一种化妆品中N‑亚硝基二乙醇胺的检测方法与流程

本发明涉及一种化妆品及原料中N-亚硝基二乙醇胺的检测方法。

背景技术：

N-亚硝胺化合物是一类强烈的化学致癌物质，能诱发多种动物的恶性肿瘤。化妆品作为日常用品，会长时间驻留在皮肤、毛发、指甲、口唇等部位，其安全性备受关注，化妆品中的N-亚硝胺受到国内外严格监控。目前，化妆品中最受关注的N-亚硝胺化合物是N-亚硝基二乙醇胺，作为根据国际癌症研究机构(IARC)的分类，N-亚硝基二乙醇胺归类于可能对人体致癌。由于化妆品中广泛采用二乙醇胺和三乙醇胺这两类物质作为化妆品中的保湿剂、pH平衡剂或与月桂酸混用作为化妆品中的乳化剂和分散剂使用，而二乙醇胺和三乙醇胺这两种通常物质在化妆品生产，存储以及流通环节中容易生成N-亚硝基二乙醇胺，因此化妆品中的N-亚硝基二乙醇胺的检测和控制受到国内外的广泛关注，我国在《化妆品卫生规范》中已明确将N-亚硝胺列为化妆品中的禁用组分。

N-亚硝基二乙醇胺是一种黄色粘稠的油状液体，属于不挥发性亚硝胺。由于化妆品中所含物质种类繁多，尤其是多含氮物质的含量远高于N-亚硝基二乙醇胺，因此在化妆品中的N-亚硝基二乙醇胺的检测具有一定难度。目前国内外开展一些针对不同化妆品的N-亚硝基二乙醇胺的检测方法，如气质联用、气相色谱、液相色谱法和液质联用法等。目前常采用的ISO/DIS15819-2013方法是液质联用方法，但该方法容易受到化妆品中的其它成分干扰，检出限高。

技术实现要素：

针对上述现状，本发明的目的是提供一种用于化妆品中的N-亚硝基二乙醇胺检测的前处理技术和分析方法，杂质峰少，基质干扰小，准确、灵敏度高，能够满足霜膏类，水剂类，香波类等不同类型化妆品中N-亚硝基二乙醇胺的检测。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：

(1)取3～5g化妆品至50mL标准具塞容量瓶中，加入0.9～1.5g的氨基磺酸胺和氯化钠混合物，加入5.4～9mL水和三氯甲烷混合溶液并经超声提取，得到超声提取液；

(2)取上述超声提取液，冷冻离心后，取3～5mL上清液放置于氮吹仪上氮气吹干，残渣用3～5mL的三氯甲烷和丙酮混合溶液溶解，过固相萃取柱，用6～10mL的三氯甲烷和丙酮混合溶液淋洗，6～10mL丙酮洗脱，收集洗脱液于试管中，氮气吹干，0.6～1mL甲醇溶解后用0.20μm微孔滤膜过滤，得到净化后的溶液于棕色色谱瓶中待用；

(3)通过气相色谱-热能分析仪联用方法测定步骤(2)所得净化后的溶液中的N-亚硝基二乙醇胺，气相色谱条件是：气相色谱柱采用中等极性色谱柱，载气为氦气；气相色谱柱温采用程序升温。

所述步骤(1)中加入的混合物氨基磺酸胺和氯化钠的质量比为1:2。

所述步骤(1)中水和三氯甲烷混合溶液的体积比为5:4。

所述步骤(1)中水为电阻率大于18MΩ*cm的超纯水。

所述步骤(2)的冷冻离心条件为：冷冻温度4℃，转速12000r/min，离心时间15～20min。

所述步骤(2)中用于溶解残渣和淋洗的三氯甲烷和丙酮混合溶液的体积比为5:1。

所述步骤(2)中的固相萃取柱为填装2～3硅胶和顶部填装3～5g经活化后无水硫酸钠的玻璃填充柱。

所述步骤(3)中检测条件为，气相色谱仪：进样口温度250℃，进样量2μL，隔垫吹扫15mL/min，色谱柱采用中等极性色谱柱，载气流速2.1mL/min，气相色谱柱温采用程序升温：初始温度150℃保持10min，10℃/min升至230℃保持2min，250℃保持3min；热能分析仪检测仪的条件为：接口温度250℃，裂解器温度600℃，臭氧流量10mL/min，冷却温度-20℃，电压760V。

本发明有益效果：本发明涉及与人直接接触的化妆品中所含的N-亚硝基二乙醇胺，建立了气相色谱—热能分析仪联用检测方法。本发明对化妆品中所含的N-亚硝基二乙醇胺的检出限为20μg/kg，方法回收率为87～105％，相对标准偏差小于10％。该发明杂质干扰小，回收率高，方法稳定，能够为化妆品中N-亚硝基二乙醇胺的检测和产品质量控制提供技术方法支持，能够满足霜膏类，水剂类，香波类等不同类型化妆品中N-亚硝基二乙醇胺的检测。

附图说明

图1为本发明样品处理流程图；

图2为化妆品中N-亚硝基二乙醇胺，(a)为硅胶层析柱前，(b)为硅胶层析柱后。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例详细介绍本发明。但以下的实施例仅限于解释本发明，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，不仅仅限于本实施例。

本发明实施例的步骤是：将化妆品利用水和三氯甲烷混合溶液在超声条件下将N-亚硝基二乙醇胺从样品中萃取出来，经过高速冷冻离心后，硅胶柱进行净化，丙酮洗脱液后用甲醇溶解过滤后得到的溶液用气相色谱-热能分析仪联用法进行检测，能够有效检测出水溶性或脂溶性化妆品中的N-亚硝基二乙醇胺。具体如下：

