AKAP4蛋白186位N‑114.04278在制备重度少弱精诊断试剂中的用途的制作方法
本发明涉及医学和分子诊断技术领域，具体涉及一种akap4蛋白186位发生-114.04278质量偏移的天门冬酰胺作为标志物在制备重度少弱精诊断试剂中的用途。
背景技术：
不孕不育已成为全世界范围内的生殖健康问题，其中由于男性因素造成的不育大概占50％左右，且近年来呈上升的趋势。造成男性不育的主要原因是少精弱精症。根据世界卫生组织标准规定，如果a级精子数<25％，(a+b)级精子数<50％，且精子活率低于60％的话，就可诊断为弱精子症。少精子症是指精液中的精子数目低于正常具有生育能力男性的一种病症，当男性的精子在每毫升低于2千万时，就为少精子症。
目前关于精子蛋白质组的研究有很多。saraswat等利用uplc-ms的方法在人类精子中定量了667个蛋白，并且分析出了20个健康人和弱精症患者精子中的差异蛋白(saraswatm,joenvaaras,jaintetal.humanspermatozoaquantitativeproteomicsignatureclassifiesnormo-andasthenozoospermia.molecular&cellularproteomics:mcp,16(1),57-72(2017).)。最新更新的人类精子蛋白质组共6198个蛋白(amarala,castilloj,ramalho-santosj,olivar.thecombinedhumanspermproteome:cellularpathwaysandimplicationsforbasicandclinicalscience.humanreproductionupdate,20(1),40-62(2014).)。gaigaiwang等利用高分辨质谱在人类精子中鉴定出4675个蛋白(wangg,guoy,zhoutetal.in-depthproteomicanalysisofthehumanspermrevealscomplexproteincompositions.journalofproteomics,79,114-122(2013).)。络氨酸磷酸化对于精子的运动、获能、超激运动等过程重要作用。chying-chyuanchan等通过对20组正常人和弱精症患者的精子进行蛋白质组学分析发现有12种包括tubgcp2在内的蛋白发生了过磷酸化(chancc,shuiha,wuchetal.motilityandproteinphosphorylationinhealthyandasthenozoospermicsperm.journalofproteomeresearch,8(11),5382-5386(2009))。
非编码氨基酸包括翻译后修饰和氨基酸突变，是调控蛋白功能和结构的重要方式，因此将疾病状态下异常的或者数量变化极大的非编码氨基酸作为疾病的生物标志物，进而用于诊断疾病的进程具有重要意义。但目前还未有关于非编码氨基酸作为与重度少弱精子疾病相关的生物标志物的报道。
技术实现要素：
针对上述现有技术，本发明的目的提供一种与重度少弱精子症相关的生物标志物的筛选与应用。本发明首先利用nanohplc-ms/ms质谱系统和非标记定量蛋白质组学方法对多组重度少弱精疾病的精子蛋白非编码氨基酸进行了深度的质谱分析；然后利用非限定氨基酸蛋白质修饰分析方法对质谱数据进行搜索，再经过多变量高斯混合分布聚类分析，尽可能大量的鉴定出精子蛋白组中非编码氨基酸；最后通过正常和病人精子蛋白组中非编码氨基酸的比较，得到与重度少弱精症相关的蛋白非编码氨基酸位点，从而将其作为重度少弱精症的分子标志物。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一种与重度少弱精子症相关的生物标志物的筛选方法，包括如下步骤：
(1)提取精子细胞全蛋白；
(2)将精子细胞全蛋白采用凝胶电泳分离，切胶酶解，对酶解后的肽段进行脱盐，制备得到样品；
(3)将步骤(2)的样品采用纳流液相色谱分离，经纳流液相色谱分离后的样品再进行质谱检测，采集质谱数据；
