的试剂和缀合物以及在反应混合物中扩散的试剂和缀合物的强度信息。空间信息可用于精确定义应从中测量强度的图像的区域，以进行精确和准确的配体-受体结合试验。常规试验需要大量的样品和大量的试剂以提供足够的信号。本文所述的方法只需要少量的固体载体材料，例如，仅几百个包被的微粒，例如，至多约两百(200)个微粒，或更少。如果新的分析方法变得可用，本文所述的方法能够对缺陷进行样品的复检或获取更多的信息。附图说明图1为阐述夹心免疫测定的示意图。图2为阐述竞争性免疫测定的示意图。图3为红色荧光团标记的捕获抗体的荧光图像。图4为附着于微粒的检测抗体的荧光图像。图5为显示目标区域的图像，从中可计算每像素的平均强度。图6为具有附着于其上的抗体：分析物：缀合物(即，单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE)的复合物的微粒的白光图像。图7为具有附着于其上的抗体：分析物：缀合物(即，单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE)的复合物的微粒的荧光图像。图8为基于图6和图7的图像的目标区域的图像。图8由软件程序生成。图9为图7的荧光图像在图8的目标区域的图像上的覆盖图。图10为显示由使用本文所述的成像算法所引起的免疫测定的灵敏度增加的校准曲线。对于该校准曲线，分析物(即，肌钙蛋白)的校准品的范围为10pg/mL至50,000pg/mL。图11为显示由使用本文所述的成像算法所引起的免疫测定的灵敏度增加的校准曲线。对于该校准曲线，分析物(即，肌钙蛋白)的校准品的范围为0pg/mL至200pg/mL。在图11中，还示出了来自每个校准品的图像总面积的每像素的荧光强度平均值。图12为显示分析物(即，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，或者在本文中被称为“NGAL”)的校准品的每像素的平均荧光强度的校准曲线。对于该校准曲线，分析物NGAL的校准品的范围为0pM至94pM。图13为显示分析物(即，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，或者在本文中被称为“NGAL”)的校准品的每像素的平均荧光强度的校准曲线。对于该校准曲线，分析物NGAL的校准品的范围为0pM至6pM。图14为具有附着于其上的抗体：分析物：缀合物(即，单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE)的复合物的微粒的白光图像。图15为基于图14的图像的目标区域的图像。图14由软件程序生成。图16为具有附着于其上的抗体：分析物：缀合物(即，单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE)的复合物的微粒的荧光图像。图17为由每个浓度的校准品肌钙蛋白的每像素的平均强度值生成的校准曲线。图18为显示用于检测DNA的试验方案的插图。详细说明如本文所用，术语“分析物”是指待测量的化合物或组合物，其可以是配体，其为单表位或者多表位，抗原或半抗原，单个或多个化合物，其共享至少一个共同表位位点或受体。免疫测定是一种测量在经常含有物质的复杂混合物的溶液中物质的存在或浓度的生化试验。生物液体例如血清或尿液中的分析物经常使用免疫测定方法进行检测。这种试验是基于抗体高特异性结合于一个或非常有限组的分子的独特能力。结合至抗体的分子被称为抗原。免疫测定可以对抗原/抗体对的任一成员进行。除了结合特异性，所有免疫测定的另一关键特征是响应于特异性结合产生可测量的信号的方法。历史上，这通过测量某些物理特性的变化例如光散射或折射率改变来实现。然而，如今大多数免疫测定依赖于使用与可检测标记相关联的分析试剂。已证明了各种各样的标记，包括酶；荧光、磷光和化学发光染料；胶乳和磁性颗粒；结晶染料、金、银和硒胶体粒子；金属螯合物；辅酶；电活性基团；寡核苷酸、稳定的基团及其他。这种标记用于检测和定量结合事件，在分离游离和结合的标记试剂后或通过以结合事件影响标记所产生的信号的变化的方式设计系统进行。需要分离步骤的免疫测定(通常称为分离免疫测定或异相免疫测定)是流行的，因为它们很容易设计，但它们经常需要多个步骤，包括仔细清洗标记试剂已结合在其上的表面。信号受结合影响的免疫测定通常可以不经分离步骤来运行。这种试验经常可以简单地通过混合试剂和样品并进行物理测量来实现。这种试验被称为均相免疫测定或较不频繁的非分离的免疫测定。如本文所用，表述“夹心免疫测定”是指采用至少两种特异性结合至相同配体的受体的免疫测定。在这种类型的免疫测定中，配体是分析物。一个受体能够特异性结合至配体，借此受体使配体能够直接或间接地附着于固体载体，例如，微粒。另一受体能够特异性结合至配体，借此受体使配体可以直接或间接地附着于标记以提供用于检测配体的信号。