含磷毒剂检测用凝胶光子晶体、制备方法及应用与流程

本发明涉及含磷毒剂检测领域，具体而言，涉及含磷毒剂检测用凝胶光子晶体、制备方法及应用。

背景技术：

凝胶光子晶体是一种结合了光子晶体与智能水凝胶的特性而发展出的新型敏感材料。凝胶光子晶体中的水凝胶对外界环境变化产生响应，带动凝胶内光子晶体的晶格常数发生变化，从而产生相应的衍射光谱变化。基于此特性，凝胶光子晶体可应用于各类生化传感器件中，具有检测操作简单、可小型化的特点，常见有葡萄糖、温度、金属离子的检测等。

含磷毒剂是一类剧毒的有机膦酸酯类化合物，包括沙林(sarin，gb)、梭曼(soman，gd)、塔崩(tabun，ga)，维埃克斯(vx)等。含磷毒剂毒性极强，是一类活性很强的胆碱酯酶(ache)抑制剂，能造成胆碱能神经系统功能障碍，使生物体丧失机能甚至死亡。

如果将酶固化于凝胶光子晶体，就能够将酶的专一识别特性与凝胶光子晶体相结合，从而开发出以酶作为鉴别元件、并以凝胶光子晶体作为显示元件的生化传感器，而这也为含磷毒剂的痕量、快速检测提供了新的可能性。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种含磷毒剂检测用凝胶光子晶体的制备方法，本发明方法中，通过首先制备官能化的凝胶光子晶体，再通过对凝胶光子晶体化学修饰和固化，并将胆碱酯酶固化于凝胶光子晶体，从而可以使得固化后的凝胶光子晶体能够对含磷毒剂具有高灵敏度和高选择性的响应，并能够用于含磷毒剂的检测。本发明方法具有制备方法操作步骤简单便捷，所制得的凝胶光子晶体检测灵敏度高等优点。

本发明的第二目的在于提供一种含磷毒剂检测用凝胶光子晶体，所述凝胶光子晶体由本发明方法制备得到，具有对含磷毒剂响应灵敏度高、选择性好等优点。

本发明的第三个目的在于提供所述含磷毒剂检测用凝胶光子晶体的应用，本发明凝胶光子晶体对于含磷毒剂响应的灵敏度高且选择性好，因而能够痕量、快速的检测含磷毒剂。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

含磷毒剂检测用凝胶光子晶体制备方法，所述方法包括如下步骤：

苯乙烯乳液聚合制备单分散聚苯乙烯微球，得到含有聚苯乙烯微球的乳液；以离子交换树脂对乳液进行处理，然后加入丙烯酰胺预聚液并混合，然后原位聚合，得到聚苯乙烯-聚丙烯酰胺凝胶光子晶体；

将凝胶光子晶体以碱液处理后，浸入胆碱酯酶溶液中并预培养；然后向预培养后的凝胶光子晶体中，加入缩合剂和溶有胆碱酯酶的固化试剂，并缩合反应；然后，将缩合反应后的凝胶光子晶体放入缓冲溶液中进行培养，即得到含磷毒剂检测用凝胶光子晶体。

可选的，本发明中，所述单分散聚苯乙烯微球为粒径为100～300nm的单分散聚苯乙烯微球。

可选的，本发明中，所述原位聚合具体为：将离子交换处理后的乳液和丙烯酰胺预聚液混合后所得混合溶液扩散分布于基底膜片表面，然后将膜片置于紫外光下，并低温原位聚合1～5h。

可选的，本发明中，所述预培养的时间为24～72h。

可选的，本发明中，所述缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和/或3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮。

可选的，本发明中，所述溶有胆碱酯酶的固化试剂为溶有鸭血清胆碱酯酶的tris-hcl缓冲溶液。

可选的，本发明中，所述缩合反应的温度为20～25℃。

可选的，本发明中，所述缓冲溶液为tris-hcl缓冲溶液。

同时，本发明还提供了由本发明方法所制得的含磷毒剂检测用凝胶光子晶体。

进一步的，本发明也提供了由本发明方法所制得的含磷毒剂检测用凝胶光子晶体在检测含磷毒剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明方法中，通过将光子晶体技术与智能水凝胶相结合，制备得到了凝胶光子晶体新型材料。这种新型材料中，在凝胶光子晶体上固化了碱酯酶，从而使其具备凝胶光子晶体与生物酶两种材料的优点。