(4)利用非限定氨基酸蛋白质修饰分析方法对质谱数据进行搜索，再经过多变量高斯混合分布聚类分析，尽可能大量的鉴定出精子蛋白组中非编码氨基酸；最后通过正常个体和重度少弱精个体精子蛋白组中非编码氨基酸的比较，得到与重度少弱精症相关的蛋白非编码氨基酸位点，即为与重度少弱精子症相关的生物标志物。
步骤(1)中，提取精子细胞全蛋白采用的方法为：将精子样本采用dpbs洗涤，加入ripa裂解液超声1～2min，置于冰上孵育30min裂解，离心，取上清。
优选的，在4℃的条件下离心，离心转速为14,000g，离心时间为20min。
步骤(2)中，优选的，采用10％聚丙烯酰氨凝胶电泳(sds-page)对蛋白进行分离。
步骤(2)中，优选的，采用ziptip对酶解后的肽段进行脱盐。
步骤(3)中，纳流液相色谱分离的色谱条件为：流动相a：含有0.1％甲酸的水，流动相b：含有0.1％甲酸的乙腈；纳流液相质谱分析系统为orbitrapelite(thermoscientific)
洗脱条件为：0-100min，95-68％流动相a，5-32％流动相b；100-120min，68-20％流动相a，32-80％流动相b；120-150min，20％流动相a，80％流动相b；
流速为300nl/min。
步骤(3)中，质谱检测的条件为：350-1800m/z的全扫描，分辨率为60,000(m/z200)。二级图谱扫描时，活化时间为10ms，隔离宽度为2m/z；碎裂方式为诱导碰撞解离(collision-induceddissociation,cid)，归一化碰撞能量设定为35％，动态排出时间为90s。
步骤(4)中，对质谱数据进行搜索的参数设置为：蛋白酶为胰蛋白酶，漏切位点设置为2，母离子质量偏差为10ppm，碎片离子的质量偏差为0.6da，盲搜上限设为1000，盲搜下限设为-200，蛋白fdr为0.01；
选择肽段分数>200和fdr<0.01的肽段作为wildcardsearchtm搜索到的未知修饰数据，组成质量变化的一维数据矩阵(-200da-400da)，再将数据按照1da的变化范围，0.5da为界限，分割成601个数据窗口。
步骤(4)中，多变量高斯混合分布聚类分析的方法为：针对每一个数据窗口，用r语言中的mclust程序包做高斯混合分布聚类分析，根据bic取最优值，再对每一个峰进行合并分析，然后用高斯分布拟合每一个峰，确定峰值；聚类之后的每个峰中所包含的肽段位点数据，根据位点氨基酸分布，选择分布大于5％的数据作为一类非编码氨基酸。
步骤(4)中，将正常个体和重度少弱精个体的非编码氨基酸按照其检测频率的t检验(p<0.05)和比值(ratio>2)进行筛选，从而得到差异非编码氨基酸。
上述筛选方法是用于获得生物标志物，且不是以获得疾病的诊断和治疗结果为目的；经上述筛选方法获得的生物标志物可用于重度少弱精子症的理论研究或者新药物的开发。
本发明的第二方面，提供根据上述筛选方法筛选得到的与重度少弱精子症相关的生物标志物，所述生物标志物包括但不限于：
akap3蛋白208位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸(标记为s+79.96685；根据质量偏移值，确定该位置的丝氨酸发生了磷酸化修饰)；
akap4蛋白186位发生-113.05347质量偏移的天门冬酰胺(标记为n-113.05347)；
akap4蛋白186位发生-114.04278质量偏移的天门冬酰胺(标记为n-114.04278)；
akap4蛋白617位发生-17.02660质量偏移的谷氨酰胺(标记为q-17.02660)；
akap4蛋白733位发生+211.09682质量偏移的赖氨酸(标记为k+211.09682)；
atp5a1蛋白531位发生+42.01108质量偏移的赖氨酸(标记为k+42.01108；根据质量偏移值，确定该位置的赖氨酸发生了乙酰化修饰)；
cox4i1蛋白87位发生+42.01108质量偏移的赖氨酸(标记为k+42.01108；根据质量偏移值，确定该位置的赖氨酸发生了乙酰化修饰)；
gapdhs蛋白64位发生+79.96685质量偏移的苏氨酸(标记为t+79.96685；根据质量偏移值，确定该位置的苏氨酸发生了磷酸化修饰)；
