一种大黄蛰虫丸的指纹图谱检测方法与流程

本发明涉及一种中药制剂的指纹图谱检测方法，具体涉及大黄蛰虫丸的指纹图谱检测方法。

背景技术：

大黄蛰虫丸由熟大黄、土鳖虫(炒)、水蛭(制)、虻虫(去翅足，炒)、蛴螬(炒)、干漆(煅)、桃仁、苦杏仁(炒)、黄芩、地黄、白芍、甘草十二味中药制成，具有活血破瘀，通经消痞的药理作用。该复方药味复杂，含有黄酮类、蒽衍生物类、苯丁酮、苷类、鞣质类等主要化学成分。大黄蛰虫丸含有的药物成分比较多，既有极性小的蒽醌类成分，又有糖苷、鞣质等极性大的化合物，保留时间相差较大，现有技术的分析方法不能全面、客观的检测和评价大黄蛰虫丸的质量。

技术实现要素：

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种大黄蛰虫丸的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价大黄蛰虫丸的质量，对控制大黄蛰虫丸的内在质量与保证临床疗效具有重要意义。

技术方案：为了实现以上技术目的，本发明采取的技术方案为：

一种大黄蛰虫丸的指纹图谱检测方法，该指纹图谱检测方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液制备：取大黄蛰虫丸粉末，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇或乙醇，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤取滤液，制成供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取芍药苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、毛蕊花糖苷对照品，用甲醇或乙醇溶解，分别配置成适宜浓度的对照品储备液；

(3)高效液相色谱法测定本品的对照指纹图谱：取5～10批大黄蛰虫丸供试品在适当的色谱条件下进样，测得各批次供试品的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为本品的对照指纹图谱；

(4)取对照品溶液按步骤(3)相同的色谱条件进样，测得各对照品溶液的高效液相图谱；

(5)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)供试品溶液按步骤(3)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱；并根据步骤(4)所得对照品溶液的高效液相图谱归属各色谱峰；

(6)将步骤(5)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(3)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价。

作为优选方案，以上所述的大黄蛰虫丸的指纹图谱检测方法，步骤(3)色谱柱：Thermo C18色谱柱(规格)流动相：A相甲醇-B相0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长270nm；柱温：30℃；进样量10μL。

作为更优选方案，以上所述的大黄蛰虫丸的指纹图谱检测方法，步骤(3)梯度洗脱程序如下表：

作为更优选方案，以上所述的大黄蛰虫丸的指纹图谱检测方法，步骤(1)中供试品溶液制备方法为：取大黄蛰虫丸粉末1g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声提取40min，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤取滤液，制成供试品溶液。

作为更优选方案，以上所述的大黄蛰虫丸的指纹图谱检测方法，其特征在于，步骤(2)对照品溶液的制备：精密称取芍药苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和毛蕊花糖苷对照品各2g，用甲醇溶解，分别配置成1mg/mL的对照品储备液。

作为优选方案，以上所述的大黄蛰虫丸的指纹图谱检测方法，大黄蛰虫丸由熟大黄300g、土鳖虫(炒)30g、水蛭(制)60g、虻虫(去翅足，炒)45g、蛴螬(炒)45g、干漆(煅)30g、桃仁120g、苦杏仁(炒)120g、黄芩60g、地黄300g、白芍120g和甘草90g制成。如选用北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产的国药准字Z11020002的大黄蛰虫丸。以上指纹图谱Ⅰ的色谱条件优化实验：

色谱条件的筛选：

一、色谱柱选择

本发明分别考察了Thermo C18色谱柱((250mm×4.6mm i.d.，5μm)、Tigerkin C18柱(250mm×4.6mm i.d.，5μm)、Waters Atiantis T3(250mm×4.6mm i.d.，5μm)色谱柱对大黄蛰虫丸的分离效果。结果表明，Thermo C18色谱柱((250mm×4.6mm i.d.，5μm)柱对极性差异较大的化合物有很好的保留，故选择Thermo C18色谱柱((250mm×4.6mm i.d.，5μm)为指纹图谱分析用色谱柱。

二、检测波长选择

本发明对大黄蛰虫丸的甲醇提取液进行液相全波长扫描，在200nm～400nm处均有显著的吸收，在270nm处吸收最为强烈，因此采用HPLC/UV方法270nm进行分析。

三、流动相体系选择

由于大黄蛰虫丸含有的由于活性成分比较多，既有极性小的黄酮类、蒽醌类成分，又有糖苷、鞣质等极性大的化合物，保留时间相差较大，为了保证在合适的分析时间内色谱峰达到较好的分离，本发明分别考察了甲醇-水、甲醇-0.05﹪甲酸溶液、甲醇-0.1﹪甲酸、甲醇-0.05﹪磷酸、甲醇-0.1﹪磷酸溶液对分离的影响，结果表明甲酸浓度0.1﹪时色谱峰峰型对称、分离良好，故选择甲醇-0.1﹪甲酸溶液(V/V)为色谱分离用流动相体系。