例如，一个受体可以是特异性结合至样品中抗原的捕获抗体，借此使抗原直接或间接地附着于固体载体，例如，微粒，另一受体可以是特异性结合至样品中抗原的检测抗体，借此使抗原直接或间接地附着于用于检测抗原的标记。如果样品中存在相对高量的配体，将会产生较高的信号。如果样品中存在相对低量的配体，将会产生较低的信号。图1为阐述夹心免疫测定的代表性实例的示意图。如本文所用，表述“竞争性免疫测定”是指采用结合至配体的受体的免疫测定。在这种类型的免疫测定中，配体是分析物。受体能够特异性结合至配体，借此使配体直接或间接地附着于固体载体，例如，微粒。标记的配体与分析物竞争相同的受体。例如，受体可以是特异性结合至样品中抗原的捕获抗体，借此使抗原直接或间接地附着于固体载体，例如，微粒。样品中的抗原是未标记的。标记的抗原与未标记的抗原竞争相同的捕获抗体。变得附着于固体载体的标记抗原为检测抗原提供标记。或者，在受体是特异性结合至样品中抗体的抗原的情况下，借此使抗体直接或间接地附着于固体载体，例如，微粒，未标记的抗体和标记抗体可竞争相同的抗原。变得附着于固体载体的标记抗体为检测抗体提供标记。如果样品中存在相对高量的配体，将会产生较低的信号。如果样品中存在相对低量的配体，将会产生较高的信号。图2为阐述竞争性免疫测定的代表性实例的示意图。如本文所用，术语“复合物”是指特异性彼此结合的至少两个分子。复合物的实例包括但不限于结合至受体的配体、结合至多个受体的配体(例如，结合至两个受体的配体)、结合至多个配体的受体(例如，结合至两个配体的受体)。如本文所用，表述“固相”是指受体的状态，其中所述受体附着于固体载体的表面，使得该受体不能从液体介质中的固体载体脱离。固相可以容易地从分散固相的液体中分离。受体可附着的固体载体的实例是微粒，例如，磁微粒。所述微粒可以容易地从分散该微粒的液体中分离。所述微粒易于分散在水性介质中。如本文所用，表述“固体载体”是指有助于产生固相的物质。固体载体的代表性实例包括但不限于微粒、微孔板的微孔、纳米颗粒、凝胶、胶体、生物细胞。如本文所用，表述“捕获抗体”是指使分析物(即，抗原)结合至固体载体的抗体，其结果是该抗体使分析物附着于固体载体，借此使分析物直接或间接通过干预基团或干预分子附着于固体载体。如本文所用，表述“检测抗体”是指附着于提供或可制备成提供在化学或生物反应中的可检测信号的基团或分子的抗体。如本文所用，表述“特异性结合对”是指两个不同的分子，其中一个分子在表面上或空腔中具有特异性地结合至另一分子的特定空间结构的区域。所述特异性结合对的成员被称为配体和受体。如本文所用，表述“非特异性结合”是指两个或更多实体(例如，两个分子)之间以不同于导致特异性结合对的方式结合。如本文所用，术语“配体”是指其受体天然存在或可被制备的任何物质。这种物质包括但不限于有机化合物、无机化合物和化学元素，例如铜、锂。如本文所用，术语“受体”是指能够识别分子的特定空间和极性结构(即，表位位点)的任何化合物或组合物。例示性的受体包括天然存在的受体，例如甲状腺素结合球蛋白、抗体、酶、Fab片段、凝集素等。配体与受体的结合涉及两个分子物种(species)之间的非共价相互作用。典型地，但不一定，较小的配体是可溶性分子，其结合至较大的受体。配体结合至受体的实例包括但不限于以下：(a)具有短单链DNA配体的互补序列的长单链DNA受体；(b)结合至其互补抗原配体的任何抗体受体或结合至其互补抗体配体的抗原受体；(c)与维生素B12配体结合的内因子蛋白受体；(d)氧分子配体的血红蛋白受体。如本文所用，术语“缀合物”是指包含结合对成员和信号产生系统的成员(例如，标记)的实体。如本文所用，术语“标记”是指信号产生系统的成员，其直接或间接地结合至结合对成员或微粒。如本文所用，术语“信号产生系统”是指具有一种或多种组分的系统，至少一种组分缀合至特异性结合对成员。信号产生系统产生可测量的信号，其可通过外部工具检测，通常为电磁辐射的测量，且取决于所使用的系统，信号的水平将随处于固体载体(例如，微粒)环境中的信号产生系统的范围而变化。在大多数情况下，信号产生系统将涉及发色团，其中发色团包括在紫外或可见区吸收光的染料、荧光体、荧光剂、荧光团、发光团和化学发光剂。另外，酶可以用来产生信号或放大信号或上述二者兼有。如本文所用，术语“使…合格”、“合格的”等是指从不是由包含目标分析物的复合物所引起的图像中除去那些信号的程序。这样被除去的信号包括但不限于非特异性结合、不期望的聚合所产生的信号，或从未附着于固体载体的位置发出的信号。在大多数情况下，但有一些例外，使分析和测量合格的那些信号是包含标记的缀合物的特异性结合的结果。如本文所用，且一般在数字图像领域中，术语“像素(pixel)”或“象素(pel)”(图像元素)是指数字图像中的单个点，或显示装置中的最小可寻址(addressable)的屏幕元素。它是能够表示或控制的图像的最小单元。每像素具有其自己的地址。像素的地址与其空间坐标相对应。像素通常排列在二维网格中，且往往用点或正方形表示。