和kiaa1683蛋白692位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸(标记为s+79.96685；根据质量偏移值，确定该位置的丝氨酸发生了磷酸化修饰)。
本发明的第三方面，提供akap3蛋白208位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸作为生物标志物在制备重度少弱精的诊断试剂中的用途。
优选的，akap3蛋白208位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸还可以作为重度少弱精治疗的靶标，从而用于重度少弱精的治疗。
进一步的，本发明还提供akap3蛋白208位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸作为生物标志物在制备重度少弱精的治疗药物中的用途。
本发明还提供一种用于重度少弱精诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括特异性检测上述生物标志物(akap3蛋白208位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸)的试剂。
本发明还提供一种治疗重度少弱精的药物，所述药物中含有能够使akap3蛋白208位丝氨酸进行磷酸化修饰的组分。
本发明还提供一种重度少弱精的诊断方法，步骤为：检测待测样本akap3蛋白208位丝氨酸发生+79.96685质量偏移的频次，若检测频次小于1.5时，被判为少弱精患者。
本发明的第四方面，提供akap4蛋白186位发生-113.05347质量偏移的天门冬酰胺作为生物标志物在制备重度少弱精的诊断试剂中的用途。
本发明还提供一种用于重度少弱精诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括特异性检测上述生物标志物(akap4蛋白186位发生-113.05347质量偏移的天门冬酰胺)的试剂。
本发明还提供一种重度少弱精的诊断方法，步骤为：检测待测样本akap4蛋白186位天门冬酰胺发生-113.05347质量偏移的频次，检测频次小于0.5时，被判为少弱精患者。
本发明的第五方面，提供akap4蛋白186位发生-114.04278质量偏移的天门冬酰胺作为生物标志物在制备重度少弱精的诊断试剂中的用途。
本发明还提供一种用于重度少弱精诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括特异性检测上述生物标志物(akap4蛋白186位发生-114.04278质量偏移的天门冬酰胺)的试剂。
本发明还提供一种重度少弱精的诊断方法，步骤为：检测待测样本akap4蛋白186位天门冬酰胺发生-114.04278质量偏移的频次，检测频次小于0.5时，被判为少弱精患者。
本发明的第六方面，提供akap4蛋白617位发生-17.02660质量偏移的谷氨酰胺作为生物标志物在制备重度少弱精的诊断试剂中的用途。
本发明还提供一种用于重度少弱精诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括特异性检测上述生物标志物(akap4蛋白617位发生-17.02660质量偏移的谷氨酰胺)的试剂。
本发明还提供一种重度少弱精的诊断方法，步骤为：检测待测样本akap4蛋白617位谷氨酰胺发生-17.02660质量偏移的频次，检测频次小于0.5时，被判为少弱精患者。
本发明的第七方面，提供akap4蛋白733位发生+211.09682质量偏移的赖氨酸作为生物标志物在制备重度少弱精的诊断试剂中的用途。
本发明还提供一种用于重度少弱精诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括特异性检测上述生物标志物(akap4蛋白733位发生+211.09682质量偏移的赖氨酸)的试剂。
本发明还提供一种重度少弱精的诊断方法，步骤为：检测待测样本akap4蛋白733位赖氨酸发生+211.09682质量偏移的频次，检测频次小于3.5时，被判为少弱精患者。
