本发明涉及一种望天树叶片蛋白质组分析样品的制备方法，尤其适用于制备望天树叶片双向电泳总蛋白样品。
背景技术：
：望天树(ParashoreachinensisWangHsie)为龙脑香科(Dipterocarpaceae)柳桉属(Parashorea)乔木，属国家一级保护植物。望天树生长迅速，树体高大，寿命长，干形圆满，材质坚硬，耐腐性强，纹理较直，结构均匀，而且创切面光洁，加工性能良好，适宜作建筑、造船、高级家具和人造板等用材，用途非常广泛，具有较高的开发与推广价值。由于近年来人类的生产经营活动频繁，自然生境破坏等原因，自然分布范围变得极其狭窄，数量稀少，局部已受不同程度的毁坏，以至陷入濒危的境地，亟待进行相关的研究以加强保护利用。目前，国内对望天树在分类学、形态学、生态学、引种繁殖、资源利用等方面进行了一定的研究，但对望天树环境的适应性及代谢调控机理的研究尚未见报道。差异蛋白质组学是蛋白质组学研究的一个重要内容，主要是筛选和鉴定不同种类或状态下各样本之间蛋白质组的不同与变化，实现对体系内代谢调控的动态监测，揭示细胞对外界环境刺激的反应途径以及调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析，从而揭示机体对内外界环境变化产生的反应。双向电泳是研究蛋白质组学一个重要技术手段，目前珍贵树种蛋白质组学方面的研究很少。建立一种简便、快速和高效提取望天树叶片蛋白质、获得蛋白质点的双向电泳图谱，对开展环境变化下望天树关键差异蛋白质的鉴定，揭示望天树差异蛋白的代谢调控功能和途径具有重要意义，从而为望天树种质资源的抗逆性和迁地保护提供科学依据。技术实现要素：为了获得望天树叶片的总蛋白质及双向电泳图谱，本发明提供一种望天树叶片蛋白质组分析样品的制备方法，采用该方法蛋白质提取效率高、双向电泳图谱清晰，对望天树叶片总蛋白质的提取和检测方法进行了优化。本发明通过以下技术方案达到上述目的，一种望天树叶片蛋白质组分析样品的制备方法，包括以下步骤：(1)取新鲜望天树幼苗叶片液氮冷却5min后,研磨成泛白的粉末，将粉末转移到预冷离心管中并加入预冷的TCA-丙酮溶液，在快速混匀机上涡旋混合均匀，(2)离心后保留沉淀，加入预冷的乙酸铵－甲醇溶液，混匀后离心，保留沉淀，干燥以去除残留的丙酮；(3)向沉淀中加入Tris平衡酚和SDS缓冲液，混合均匀后离心；(4)吸取上层酚层到新的离心管中，加入预冷的乙酸铵－甲醇溶液，混匀后于-20℃静止1h，离心，保留沉淀；(5)再将沉淀用预冷的甲醇和80％的丙酮各洗涤2次，离心二次，即得到蛋白样品；(6)置于-20℃下干燥得到的蛋白干粉；(7)向粉末中加入裂解液，在快速混匀机上涡旋均匀后，离心，取上清液，计算蛋白体积，分装保存，测定提取液中蛋白质浓度。一种望天树叶片蛋白质组分析样品的制备方法，具体步骤为：(1)取望天树新鲜叶片3.0g，放入液氮中冷却5min，然后再放入研钵中加入液氮磨成泛白的粉末，将粉末转移到预冷的50ml的离心管中，再加入-20℃预冷的10％TCA-丙酮溶液，在快速混匀机上涡旋混合均匀，4℃18000rpm离心13min；(2)离心后保留沉淀，并在沉淀中加入预冷的0.1mol/l乙酸铵80％的甲醇溶液，混合均匀，4℃18000rpm离心13min，保留沉淀，超净工作台上干燥30min，去除残留的丙酮；(3)沉淀中加入Tris平衡酚(Solarbio公司试剂盒)和SDS缓冲液，二种试剂比例为1：1，混合均匀，超净工作台上放置5min，4℃18000rpm离心13min；(4)吸取上层酚层到新的50ml离心管中，并加入5倍体积的预冷0.1mol/l乙酸铵80％的甲醇溶液，混合均匀，-20℃静止1h，4℃20000rpm离心15min，保留沉淀；(5)再将沉淀用预冷的甲醇和80％的丙酮各洗涤2次，即得到蛋白样品；(6)将蛋白样品转移至1.5ml离心管中，然后置于-20℃下干燥，最后将得到的蛋白干粉置于-80℃超低温冰箱中保存待用；(7)从冰箱中取出蛋白质干粉，进行蛋白质定量，向蛋白干粉中加入裂解液，在快速混匀机上涡旋均匀后，放在37℃恒温水浴锅中30min，常温下12000rpm离心10min，吸取上清到1.5ml离心管，利用Solarbio公司的Bradford蛋白浓度测定试剂盒用Brafford法测定样品中蛋白质含量，建立标准曲线；(8)采用GE公司的EttanIPGphor3进行第一向等电聚焦、EttanDALTsix进行第二向SDS垂直电泳，电泳仪为EPS601，获得望天树叶片总蛋白的双向电泳凝胶；(9)电泳结束后，剥下胶板，放入染色液中于室温摇床，用考马斯亮兰法染色2h后，用30％乙醇+10％乙酸进行脱色至背景清晰，脱色后的凝胶用蒸馏水冲洗3次，获得望天树叶片总蛋白双向电泳凝胶，采用AmershamImager600获得双向电泳图谱，观察蛋白质点制备质量。