每个像素为原始图像的样品；更多的样品典型地提供原物(theoriginal)的更准确表示。每个像素的强度是可变的。图像中像素的总数可以变化。数字图像中像素数量的代表性实例为1024×1024。如本文所用，术语“强度”是指每单位面积或体积的电、光、热或声音的强度的量或程度。更具体地，关于本文中实际描述的方法，术语“强度”是指每单位时间每单位面积所计数的光子数。例如，每单位面积1000个光子在单个像素中可记录为500计数，而每单位面积80个光子在单个像素记录为40计数。特定的转换取决于所使用的照相机系统。强度与所计数的光子数成正比。如本文所用，表述“目标区域”是指经选择用于进一步分析的图像中的那些像素。在图像中，像素可以是连续的或非连续的。如本文所用，短语“空间信息”是指识别从其中发射信号的位置。如本文所用，术语“IgG”是指免疫球蛋白G。在本文所述的发明的一般陈述中，配体特异性结合至受体以形成配体-受体复合物。得到配体-受体复合物的图像。优选将图像储存以便它可在稍后的时间使用，如果需要的话。以仅进一步研究配体-受体复合物的方式从图像中选择目标区域。该选择特征确保背景信号和非特异性结合信号基本上从进一步分析中排除。计算目标区域的每像素光计数的平均数。适合于本文所述方法的配体包括但不限于美国专利号4,275,149中所提到的那些，其通过引用并入本文中。适合于本文所述方法的受体包括但不限于美国专利号4,275,149中所提到的那些，其通过引用并入本文中。适合于本文所述方法的配体-受体复合物包括但不限于美国专利号4,275,149中所提到的那些，其通过引用并入本文中。受体典型地附着于固体载体。适用于本文的固体载体为微粒。适用于本文所述方法的微粒包括但不限于磁微粒。微粒的尺寸典型地为约0.1μm至约100μm。市售的微粒可采用各种材料，包括陶瓷、玻璃、聚合物和金属所制成的那些。适用于本文所述方法的磁微粒可商购自PolymerLaboratories，AgilentTechnologies的子公司。虽然0.1μm至100μm的通常所接受的定义是纳米颗粒的尺寸定义的补充(complements)，但还有其他的方法来定义尺寸。通常接受认为小于100nm的微粒为纳米颗粒。大于0.5μm的任何微粒和小于0.5mm的任何物质被认为是微粒。一般而言，适用于本文所述方法的微粒尺寸必须足够大使得可以通过所选择的图像系统来分辨两个微粒。适用于本文所述方法的微粒的性质(例如，颜色)是选择的问题。本领域普通技术人员能够选择微粒的性质以完成该方法的适当变化所施加的要求。适用于本文所述方法的反应器包括微孔板。优选反应器具有这种特征：可制造配体-受体复合物的图像。优选反应器对电磁辐射是透明的，典型地在光谱的紫外和可见范围内。适于制造反应器的材料包括玻璃和聚合物材料。优选反应器的材料不会自发荧光。然而，反应器的特定形式或形状不是关键的。考虑用于本文所述方法的试验的反应条件不是关键的。可使用与常规免疫测定或其他常规的特异性结合反应所使用的基本上相同的条件。这种条件包括但不限于孵育的持续时间、孵育的温度范围、洗涤步骤的次数、缓冲液和试验中的其他非反应性物质等。原则上，设计用作化学发光试验的任何免疫测定可通过本文所述方法使用荧光标记来进行。适用于本文所述方法的成像系统可以是能够获取图像使得可分辨各个微粒的任何系统。适用于本文所述方法的成像装置包括但不限于光学显微镜、扫描显微镜、荧光成像扫描仪等。适用于本文所述方法的图像文件类型包括但不限于JPEG/JFIF、GIF、BMP、TIFF和FITS。图像文件格式描述于图像文件格式-维基百科，免费的百科全书中，其可通过HypertextTransferProtocol在网站en.wikipedia.org/wiki/image_file_formats访问，其通过引用并入本文中，且FITS描述于FITS-维基百科，免费的百科全书中，其可通过HypertextTransferProtocol在网站en.wikipedia.org/wiki/FITS访问，其通过引用并入本文中。图像的获取过程中曝光持续时间不是关键的。适用于本文所述方法的曝光时间可以是提供足够的分辨率以辨别图像的相关细节的任何曝光时间。目标区域的选择是重要的。通过使用合适的计算机程序，借助于对比或一些替代标准确定各个微粒的位置。与微粒或其他固体载体相关联的像素可被视为目标区域。为了得到样品中分析物的浓度的有意义的值，优选至少约100个微粒，更优选至少约200个微粒位于图像中。适用于本文所述方法的市售计算机程序包括但不限于具有商标“SLIDEBOOK”和“METAMORPH”的那些程序或公共领域的软件，例如，ImageJ。为了执行该方法的简化形式，市售的落射荧光显微镜可用于通过支持它们的透明表面对复合物进行成像。这种显微镜的代表性实例是配备有高分辨CCD相机(Hamamatsu型号C4742-80-12AG)的机动倒置荧光显微镜(OLYMPUS“1X81”)，其可商购自许多来源。