本发明的第八方面，提供atp5a1蛋白531位发生+42.01108质量偏移的赖氨酸作为生物标志物在制备重度少弱精的诊断试剂中的用途。
优选的，atp5a1蛋白531位发生+42.01108质量偏移的赖氨酸还可以作为重度少弱精治疗的靶标，从而用于重度少弱精的治疗。
进一步的，本发明还提供atp5a1蛋白531位发生+42.01108质量偏移的赖氨酸作为生物标志物在制备重度少弱精的治疗药物中的用途。
本发明还提供一种用于重度少弱精诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括特异性检测上述生物标志物(atp5a1蛋白531位发生+42.01108质量偏移的赖氨酸)的试剂。
本发明还提供一种治疗重度少弱精的药物，所述药物中含有能够使atp5a1蛋白531位赖氨酸进行乙酰化修饰的组分。
本发明还提供一种重度少弱精的诊断方法，步骤为：检测待测样本atp5a1蛋白531位赖氨酸发生+42.01108质量偏移的频次，若检测频次小于0.5时，被判为少弱精患者。
本发明的第九方面，提供cox4i1蛋白87位发生+42.01108质量偏移的赖氨酸作为生物标志物在制备重度少弱精的诊断试剂中的用途。
优选的，cox4i1蛋白87位发生+42.01108质量偏移的赖氨酸还可以作为重度少弱精治疗的靶标，从而用于重度少弱精的治疗。
进一步的，本发明还提供cox4i1蛋白87位发生+42.01108质量偏移的赖氨酸作为生物标志物在制备重度少弱精的治疗药物中的用途。
本发明还提供一种用于重度少弱精诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括特异性检测上述生物标志物(cox4i1蛋白87位发生+42.01108质量偏移的赖氨酸)的试剂。
本发明还提供一种治疗重度少弱精的药物，所述药物中含有能够使cox4i1蛋白87位赖氨酸进行乙酰化修饰的组分。
本发明还提供一种重度少弱精的诊断方法，步骤为：检测待测样本cox4i1蛋白87位赖氨酸发生+42.01108质量偏移的频次，若检测频次小于0.5时，被判为少弱精患者。
本发明的第十方面，提供gapdhs蛋白64位发生+79.96685质量偏移的苏氨酸作为生物标志物在制备重度少弱精的诊断试剂中的用途。
优选的，gapdhs蛋白64位发生+79.96685质量偏移的苏氨酸还可以作为重度少弱精治疗的靶标，从而用于重度少弱精的治疗。
进一步的，本发明还提供gapdhs蛋白64位发生+79.96685质量偏移的苏氨酸作为生物标志物在制备重度少弱精的治疗药物中的用途。
本发明还提供一种用于重度少弱精诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括特异性检测上述生物标志物(gapdhs蛋白64位发生+79.96685质量偏移的苏氨酸)的试剂。
本发明还提供一种治疗重度少弱精的药物，所述药物中含有能够使gapdhs蛋白64位苏氨酸进行磷酸化修饰的组分。
本发明还提供一种重度少弱精的诊断方法，步骤为：检测待测样本gapdhs蛋白64位苏氨酸发生+79.96685质量偏移的频次，若检测频次小于3.5时，被判为少弱精患者。
本发明的第十一方面，提供kiaa1683蛋白692位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸作为生物标志物在制备重度少弱精的诊断试剂中的用途。
优选的，kiaa1683蛋白692位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸还可以作为重度少弱精治疗的靶标，从而用于重度少弱精的治疗。
进一步的，本发明还提供kiaa1683蛋白692位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸作为生物标志物在制备重度少弱精的治疗药物中的用途。