采用本发明能够提高望天树叶片蛋白质提取效率，可获得蛋白点清晰、数目较多、分布均匀、背景清楚的高质量双向电泳凝胶图谱。附图说明图1是本发明所述的望天树叶片总蛋白的双向电泳图谱。具体实施方式下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。实施例1对比酚-甲醇/乙酸铵沉淀法、TCA-丙酮沉淀法法提取望天树叶片总蛋白的提取效率。1.酚-甲醇/乙酸铵沉淀法取望天树新鲜叶片3.0g，放入液氮中冷却5min，然后再放入研钵中加入液氮磨成泛白的粉末，将粉末转移到预冷的50ml的离心管中，再加入-20℃预冷的10％TCA-丙酮溶液，在快速混匀机上涡旋混合均匀，4℃18000rpm离心13min；离心后保留沉淀，并在沉淀中加入预冷的0.1mol/l乙酸铵80％的甲醇溶液，混合均匀，4℃18000rpm离心13min，保留沉淀；超净工作台上干燥30min，去除残留的丙酮；沉淀中加入Tris平衡酚(Solarbio公司试剂盒)和SDS缓冲液，二种试剂比例为1：1。混合均匀，超净工作台上放置5min，4℃18000rpm离心13min；吸取上层酚层到新的50ml离心管中，并加入5倍体积的预冷0.1mol/l乙酸铵80％的甲醇溶液，混合均匀，-20℃静止1h，4℃20000rpm离心15min，保留沉淀；再将沉淀用预冷的甲醇和80％的丙酮各洗涤2次，即得到蛋白样品；将蛋白样品转移至1.5ml离心管中，然后置于-20℃下干燥，最后将得到的蛋白干粉置于-80℃超低温冰箱中保存待用。2.TCA-丙酮沉淀法取新鲜望天树叶片3.0g，先用锡箔纸包好，放入液氮中5min，然后再放入研钵中加入0.1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和0.4g二流苏糖醇(DTT)，液氮研磨成泛白的粉末，将粉末转移到预冷的50ml的离心管中，加入10ml-20℃10％TCA-丙酮溶液(-20℃保存)，混合均匀，-20℃静置过夜，4℃18000rpm离心8min，保存沉淀；沉淀中再加入15ml预冷丙酮，-20℃静置1h,4℃20000rpm离心15min，重复3次，即得到蛋白样品；将蛋白样品转移至1.5ml离心管中，然后置于-20℃下干燥，最后将得到的蛋白干粉置于-80℃超低温冰箱中保存待用。3.蛋白定量对上述2种方法提取的望天树叶片总蛋白定量。配制的裂解液成份为7M尿素、2M硫脲、2％(w/v)CHAPS、40mMDTT、5mMEDTA-Na2、1％(w/v)IPGbuffer、蛋白酶抑制剂。从冰箱中取出蛋白质干粉，在提取的蛋白干粉中加入裂解液，在快速混匀机上涡旋均匀后，放在37℃恒温水浴锅中30min，常温下12000rpm离心10min，吸取上清到1.5ml离心管，-80℃保存。利用Solarbio公司的Bradford蛋白浓度测定试剂盒对蛋白质进行浓度测定。酚-甲醇/乙酸铵法是TCA-丙酮沉淀法提取量的1.9倍。检测结果见表1。表1不同提取方法望天树叶片总蛋白质含量单位：μg/μL提取方法重复一重复二重复三平均值酚-甲醇/乙酸铵法12.10111.84311.32611.757TCA-丙酮沉淀法6.0117.6765.1646.284实施例2对酚-甲醇/乙酸铵法提取的蛋白质样品，进行双向电泳，脱色后获后凝胶图谱。1.采用GE公司的EttanIPGphor3进行第一向等电聚焦、EttanDALTsix进行第二向SDS垂直电泳，电泳仪为EPS601，获得望天树叶片总蛋白的双向电泳凝胶。(1)采用pH3-10NL(13cm)的非线性胶条进行第一向等电聚焦，上样量为250μL，蛋白含量650μg。(2)第一向等电聚集的程序设置：最大电流0.05mA/胶条，电压和时间设置顺序为：50V，0.5hr；100V，0.5hr；300V，1hr；500V，1hr；1000V，1hr；5000V，3hr；5000V－30000V，1hr；1000V，不超过24h。(3)第二向SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为13％。先将电泳仪功率设为1W，1h后设功率为12W，待溴酚蓝到达凝胶底部结束电泳。(4)第二向SDS-PAGE电泳结束后，剥下胶板，放入染色液中于室温摇床，用考马斯亮兰法染色2h后，用30％乙醇+10％乙酸进行脱色至背景清晰。脱色后的凝胶用蒸馏水冲洗3次，获得望天树叶片总蛋白双向电泳凝胶，采用AmershamImager600成像仪获得双向电泳图谱，观察蛋白质点制备质量。望天树叶片总蛋白的双向电泳图谱见图1。当前第1页1 2 3