在该方法的基本形式中，单色方法可利用来自反应混合物的总量的光信号用于提供比常规免疫测定更高的灵敏度。该更高的灵敏度可通过在较低浓度时具有较大斜率的线性函数的图与在常规免疫测定中用作校准曲线的线性图的对比来证实。带有捕获抗体的微粒、附着于荧光团的检测抗体和怀疑含有分析物的样品在适当的条件下混合以进行免疫测定。进行免疫测定后，排除不是从包含附着于捕获抗体的微粒、分析物和包含附着于荧光团的检测抗体的缀合物的复合物发出的任何荧光信号。然后，基于缀合物的荧光团所发射的荧光使剩余的复合物进一步合格。该较后的步骤排除了不符合选择标准的微粒的表面的任何部分。基于统计参数(例如，标准偏差)，选择标准的典型实例是用于测量的微粒具有大体上均匀的包被，其基本上消除了由于高度的非特异性结合所导致的缀合物的过度聚集。一般而言，选择标准根据特定的试验会有所不同。特定试验领域的一个普通技术人员应该能够为特定的试验制定有意义的选择标准。最后，测量合格颗粒的每像素强度的平均值以与建立作为强度函数的分析物的浓度的校准曲线的强度进行比较。合格颗粒的每像素强度的平均值可通过CCD相机来确定，其能够测量光的强度。将强度的测量转换为参数，并将其在计数的单元中指定。每像素具有与在该象素测得的光强度相对应的数。在一个优选的实施方案中，得到反应混合物的白光图像。白光图像用来定位每个固体载体(例如，微粒)的位置。使用用于照明和检测的整个电磁光谱形成白光图像。该步不是必需的，但是是优选的，因为可能需要定位每个固体载体(例如，微粒)的位置。然后获取荧光图像以确定附着于微粒的检测抗体的位置和强度。荧光图像使用颜色，例如，红色、绿色。计算每像素计数并记录每像素计数的平均值和标准偏差。从分析中排除具有计数大于或小于例如上述标准偏差2倍的像素。计算剩余像素的每像素计数的平均数。从检测抗体的标记所测得的信号的数量确定分析物的浓度。为了执行将提供更高程度的灵敏度的更复杂测量，市售的落射荧光显微镜可用于通过支持它们的透明表面对复合物进行成像。这种显微镜的代表性实例是配备有高分辨率的CCD相机(Hamamatsu型号C4742-80-12AG)的机动倒置荧光显微镜(OLYMPUS“1X81”)，其可商购自许多来源。在该更复杂的测量中，双色方法利用来自反应混合物的总量的光信号，用于提供比常规的免疫测定和采用早期所述的单色方法进行的测量更高的灵敏度。该更高的灵敏度可通过在较低浓度时具有较大斜率的线性函数的图与在常规免疫测定或使用单色方法进行的试验中用作校准曲线的线性图的对比来证实。将带有捕获抗体的微粒、附着于荧光团的检测抗体和怀疑含有分析物的样品在适当的条件下混合以进行免疫测定。进行免疫测定后，排除不是从包含附着于捕获抗体的微粒、分析物和包含附着于第一荧光团的检测抗体的缀合物的复合物发出的任何荧光信号。接下来，获取捕获抗体(以第二荧光团为特征，其不同于第一荧光团)的图像。该图像排除与未以均相方式包被有捕获抗体的任何微粒相对应的任何像素。如果微粒未均匀包被，则排除来自不是均匀包被的部分的像素。然后，基于缀合物所发射的荧光使复合物进一步合格。该后一步骤排除了不符合选择标准的复合物的任何部分。选择标准的典型实例是均匀的包被，其基本上消除了可由高度的非特异性结合所导致的缀合物的过度聚集。如前所述，选择标准根据特定的试验会有所不同。最后，测量合格颗粒的每像素强度的平均值以与建立分析物的浓度的校准曲线的强度进行对比。在一个优选的实施方案中，得到反应混合物的白光图像。白光图像用来定位每个固体载体(例如，微粒)的位置。使用用于照明和检测的整个电磁光谱形成白光图像。该步骤不是必需的，但是是优选的，因为可能需要定位每个固体载体(例如，微粒)的位置。然后获取第一荧光图像以确定附着于微粒的捕获抗体的位置。第一荧光图像使用颜色，例如，红色、绿色。获取第二荧光图像以确定作为缀合物的组分存在的抗体的位置。第二荧光图像使用颜色，例如，红色、绿色，但第二荧光图像的颜色不同于第一荧光图像的颜色。选择来自于微粒上的捕获抗体和缀合物上的抗体的像素用于进一步分析。计算每像素计数并记录每像素计数的平均值和标准偏差。从分析中排除具有计数大于或小于例如上述标准偏差两倍的像素。计算剩余像素的每像素计数的平均数。从检测抗体的标记测得的信号的数量确定分析物的浓度。图3、4和5阐述使配体-受体结合试验的结果合格所需的步骤。通过包含激发滤波器和发射滤波器的一组滤波器对荧光通道进行限定，其允许具有特定波长的光到达样品和具有特定波长的信号到达CCD相机。例如，荧光团R-藻红蛋白(或者在本文中被称为“PE”)只能在PE通道中检测且不能在任何其它荧光通道中检测。类似地，荧光团散二碳青色素(indodicarbocyanine)(或者在本文中被称为“Cy5”)只能在Cy5通道检测且不能在任何其它荧光通道检测。在图3中，检测器中的一个通道测量用红色荧光团(Cy5通道)标记的捕获抗体的荧光图像。仅显现已被具有红色荧光标记的捕获抗体包被的微粒。有两个位置(白色圆圈)可以被省略，因为它们未附着于微粒。