本发明还提供一种用于重度少弱精诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括特异性检测上述生物标志物(kiaa1683蛋白692位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸)的试剂。
本发明还提供一种治疗重度少弱精的药物，所述药物中含有能够使kiaa1683蛋白692位丝氨酸进行磷酸化修饰的组分。
本发明还提供一种重度少弱精的诊断方法，步骤为：检测待测样本kiaa1683蛋白692位丝氨酸发生+79.96685质量偏移的频次，若检测频次小于0.5时，被判为少弱精患者。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次建立了一种与重度少弱精子症相关的生物标志物的筛选方法，通过对大量样本精子蛋白的质谱数据进行分析处理，尽可能大量的鉴定出精子蛋白组中非编码氨基酸；最后通过正常和病人精子蛋白组中非编码氨基酸的比较，得到与重度少弱精症相关的蛋白非编码氨基酸位点，从而将其作为重度少弱精症的分子标志物。
(2)本发明进一步的对上述筛选方法得到的生物标志物进行研究，发现可以通过上述生物标志物的检验频次来诊断重度少弱精症，为重度少弱精症提供了新的诊断和治疗靶点。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1：akap3蛋白208位丝氨酸上的磷酸化修饰s+79.96685检测频率的roc曲线。
图2：健康和少弱精样本中akap3蛋白208位丝氨酸上的磷酸化修饰s+79.96685检测频率比较。
图3：akap4蛋白186位非编码氨基酸n-113.05347检测频率的roc曲线。
图4：健康和少弱精样本的akap4蛋白186位非编码氨基酸n-113.05347检测频率比较。
图5：akap4蛋白186位非编码氨基酸n-114.04278检测频率的roc曲线。
图6：健康和少弱精样本的akap4蛋白186位非编码氨基酸n-114.04278检测频率比较。
图7：akap4蛋白617位非编码氨基酸q-17.02660检测频率的roc曲线。
图8：健康和少弱精样本的akap4蛋白617位非编码氨基酸q-17.02660检测频率比较。
图9：akap4蛋白733位非编码氨基酸k+211.09682检测频率的roc曲线。
图10：健康和少弱精样本的非编码氨基酸k+211.09682检测频率比较。
图11：atp5a1蛋白531位赖氨酸乙酰化修饰k+42.01108检测频率的roc曲线。
图12：健康和少弱精样本的atp5a1蛋白531位赖氨酸乙酰化修饰k+42.01108检测频率比较。
图13：cox4i1蛋白87位赖氨酸乙酰化修饰k+42.01108检测频率的roc曲线。
图14：健康和少弱精样本的cox4i1蛋白87位赖氨酸乙酰化修饰k+42.01108检测频率比较。
图15：gapdhs蛋白64位苏氨酸上的磷酸化修饰t+79.96685检测频率的roc曲线。
图16：健康和少弱精样本中gapdhs蛋白64位苏氨酸上的磷酸化修饰t+79.96685检测频率比较。
图17：kiaa1683蛋白692位丝氨酸磷酸化修饰s+79.96685检测频率的roc曲线。
图18：健康和少弱精样本中kiaa1683蛋白692位丝氨酸磷酸化修饰s+79.96685检测频率比较。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中还未有关于非编码氨基酸作为与重度少弱精子症相关的生物标志物的报道。基于此，本发明提出了一种与重度少弱精子症相关的生物标志物的筛选方法与应用。
在本申请的一种实施方案中，提出了一种与重度少弱精子症相关的生物标志物的筛选方法，包括如下步骤：
(1)提取精子细胞全蛋白；
(2)将精子细胞全蛋白采用凝胶电泳分离，切胶酶解，对酶解后的肽段进行脱盐，制备得到样品；
(3)将步骤(2)的样品采用纳流液相色谱分离，经纳流液相色谱分离后的样品再进行质谱检测，采集质谱数据；
(4)利用非限定氨基酸蛋白质修饰分析方法对质谱数据进行搜索，再经过多变量高斯混合分布聚类分析，尽可能大量的鉴定出精子蛋白组中非编码氨基酸；最后通过正常个体和重度少弱精个体精子蛋白组中非编码氨基酸的比较，得到与重度少弱精症相关的蛋白非编码氨基酸位点，即为与重度少弱精子症相关的生物标志物。