进一步的，本发明固化胆碱酯酶的凝胶光子晶体对含磷类毒剂具有专一性的结合性能，胆碱酯酶的丝氨酸位点与含磷毒剂结合形成一种稳定的阴离子四面体物质，膦酰化酶的阴离子电性改变凝胶光子晶体的唐南平衡，使凝胶内部渗透压增大，凝胶溶胀吸水，直接用光谱仪检测，凝胶光子晶体衍射峰波长发生变化。而这也使得固化了胆碱酯酶的凝胶光子晶体能够实现痕量、快速、方便检测含磷毒剂的目的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为不同缩合剂对固化胆碱酯酶后凝胶光子晶体衍射峰波长影响的对照光谱图；

图2为不同浓度底物的水解速率图；

图3为凝胶光子晶体对沙林水溶液响应光谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

在本发明的一个优选方案中，所述聚苯乙烯微球为粒径为100～300nm，且具有高电性和单分散性的聚苯乙烯微球。进一步的，本发明中，通过采用离子交换树脂对包含聚苯乙烯微球的乳液进行处理，可以使得聚苯乙烯微球能够通过自组装得到具有三维周期性的晶体胶体阵列。

在本发明的一个优选方案中，所述将离子交换处理后的乳液和丙烯酰胺预聚液混合后所得混合溶液扩散分布于基底膜片表面，具体为：通过溶液的虹吸扩散作用，将混合溶液在石英玻璃膜片表面布满。

在本发明的一个优选方案中，所述预培养的时间可以为，但不限于36、48、60或者72h等。

在本发明的一个优选方案中，所述碱为氢氧化钠。进一步的，本发明中，通过以碱对聚苯乙烯-聚丙烯酰胺凝胶光子晶体进行处理，从而可以将聚丙烯酰胺骨架上的酰胺基团通过反应转化为羧基，而这些羧基能够进一步在缩合反应中，在固化剂的作用下与胆碱酯酶上的氨基反应，从而将胆碱酯酶固化于凝胶光子晶体。

在本发明的一个优选方案中，所述缩合反应的时间为1～5h，例如，所述缩合反应的时间可以为，但不限于2、3或者4h等。

在本发明的一个优选方案中，所述将缩合反应后的凝胶光子晶体的培养，具体为：将缩合反应后的凝胶光子晶体放入tris-hcl缓冲溶液中并培养24～72h，例如所述培养的时间可以为，但不限于36、48或者60h等。进一步的，本发明中，通过将缩合反应后的凝胶光子晶体在缓冲溶液中进行培养，从而可以通过培养将反应后未固化的胆碱酯酶交换出来。

在本发明的一个优选方案中，本发明还进一步包括将制得的含磷毒剂检测用凝胶光子晶体置于缓冲溶液中待用的步骤。

在本发明的一个优选方案中，本发明所述含磷毒剂为沙林、梭曼、塔崩、维埃克斯、对硫磷、甲拌磷等中的一种。

在本发明的一个优选方案中，所述含磷毒剂检测方法如下：将含磷毒剂检测用凝胶光子晶体置于含磷毒剂溶液中进行检测，并采集平衡后凝胶光子晶体的光谱图。

进一步优选的，本发明中，所述含磷毒剂为沙林；进一步的，所述沙林的检测方法如下：将凝胶光子晶体置于10^-9mg/ml沙林溶液中进行检测，并采集平衡后凝胶光子晶体的光谱图。