在图4中，检测器的另一通道测量附着于微粒的检测抗体的荧光图像。显现与其他微粒的强度分布不一致的非常亮的点，并用白色圆圈进行指定。该位置也可以从分析中排除。图5表示目标区域，从该区域可计算每像素的强度值。不符合给定的选择标准的区域可以从该类型的分析中排除。以下非限制性实施例进一步阐述本发明的实施方案。在以下实施例中，所有浓度以重量计(w/w)，除非另有说明。在以下实施例中，根据本领域普通技术人员已知的常规方法制备缀合物，除非另有说明。在实施例1中，除非另有说明，带有抗肌钙蛋白单克隆抗体19C7的包被但在免疫测定中尚未反应的微粒被称为“包被有抗肌钙蛋白单克隆抗体19C7的微粒”；在免疫测定中已经反应且存在于夹心复合物中的微粒被称为“附着于单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE复合物的微粒”。在实施例2中，除非另有说明，带有抗人IgG单克隆抗体的包被但在免疫测定中尚未反应的微粒被称为“包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒”；在免疫测定中已经反应且存在于夹心复合物中的微粒被称为“附着于缀合物2322-Cy5：NGAL：缀合物903-PE复合物的微粒”。具体实施方式实施例1该实施例通过使用单一荧光染料作为标记来检测抗体，阐述肌钙蛋白的免疫测定。制备包被有抗肌钙蛋白单克隆抗体19C7的微粒。在含有牛血清白蛋白(BSA)(0.5%)、表面活性剂(“STANDAPOL”，0.2%)和抗微生物剂(“PROCLIN”300，0.1%)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备以下浓度的一组肌钙蛋白(Tnl(28-110aa)-TnC)校准品。下表列出了每个校准品中Tnl(28-110aa)-TnC的浓度。表1Tnl(28-110aa)-TnC的浓度(pg/mL)校准品A0校准品B10校准品C100校准品D500校准品E10,000校准品F50,000低浓度对照品20中浓度对照品200高浓度对照品15,000根据其中建议的方案，借助于R-PE缀合试剂盒(PJ31K，ProzymeInc.)制备包含抗肌钙蛋白单克隆抗体M06和藻红蛋白(PE)的缀合物。该缀合物在本文中被称为“缀合物M06-PE”。R-藻红蛋白或PE在实验室中作为基于荧光的指示剂用于在各种应用中标记抗体或其它分子。R-藻红蛋白在约566nm处强烈吸收，次峰在496和545nm处且在575nm处强烈发射。R-藻红蛋白是有史以来发现的最亮荧光染料之一。参见，例如，藻红蛋白-维基百科，免费的百科全书，其可在网站en.wikipedia.org/wiki/Phycoerythrin上通过HypertextTransferProtocol的方式获取和R-藻红蛋白(PB31)，ProZymeInc.，Hayward，CA，这两者均通过引用并入本文中。将每个校准品(100μL)与包被有抗肌钙蛋白单克隆抗体19C7(2.5μL，0.1%)的微粒和缀合物M06-PE(2μL，68nM)在96微孔玻璃底板中在室温下混合15分钟。玻璃底板用来降低自发荧光水平。然后将96微孔玻璃底板放置在磁铁(“DYNAL”“MPC”-96B)上以在洗涤步骤期间将附着于单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE复合物的微粒吸附到微孔的底部。在洗涤步骤中，将磷酸盐缓冲盐水(100μL)加入到每个微孔中，然后快速除去。重复该步骤两次。在最终的洗涤步骤后，将磷酸盐缓冲盐水(50μL)加入到每个微孔中，并将该板放置在配备有高分辨CCD相机(Hamamatsu型号C4742-80-12AG)的机动倒置荧光显微镜(OLYMPUS“1X81”)上。在附着于单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE复合物的微粒置于微孔底部后，用UPlanSApo20X物镜(OLYMPUS)在白色光通道和PE荧光通道拍摄附着于单克隆抗体-抗原-单克隆抗体复合物的微粒的图像。每个图像的可视面积大约为400微米×300微米且通常具有大约100个附着于单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE复合物的微粒。对给定微孔内的多个位置进行成像以提高统计分析。图6显示附着于单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE复合物的微粒的白光图像。图7显示附着于单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE复合物的微粒的荧光图像。