由于精子样本的易得性，精子成熟后其转录和翻译处于停滞状态，这也为我们在蛋白质水平上研究少弱精子症提供了方便，本申请首先利用nanohplc-ms/ms质谱系统和非标记定量蛋白质组学方法对多组重度少弱精疾病的精子蛋白非编码氨基酸进行了深度的质谱分析；然后利用非限定氨基酸蛋白质修饰分析方法对质谱数据进行搜索，再经过多变量高斯混合分布聚类分析，尽可能大量的鉴定出精子蛋白组中非编码氨基酸。最后将正常与患病组的非编码氨基酸按照其检测频率的t检验(p<0.05)和比值(ratio>2)进行筛选，从而得到差异非编码氨基酸。然后利用spss软件作出差异非编码氨基酸roc曲线，并计算其曲线下面积(auc)，进而判断其诊断价值。
采用本申请的上述筛选方法，得到了系列与重度少弱精子症相关的生物标志物，具体如下：
akap3蛋白208位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸(标记为s+79.96685；根据质量偏移值，确定该位置的丝氨酸发生了磷酸化修饰)；
akap4蛋白186位发生-113.05347质量偏移的天门冬酰胺(标记为n-113.05347)；
akap4蛋白186位发生-114.04278质量偏移的天门冬酰胺(标记为n-114.04278)；
akap4蛋白617位发生-17.02660质量偏移的谷氨酰胺(标记为q-17.02660)；
akap4蛋白733位发生+211.09682质量偏移的赖氨酸(标记为k+211.09682)；
atp5a1蛋白531位发生+42.01108质量偏移的赖氨酸(标记为k+42.01108；根据质量偏移值，确定该位置的赖氨酸发生了乙酰化修饰)；
cox4i1蛋白87位发生+42.01108质量偏移的赖氨酸(标记为k+42.01108；根据质量偏移值，确定该位置的赖氨酸发生了乙酰化修饰)；
gapdhs蛋白64位发生+79.96685质量偏移的苏氨酸(标记为t+79.96685；根据质量偏移值，确定该位置的苏氨酸发生了磷酸化修饰)；
和kiaa1683蛋白692位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸(标记为s+79.96685；根据质量偏移值，确定该位置的丝氨酸发生了磷酸化修饰)。
在本申请的另一种实施方案中，提出了一种用于重度少弱精诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括特异性检测上述生物标志物的试剂。
通过对上述生物标志物进行检测，可以实现对重度少弱精症的诊断。
在本申请的另一种实施方案中，提出了一种治疗重度少弱精的药物，所述药物中含有能够使akap3蛋白208位丝氨酸、gapdhs蛋白64位苏氨酸或kiaa1683蛋白692位丝氨酸进行磷酸化修饰的组分，或者含有能够使atp5a1蛋白531位赖氨酸或cox4i1蛋白87位赖氨酸进行乙酰化修饰的组分。
经研究发现，磷酸化修饰的akap3蛋白208位丝氨酸、gapdhs蛋白64位苏氨酸和kiaa1683蛋白692位丝氨酸在重度少弱精样本中显著性的下调，乙酰化修饰的atp5a1蛋白531位赖氨酸或cox4i1蛋白87位赖氨酸也在重度少弱精样本中显著性的下调。由此可以合理预期，以上述生物标志物作为靶标，通过对多重度少弱精患者该靶标处的氨基酸进行磷酸化或乙酰化修饰，可以起到对重度少弱精的治疗作用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：与重度少弱精子症相关的生物标志物的筛选
具体筛选方法如下：
一、样本处理及实验分析
1.精子细胞全蛋白的提取：等量的重度少弱精和正常精子样本分别用dpbs洗三次，加入等量ripa裂解液超声1～2min，置于冰上孵育30min裂解，4℃离心14,000g×20min取上清。利用bradford方法测定蛋白浓度。
2.蛋白酶解：取约重度少弱精和正常精子样本各150μg精子蛋白，使用10％聚丙烯酰氨凝胶电泳(sds-page)对蛋白进行分离，各分成5份进行切胶酶解。使用ziptip对肽段进行脱盐。