进一步的，本发明含磷毒剂检测用凝胶光子晶体制备方法的整体制备流程具体如下：

苯乙烯乳液聚合制得粒径为100～300nm的单分散聚苯乙烯微球，并得到含有聚苯乙烯微球的乳液；以离子交换树脂对乳液进行处理，然后加入丙烯酰胺预聚液并混合，并所得混合溶液扩散分布于基底膜片表面，然后将膜片置于紫外光下，并低温原位聚合1～5h，得到聚苯乙烯-聚丙烯酰胺凝胶光子晶体；

将凝胶光子晶体以氢氧化钠处理后，浸入胆碱酯酶溶液中并预培养24～72h；然后向预培养后凝胶光子晶体中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和/或3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮，以及溶有鸭血清胆碱酯酶的tris-hcl缓冲溶液，并缩合反应1～5h；然后，将缩合反应后的凝胶光子晶体放入tris-hcl缓冲溶液中培养24～72h，即得到含磷毒剂检测用凝胶光子晶体，并将所制得的含磷毒剂检测用凝胶光子晶体放入tris-hcl缓冲溶液中待用。

实施例1

取适量苯乙烯单体，并采用乳液聚合的方法制备得到粒径为200nm的高电性、单分散聚苯乙烯微球，并得到包含上述微球的乳液；

将乳液通过离子交换树脂进行处理，从而使得所包含的聚苯乙烯微球通过自组装得到三维周期性结构的晶体胶体阵列；

将丙烯酰胺预聚合溶液和包含聚苯乙烯微球的乳液混合后，将所得混合溶液通过虹吸扩散作用，扩散布满于石英玻璃膜片；然后将石英玻璃膜片置于5℃～10℃紫外光下，并在低温条件下，将混合溶液原位光聚2h，制得聚苯乙烯-聚丙烯酰胺凝胶光子晶体；

用氢氧化钠对制得的聚苯乙烯-聚丙烯酰胺凝胶光子晶体进行化学修饰，即将聚丙烯酰胺凝胶骨架的酰胺基团通过化学改性方法转变为羧基(为固化酶提供接入位点)；

然后，将化学修饰后的凝胶光子晶体浸入胆碱酯酶溶液中并预培养48h；然后，将预培养后的凝胶光子晶体加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)以及溶有鸭血清胆碱酯酶的tris-hcl缓冲溶液中，并缩合反应2h；

然后，将缩合反应后的凝胶光子晶体放tris-hcl缓冲液中培养48h以交换出未固化的胆碱酯酶，即得到实施例1的含磷毒剂检测用凝胶光子晶体，并将其进一步保存于tris-hcl缓冲液中待用。

实施例2

取适量苯乙烯单体，并采用乳液聚合的方法制备得到粒径为200nm的高电性、单分散聚苯乙烯微球，并得到包含上述微球的乳液；

将乳液通过离子交换树脂进行处理，从而使得所包含的聚苯乙烯微球通过自组装得到三维周期性结构的晶体胶体阵列；

将丙烯酰胺预聚合溶液和包含聚苯乙烯微球的乳液混合后，将所得混合溶液通过虹吸扩散作用，扩散布满于石英玻璃膜片；然后将石英玻璃膜片置于5℃～10℃紫外光下，并在低温条件下，将混合溶液原位光聚2h，制得聚苯乙烯-聚丙烯酰胺凝胶光子晶体；

用氢氧化钠对制得的聚苯乙烯-聚丙烯酰胺凝胶光子晶体进行化学修饰，即将聚丙烯酰胺凝胶骨架的酰胺基团通过化学改性方法转变为羧基；

然后，将化学修饰后的凝胶光子晶体浸入胆碱酯酶溶液中并预培养48h；然后，将预培养后的凝胶光子晶体加入3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮(depbt)以及溶有鸭血清胆碱酯酶的tris-hcl缓冲溶液中，并缩合反应2h；

然后，将缩合反应后的凝胶光子晶体放tris-hcl缓冲液中培养48h以交换出未固化的胆碱酯酶，即得到实施例2的含磷毒剂检测用凝胶光子晶体，并将其进一步保存于tris-hcl缓冲液中待用。