白光图像用于定位附着于单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE复合物的每个单个微粒的位置，其是基于附着于单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE复合物的各个微粒与背景的对比。图8显示附着于单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE复合物的各个微粒的位置，其被定义为目标区域。目标区域包含图8中的光点。然后利用PE通道中的数字图像计算目标区域中每像素的荧光强度平均值。在图9中，存在明显小于微粒的斑点，其与目标区域不重叠。这些高荧光强度的斑点从缀合物M06-PE发出，所述缀合物M06-PE非特异性结合至微孔板的表面。将这些斑点从分析中排除。本文所述的成像和分析方法大大地降低了未从附着于单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE复合物的微粒发出的背景信号。所有校准品的强度值用于生成校准曲线。考虑到检测器的动态范围有限，校准品使用较短的曝光时间，其中分析物的浓度较高。图10显示10pg/mL至50,000pg/mL范围的校准品的校准曲线。图11显示0pg/mL至200pg/mL范围的校准品的放大校准曲线。在放大图中，也对每个校准品的图像总面积的每像素的荧光强度平均值进行绘图以用于对比。显而易见的是，使用图像的空间信息大大增加了曲线的斜率，从而提高了免疫测定的灵敏度。实施例2该实施例通过使用两种荧光染料，一种作为捕获抗体的标记，另一种作为检测抗体的标记，阐述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(或者在本文中被称为“NGAL”)的免疫测定。制备包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒。使用HBS-EP缓冲液制备94pM至0.7pM范围的一组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白校准品。制备包含抗NGAL单克隆抗体2322和荧光染料(Cy5)的缀合物以及包含抗NGAL单克隆抗体903和R-藻红蛋白(PE)的缀合物。Cy5荧光团标记的单克隆抗体2322在本文中被称为“缀合物2322-Cy5”。PE荧光团标记的单克隆抗体903在本文中被称为“缀合物903-PE”。单克隆抗体2322和单克隆抗体903是可以特异性结合至NGAL的单克隆抗体。单克隆抗体2322是人嵌合抗体，单克隆抗体903是小鼠抗体。包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒可直接结合至单克隆抗体2322。Cy5是花青染料家族的反应性水溶性荧光染料。Cy5是在电磁光谱红色区域(大约650nm或670nm)的荧光，但在电磁光谱的橙色区域(约649nm)吸收。Cy5也用来标记用于各种研究包括蛋白质组学和RNA定位的蛋白质和核酸。参见，例如，“TechnicalInformationonProbesConjugatedtoAffinity-PurifiedAntibodiesandtoOtherProteins:CyanineDyes(Cy2,Cy3,andCy5)”，其可在万维网jacsonimmuno.com/technical/f-cy3-5.asp网站以HypertextTransferProtocol的方式获取，其通过引用并入本文中。包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒被单克隆抗体903阻断。因为单克隆抗体903是一种小鼠单克隆抗体，所以它不应与包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒交叉反应。然而，当包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒用PE荧光团标记的单克隆抗体903孵育时，发现一些交叉反应性。如果包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒首先用单克隆抗体903处理，然后与PE荧光团标记的单克隆抗体903反应，则包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒与PE荧光团标记的单克隆抗体903的交叉反应性大大降低。对于从图像中目标区域计算的每像素的荧光强度平均值，经缀合物903-PE处理的包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒为336且先用单克隆抗体903处理，然后与缀合物903-PE反应的包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒为136。