3.质谱分析：纳流液相色谱分离：a相：含有0.1％甲酸的水；b相：含有0.1％甲酸的乙腈
每个样品分别用13.5μla相溶解,样品进样量为4μl，纳流液相质谱分析系统为orbitrapelite(thermoscientific)。样品分离之前分别用4μla相平衡自制的预柱和分析柱。预柱和分析柱的规格分别为：预柱(4cm×150μmi.d.,c18填料粒径5μm,
质谱数据采集：350‐1800m/z的全扫描，分辨率为60,000(m/z200)。二级图谱扫描时，活化时间为10ms，隔离宽度为2m/z。碎裂方式为诱导碰撞解离(collision-induceddissociation,cid)，归一化碰撞能量设定为35％，动态排出时间为90s。
二、质谱数据分析
byonic分析：为了鉴定出精子蛋白的非编码氨基酸，我们用byonictm分析21对正常与重度少弱精患者的精蛋白质谱数据。搜索参数如下：蛋白酶为胰蛋白酶，漏切位点设置为2，母离子质量偏差为10ppm，碎片离子的质量偏差为0.6da,盲搜上限设为1000，盲搜下限设为-200.蛋白fdr为0.01。
选择肽段分数>200和fdr<0.01的肽段作为wildcardsearchtm搜索到的未知修饰数据，组成质量变化的一维数据矩阵(-200da-400da)，再将数据按照1da的变化范围，0.5da为界限，分割成601个数据窗口。针对每一个数据窗口，用r语言中的mclust程序包做高斯混合分布聚类分析，根据bic取最优值，再对每一个峰进行合并分析，然后用高斯分布拟合每一个峰，确定峰值。聚类之后的每个峰中所包含的肽段位点数据，根据位点氨基酸分布，选择分布大于5％的数据作为一类非编码氨基酸。
将正常与患病组的非编码氨基酸按照其检测频率的t检验(p<0.05)和比值(ratio>2)进行筛选，从而得到差异非编码氨基酸。然后利用spss软件作出差异非编码氨基酸roc曲线，并计算其曲线下面积(auc)，进而判断其诊断价值。
三、实验结果：
经质谱数据分析和将正常与患病组的非编码氨基酸比较，从而得到9个差异非编码氨基酸，可以作为与重度少弱精子症相关的生物标志物，具体如下：
1.akap3蛋白208位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸(标记为s+79.96685；根据质量偏移值，确定该位置的丝氨酸发生了磷酸化修饰)
我们发现akap3蛋白208位丝氨酸上发生了磷酸化修饰s+79.96685，经过比较发现这一磷酸化修饰在重度少弱精样本显著性下调了10.7倍，p值为7.49e-15<0.05。
为评价akap3蛋白208位丝氨酸上的磷酸化修饰s+79.96685检测频率对重度少弱精的诊断效能，本发明采用了roc曲线分析，auc为roc曲线下的面积，是最常用的评价roc曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若auc在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；auc在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。
图1为akap3蛋白208位丝氨酸上的磷酸化修饰s+79.96685检测频率的roc曲线，roc分析显示这一磷酸化修饰的auc为0.856>0.7，说明具有较好的诊断效果，即akap3蛋白208位丝氨酸上的磷酸化修饰s+79.96685可以作为重度少弱精的诊断标志物。
在检验频次为1.5时，灵敏度为73％，特异度为88.9％。当进行个体检测时，检测频次小于1.5时，被判为少弱精患者(假阳性率为11.1％)。
健康和少弱精样本中akap3蛋白208位丝氨酸上的磷酸化修饰s+79.96685检测频率比较结果见图2，由图2可以看出这一非编码氨基酸在健康人样本中平均发生了4.6次而在病理样本中发生了0.4次(图中实线)，并且其中位数(图中虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一非编码氨基酸有较大程度地丢失。