1、试剂和材料

除另外说明，所用试剂均为分析纯。

1.1N-亚硝基二乙醇胺(N-Nitrosodiethanolamine)：纯度大于97％；

1.2水：超纯水；

1.3二氯甲烷：色谱级；

1.4甲醇；

1.5氨基磺酸胺；

1.6氯仿；

1.7氦气：浓度99.999％

1.8氧气：浓度99.999％

1.9丙酮；

1.10无水硫酸钠；

1.11硅胶；

1.12N-亚硝基二乙醇胺标准液：称取N-亚硝基二乙醇胺1mg(精确至0.0001g)标准品，置于10mL棕色容量瓶中，加入甲醇至刻度，超声10min帮助溶解，该溶液浓度为：100μg/mL，-20℃下避光保存，保质期3个月；

2、仪器和设备

2.1气相色谱：配有分流/不分流进样口；

2.2天平：感量0.0001g；

2.3冷冻离心机：转速不低于12000r/min，冷冻温度不低于0℃；

2.4超声波水浴仪

2.5氮吹仪

2.6双性滤膜

2.7热能分析仪检测仪：配置热裂解器，裂解温度不低于600℃；

3、实施步骤，如图1所示。

3.1提取

取5g(精确至0.0001g)样品于50mL具塞锥形瓶中，加入氨基磺酸胺0.5g(精确至0.0001g)和氯化钠1g(精确至0.0001g)，加入5mL超纯水和4mL三氯甲烷，室温下超声提取30分钟后转移至15mL离心管，在4℃下12000r/min冷冻离心15min，用5mL移液管移取5mL上清液到试管中，放置于氮吹仪上氮气吹干，残渣用5mL三氯甲烷和丙酮(体积比5:1)混合溶液溶解后待净化。

3.2净化

制作硅胶层析柱：硅胶和无水硫酸钠在110℃下烘干活化10小时后于干燥器中保存。制作硅胶层析柱时，称取3g活化后的硅胶干法装填于玻璃层析柱中，玻璃棒敲实，顶层加入5g活化后无水硫酸钠，敲实。

将3.1待净化的液体转移至硅胶层析柱。用10mL三氯甲烷和丙酮(体积比5：1)溶液淋洗，10mL丙酮洗脱，收集洗脱液于试管中，氮气吹干，移液器移取1mL甲醇溶解残渣，0.20μm微孔滤膜过滤于2mL棕色色谱瓶中，在-20℃下避光保存待进样。

硅胶层析柱净化可以有效消除化妆品中杂质干扰，见图2，(a)为硅胶层析柱前，(b)为硅胶层析柱后，可以看出经过硅胶层析柱净化后的色谱图中只有N-亚硝基二乙醇胺信号。

3.3测定

3.3.1气相色谱条件

考虑不同型号气相色谱仪，下述给出气相色谱分析时通用技术条件。

1)色谱柱：DB-624石英毛细管柱，30m×0.32mm(i.d.)×1μm；

2)柱温采用程序升温：初始温度150℃保持10min，10℃/min升至230℃保持2min，250℃保持3min；

3)载气：氦气

4)载气流速：2.1mL/min；

5)进样口温度：250℃；

6)进样量：2μL；

7)隔垫吹扫15mL/min。

3.3.2热能分析仪分析条件

1)接口温度：250℃；

2)裂解器温度：600℃；

3)氧气流速：10mL/min；

4)冷却温度：-15℃；

5)探测器电压：760V。

3.3.3N-亚硝基二乙醇胺标准曲线

采用准确标准溶液(100μg/mL)配制成浓度为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL的N-亚硝基二乙醇胺溶液，分别取2μL在上述仪器实验条件下进行测定，以峰面积对浓度绘制标准曲线。

3.3.4N-亚硝基二乙醇胺含量计算方法

本发明采用外标法，计算公式如式(1)

式中W：化妆品中的N-亚硝基二乙醇胺的质量分数(单位：毫克每千克；mg/kg)；

c：通过标准曲线得到的样品中N-亚硝基二乙醇胺的浓度(单位：毫克每升；mg/L))

V：样品定容体积(单位：升；L)

m：样品质量(单位：克；g)

4、方法的线性方程和检出限

采用准确标准溶液(100μg/mL)配制成浓度为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL的N-亚硝基二乙醇胺溶液，分别取2μL在上述仪器实验条件下进行测定，以峰面积(Y轴)对浓度(X轴)绘制标准曲线，得出线性方程。

表一：N-亚硝基二乙醇胺标准曲线

5、方法的回收率和精密度

回收率测试，设定三个添加浓度按照上述的样品前处理方法以及实验条件测定，每个浓度进行6次测试，并计算方法的回收率和精密度。结果回收率87～105％。，计算精密度(相对标准偏差RSD)小于10％，结果见表二。

表二：N-亚硝基二乙醇胺的不同加标回收率和精密度

6、结论

针对本发明涉及与人直接接触的化妆品中所含的N-亚硝基二乙醇胺，建立了气相色谱—热能分析仪联用检测方法。通过对不同样品回收率，精密度测试，该方法对化妆品中所含的N-亚硝基二乙醇胺的检出限为20μg/kg，方法回收率为87～105％，相对标准偏差小于10％。该发明杂质干扰小，回收率高，方法稳定，能够为化妆品中N-亚硝基二乙醇胺的检测和产品质量控制提供技术方法支持。

需要说明的是，按照本发明上述实施例，本领域技术人员是完全可以实现本发明独立权利要求及从属权利的全部范围的，实现过程及方法同上述实施例。且本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，对本发明做出的各种变化和改进应都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同界定。