附加试验表明，用单克隆抗体903处理包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒不会降低分析物NGAL产生的信号。当NGAL的浓度比较高时，图像的背景信号的效果并不显著。表2显示使用(a)经单克隆抗体903处理的包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒和(b)未经处理的包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒的含有0pMNGAL的样品的荧光强度。经处理的包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒强度是未经处理的包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒强度的大约40%。表3显示使用经单克隆抗体903处理的包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒测量的含有300pMNGAL的样品的荧光强度和使用未经处理的包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒测量的含有300pMNGAL的样品的荧光强度。进行免疫测定的目的是确定使用单克隆抗体903作为阻断剂的功效，其采用与验证NGAL浓度所进行的免疫测定相同的方式进行。用比表1中表征的图像所使用的曝光时间更短的曝光时间测量图像。将包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒(1mL，0.01%)用单克隆抗体903(70nM)孵育15分钟。将如此处理的包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒用磁铁从反应混合物中分离，然后用HBS-EP缓冲液洗涤。然后将如此处理的包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒用HBS-EP缓冲液重组至0.01%的浓度。在具有96个微孔的微孔板的第一排微孔上，制备不同浓度的NGAL(94pM、47pM、23pM、12pM、6pM、3pM、1.5pM、0.7pM、0pM)。每个微孔含有100μL液体。将Cy5荧光团标记的单克隆抗体2322(25μL，2nM)和PE荧光团标记的单克隆抗体903(8μL，20nM)加入到板的第一排微孔中。将反应混合物在室温下孵育15分钟。将包被有抗人IgG单克隆抗体的微粒(25μL，0.01%)加入到第一排的每个微孔中。将反应混合物再孵育20分钟。附着于缀合物2322-Cy5：NGAL：缀合物903-PE复合物的微粒被吸引到磁铁上，然后用HBS-EP缓冲液洗涤三次。将样品转移到微孔板中，其中微孔具有玻璃底。将微孔板放置在荧光显微镜(OLYMPUS“lX81”)上，并采用与实施例1中所描述的相同方式在白色光通道、PE通道和Cy5通道中拍摄图像。基于附着于缀合物2322-Cy5：NGAL：缀合物903-PE复合物的个别微粒与背景之间的对比，白光图像用来定位附着于缀合物2322-Cy5：NGAL：缀合物903-PE复合物的个别微粒的位置。附着于缀合物2322-Cy5：NGAL：缀合物903-PE复合物的个别微粒的位置被定义为目标区域。通过设置Cy5通道的阈值对目标区域作进一步分析，借此仅附着于缀合物2322-Cy5：NGAL：缀合物903-PE复合物的微粒上的那些区域用于进一步分析，其中所述微粒具有特异性结合于附着于缀合物2322-Cy5：NGAL：缀合物903-PE复合物的微粒的Cy5荧光团标记的单克隆抗体2322。通过市售的计算机程序(“SLIDEBOOK”)计算PE通道的目标区域的每像素的荧光强度平均值。下表列出了在相应的曝光时间下各浓度的分析物的PE通道的每像素强度的平均值。曝光的三个不同时间用来增加试验的动态范围。表4曝光时间(ms)微粒数NGAL浓度(pM)每像素的平均强度(每像素计数)标准偏差(每像素计数)200176034252001870.72391232002251.46477202002752.92613232003235.858853820040111.716259020034223.42558195052511.7526105040523.4859235045846.81294955034293.75193152图12显示由表4中的数据生成的NGAL的校准曲线。图13显示极低浓度的校准品的校准曲线。三种不同的算法用来说明本发明的优点。算法2和算法3极大地提高了试验的灵敏度。算法1的数据在图中以实心圆(·)显示。计算PE通道中整个图像的强度平均值。不使用空间信息。该算法相当于测量总强度。算法2的数据在图中以实心正方形(■)显示。使用基于对比度的白光图像，将所有微粒选为目标区域。