实验例1

利用光纤光谱仪测试固化胆碱酯酶前凝胶光子晶体(置于ph为7.4的tris-hcl缓冲液中)及利用不同缩合剂固化胆碱酯酶，即采用分别实施例1和实施例2方法所制得的含磷毒剂检测用凝胶光子晶体的衍射峰波长，结果见图1。

由图1对照检测的结果可知，在利用缩合剂固化胆碱酯酶后，凝胶光子晶体衍射峰发生红移；同时，实施例2方法所制得的含磷毒剂检测用凝胶光子晶体的衍射峰红移量大于实施例1方法所制得的含磷毒剂检测用凝胶光子晶体。

实验例2

利用改良的ellman法测试胆碱酯酶催化不同浓度底物水解的起始速度，建立米氏方程检测固化酶的接入率，具体测试方法如下：

取4支25ml干燥试管，分别向其中2支对照管(对照管a和对照管b)和1支测试管中加入15mlbuchi-dtnb溶液，向剩余的1支空白管中加入15mldtnb溶液，将4支试管放入37℃恒温水浴锅中预热；

其中，对照管a不加入凝胶光子晶体，对照管b加入改性后未固化酶的凝胶光子晶体，而测试管则加入固化酶后的凝胶光子晶体。

以空白管仲的dtnb溶液为参比，利用1cm比色皿在波长412nm处监测2支对照管及1支测试管的吸光度值。以底物水解速率对其浓度作图，结果见图2。

由图2对照检测结果可知：对照管a中底物的水解速率为其自然水解速率，比较对照管a和对照管b中的底物水解速率可以发现，两个对照管中的水解速率基本相同，这说明改性后的凝胶光子晶体对底物的水解并没有影响；

测试管中加入了固化酶后的凝胶光子晶体，底物水解速率增大，当底物浓度达到6mmol/l时，由于底物对胆碱酯酶的过量抑制现象而使其催化底物水解的速率降低。

其中，所述米氏方程是表示一个酶促反应的起始速率与底物浓度关系的速度方程，其公式如下：

将计算出的测试管底物水解速率与对应底物浓度作图，其中米氏常数km＝1.2mmol/l，最大反应速率vmax＝3.7×10^-3mmol/min。一个酶的活力单位(u)表示1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量，因而固化酶的活力单位为3.1u，凝胶光子晶体上胆碱酯酶的接入量为5.7×10^-13mol，与常规电极上固化乙酰胆碱酯酶的接入量在相同数量级。

实验例3

测试两种缩合剂固化胆碱酯酶后的凝胶光子晶体对浓度为10^-9mg/ml沙林水溶液响应情况，具体检测方法如下：

在25℃条件下，将分别将浸泡于ph为7.4的tris-hcl缓冲液中的实施例1和实施例2方法所制得的含磷毒剂检测用凝胶光子晶体转移至10ml超纯水浸泡后，采集其光谱图。

然后，将分别将实施例1和实施例2方法所制得的含磷毒剂检测用凝胶光子晶体浸泡于10ml浓度为10^-9mg/ml的沙林水溶液中，利用光纤光谱仪采集未固化酶的凝胶光子晶体及两种缩合剂固化酶后的凝胶光子晶体光谱图，结果见图3。

由图3中所示对照检测结果可知：未固化酶的凝胶光子晶体衍射峰发生略微蓝移，蓝移量为3nm；固化酶凝胶光子晶体的衍射峰均发生红移，且实施例2方法所制得的含磷毒剂检测用凝胶光子晶体的衍射峰红移量大于实施例1方法所制得的含磷毒剂检测用凝胶光子晶体。

由此可见，实施例2方法所制得的含磷毒剂检测用凝胶光子晶体相应灵敏性是高于实施例1方法所制得的含磷毒剂检测用凝胶光子晶体的。

本发明中，通过将光子晶体技术与智能水凝胶相结合，从而可以制得兼具凝胶光子晶体与生物酶两种材料的优点的凝胶光子晶体新型材料，所制得的固化了胆碱酯酶的凝胶光子晶体能够痕量、快速、方便检测含磷毒剂。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。