四、柱温选择

本发明分别考察了25℃、30℃、35℃、40℃和45℃柱温条件下对分离的影响，结果：柱温在30℃时，各成分分离度较好。色谱分析柱温选择30℃。

五、流速的选择

本发明分别考察了0.5ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min的流速对分离的影响，结果：以1.0ml/min的流速分离效果较佳。

六、流动相梯度选择

本发明考察了不同梯度洗脱条件对分离的影响，结果以下述优选的流动相梯度为佳，故选定该梯度为指纹图谱分析的色谱条件，

以上指纹图谱Ⅰ的方法学验证

1.1精密度实验

取同一供试品溶液在上述优选色谱条件下连续测定6次,计算指纹峰的保留时间和峰面积的RSD值,相对保留时间RSD分别为0.18％、0.19％、0.16％、0.12％、0.10％、0.13％、0.12％、0.12％、0.11％，各色谱峰相对保留时间稳定,各主要色谱峰相对峰面积基本一致,RSD小于3％

1.2重复性实验

平行取6份供试品溶液，按上述优选色谱条件进样测定，计算指纹峰的保留时间和峰面积的RSD值,结果相对保留时间RSD为0.39％、0.37％、0.37％、0.31％、0.27％、0.25％，峰面积RSD值1.67％、1.57％、2.50％、1.30％、1.57％、1.67％。

1.3稳定性实验

取同一供试品溶液在上述条件下,分别在0、2、4、8、12、24h测定其指纹图谱，各色谱峰保留时间RSD分别是0.38％、0.46％、0.49％、0.44％、0.43％、0.46％、0.39％、0.37％、0.35％各主要色谱峰,相对峰面积RSD分别是2.85％、2.60％、2.68％、2.53％、2.43％、2.99％、2.24％、2.25％、2.42％。

1.4延长冲洗实验

取供试品溶液进样，在梯度结束后以甲醇冲洗1h，没有出现其他色谱峰。

本发明将供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算机相似度评价软件(选用中国药典委推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件2004A版”)计算，获得指纹图谱相似度数值，依据相似度数值，应用于大黄蛰虫丸的质量控制，以指纹图谱相似度应大于0.90为检验质控标准。本发明提供的大黄蛰虫丸的指纹图谱检测方法用于生产检验质量控制，所得产品具有较高的质量稳定性，可确保产品安全有效。

有益效果：本发明提供的中药大黄蛰虫丸的指纹图谱检测方法具有以下优点：

本发明针对现有技术检测方法的诸多不足，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的检测方法，可建立良好的指纹图谱。采用本发明提供的大黄蛰虫丸指纹图谱检测方法，可以同时检测大黄蛰虫丸中极性差异较大的多种活性成分，从而可以全面、客观、准确的检测和评价大黄蛰虫丸的质量，为保证临床疗效具有重要意义。

附图说明

图1为本发明大黄蛰虫丸的对照指纹图谱。

图2为6个批次大黄蛰虫丸的指纹图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

一种大黄蛰虫丸的指纹图谱检测方法，所述指纹图谱检测方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液制备：取大黄蛰虫丸粉末1g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声提取45min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤取滤液，制成供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取芍药苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、毛蕊花糖苷对照品各2g，用甲醇溶解，分别配置成1mg/mL的对照品储备液；

(3)高效液相色谱法测定本品的对照指纹图谱：取6批大黄蛰虫丸供试品在适当的色谱条件下进样，测得各批次供试品的指纹图谱，以这些指纹图谱为基础，用相似度软件计算获得共有模式作为本品的对照指纹图谱(如图1所示)；

(4)取对照品溶液按步骤(3)相同的色谱条件进样，测得各对照品溶液的高效液相图谱；

(5)高效液相色谱法测定供试品溶液指纹图谱：取步骤(1)供试品溶液按步骤(3)相同的色谱条件进样，测得供试品溶液的指纹图谱(如如图2所示)；并根据步骤(4)所得对照品溶液的高效液相图谱归属各色谱峰(图2中峰1为黄芩苷，峰2为黄芩素，峰3为大黄酸，峰4为大黄素，峰5为大黄酚，峰6为大黄素甲醚)；

(6)将步骤(5)得到的供试品溶液指纹图谱和步骤(3)得到的对照指纹图谱用相似度软件评价(如表1)。

以上所述的大黄蛰虫丸的指纹图谱检测方法，步骤(3)色谱柱：Thermo C18色谱柱(规格)流动相：A相甲醇-B相0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长270nm；柱温：30℃；进样量10μL。梯度洗脱程序如下表：

表1 6批大黄蛰虫丸指纹图谱相似度评价结果

通过以上实验结果表明，本发明提供的大黄蛰虫丸的指纹图谱检测方法，可以客观，全面，有针对性的分析和评价大黄蛰虫丸成品的质量，对保证临床疗效具有重要意义，本发明提供的指纹图谱检测方法，较现有技术单类成分分析，取得了明显的技术进步。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。