通过设置PE通道的阈值来降低目标区域的尺寸。任意选定截断值且等于PE通道的图像的荧光强度平均值加上或减去3倍标准偏差。然而，可能已使用其它截断值。算法3的数据在图中以空心正方形(□)显示。选定具有高于Cy5通道的阈值的强度的附着于单克隆抗体：抗原：单克隆抗体复合物的微粒上的区域，然后计算PE通道的荧光强度平均值。非特异性结合产生的信号减少。任意选定截断值且等于PE通道的图像的荧光强度平均值加上或减去3倍标准偏差。然而，可能已使用其它截断值。实施例3该实施例通过使用单一荧光染料作为检测抗体的标记，阐述肌钙蛋白的均相免疫测定。在一些免疫测定中，分析物的浓度在ng/mL的范围内，可以使用本文所述的方法进行均相免疫测定。简单地通过混合试剂和样品并做物理测量来进行这种免疫测定。均相免疫测定是可取的，因为它们容易进行。该实施例中使用的所有试剂和成像参数与实施例1中使用的那些相同。将每个校准品(100μL)与包被有抗肌钙蛋白单克隆抗体19C7的微粒(2μL，0.1%)和缀合物M06-PE(5μL，20nM)在96微孔玻璃底板中在室温下混合15分钟。玻璃底板用来降低自发荧光水平。然后将PBS(200μL)加入到每个微孔中以降低缀合物的浓度和降低背景的荧光强度。将该板放置在配有高分辨CCD相机(Hamamatsu型号C4742-80-12AG)的机动倒置荧光显微镜(OLYMPUS“1X81”)上。在附着于单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE复合物的微粒置于微孔底部后，用UPlanSApo20X物镜(OLYMPUS)在白色光通道和PE通道拍摄附着于单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE复合物的那些微粒的图像。基于附着于单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE复合物的个别微粒与背景的对比，图14中所示的白光图像用来定位附着于单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE复合物的每个单个微粒的位置。图15显示附着于单克隆抗体19C7：肌钙蛋白：缀合物M06-PE复合物的个别微粒的位置，其位置被定义为目标区域。然后利用PE通道中数字图像计算目标区域的每像素的荧光强度平均值，如图16所示。利用图像的空间信息使得有可能消除洗涤步骤并将试验简化为一步均相试验。图17显示该实施例中计算的校准曲线。虽然在该实施例中使用标准的落射荧光显微镜，但是优选共焦或TIRF(全内反射荧光)显微镜，因为这种类型的显微镜具有更好的z-平面分辨率，其能够消除来自微粒定位处的焦平面上方的信号，从而降低背景信号。测量前立刻进行稀释步骤(将缓冲液直接加入到反应混合物中)可以进一步降低来自过量抗体缀合物的荧光背景，从而提高试验的灵敏度。用于消除免疫测定中洗涤步骤的另一种方法涉及通过图像相关光谱(ICS)进行的分析。时空图像相关光谱(STICS)分析是ICS的延伸，其中获取样品的一系列图像。这些图像包括空间和时间信息；通过形成夹心复合物结合至微粒的缀合物是固定的，而过量的未结合的缀合物可在溶液中自由扩散。STICS分析可以将固定的缀合物群从扩散的缀合物群中分离。存在ICS的其他延伸，例如k-空间图像相关光谱(kICS)以及ICS的互相关版本(CCICS)。此外，通过对图像进行图像相关光谱(ICS)分析，能够获取关于样品的附加信息。例如，在诊断阿尔茨海默病时，能够使用ICS来定量图像中淀粉样蛋白斑的大小以及除去扩散中的分子。实施例4该实施例阐述本文所述的方法可如何用于检测DNA。在该情况下，分析物为DNA的靶序列且受体为与靶序列互补的DNA链。为了检测，使用具有与靶序列相同的序列的标记DNA链。DNA靶标的竞争性试验的原理示于图18中。在该实施例中，将固定在微粒上的单链DNA(ssDNA)与怀疑含有靶ssDNA的样品混合并孵育。该混合物还含有与靶ssDNA相同但具有荧光标记的ssDNA以用于测定DNA的浓度。附着于荧光标记的ssDNA将被靶ssDNA的存在阻断。因此，如果未检测到荧光，可推断样品含有足量的ssDNA从而完全阻断具有荧光标记的ssDNA。这种情况将表明阳性结果。另一方面，如果样品中不存在靶ssDNA分子，固定在微粒上的ssDNA将被具有荧光标记的ssDNA完全标记。图18中所示的反应混合物阐述了样品含有靶ssDNA但不足以完全阻断具有荧光标记的ssDNA的结合的情况。因此，靶ssDNA和具有荧光标记的ssDNA都将会存在且荧光强度将与样品中靶ssDNA的量成反比。在不脱离本发明的范围和精神下，本发明的各种修改和变化对本领域技术人员将变得显而易见，并且应当理解本发明不应被不适当地限制于本文所述的示例性实施方案。当前第1页1 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