鉴于上述结果，akap3蛋白208位丝氨酸上的磷酸化修饰s+79.96685可以作为少弱精子症的潜在生物标志物，从而对这一病症进行预测。
2.akap4蛋白186位发生-113.05347质量偏移的天门冬酰胺(标记为n-113.05347)
经过质谱数据分析，我们发现akap4蛋白的186位的天门冬酰胺有-113.05347的质量偏移(n-113.05347)，经过比较发现这一非编码氨基酸n-113.05347在重度少弱精样本显著性下调了9.2倍，p值为4.60e-13<0.05。
图3为akap4蛋白186位非编码氨基酸n-113.05347检测频率的roc曲线，roc分析显示这一非编码氨基酸n-113.05347的auc为0.852>0.7，说明具有较好的诊断效果。在检验频次为1.5时，灵敏度为65.1％，特异度为93.7％。当进行个体检测时，检测频次小于1.5时，被判为少弱精患者(假阳性率为6.3％)。
图4比较了非编码氨基酸n-113.05347在健康和少弱精样本的检测频率，可以看出这一非编码氨基酸在健康人样本中平均发生了2.9次而在病理样本中发生了0.3次(图中实线)，并且其中位数(图中虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一非编码氨基酸有较大程度地丢失。
鉴于上述结果，akap4蛋白的186位点的天门冬酰胺n-113.05347这一非编码氨基酸可以作为少弱精子症的潜在生物标志物，从而对这一病症进行预测。
3.akap4蛋白186位发生-114.04278质量偏移的天门冬酰胺(标记为n-114.04278)
经过质谱数据分析，我们发现akap4蛋白的186位的天门冬酰胺有-114.04278的质量偏移(n-114.04278)，经过比较发现这一非编码氨基酸n-114.04278在重度少弱精样本显著性下调了7.3倍，p值为1.11e-11<0.05。
图5为akap4蛋白186位非编码氨基酸n-114.04278检测频率的roc曲线，roc分析显示这一非编码氨基酸n-114.04278的auc为0.817>0.7，说明具有较好的诊断效果。在检验频次为0.5时，灵敏度为74.6％，特异度为84.1％。当进行个体检测时，检测频次小于0.5时，被判为少弱精患者(假阳性率为15.9％)。
健康和少弱精样本的akap4蛋白186位非编码氨基酸n-114.04278检测频率比较见图6，由图6可以看出这一非编码氨基酸在健康人样本中平均发生了1.6次而在病理样本中发生了0.2次(图中实线)，并且其中位数(图中虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一非编码氨基酸有较大程度地丢失。
鉴于上述结果，akap4蛋白的186位点的天门冬酰胺n-114.04278这一非编码氨基酸可以作为少弱精子症的潜在生物标志物，从而对这一病症进行预测。
4.akap4蛋白617位发生-17.02660质量偏移的谷氨酰胺(标记为q-17.02660)
经过质谱数据分析，我们发现akap4蛋白的617位的谷氨酰胺有-17.02660的质量偏移(q-17.02660)，经过比较发现这一非编码氨基酸q-17.02660在重度少弱精样本显著性下调了4.8倍，p值为2.21e-09<0.05。
图7为akap4蛋白617位非编码氨基酸q-17.02660检测频率的roc曲线，roc分析显示这一非编码氨基酸q-17.02660的auc为0.802>0.7，说明具有较好的诊断效果。在检验频次为0.5时，灵敏度为77.8％，特异度为79.4％。当进行个体检测时，检测频次小于0.5时，被判为少弱精患者(假阳性率为20.6％)。
健康和少弱精样本的akap4蛋白617位非编码氨基酸q-17.02660检测频率比较见图8，由图8可以看出这一非编码氨基酸在健康人样本中平均发生了2.7次而在病理样本中发生了0.6次(图中实线)，并且其中位数(图中虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一非编码氨基酸有较大程度地丢失。
鉴于上述结果，akap4蛋白的617位点的谷氨酰胺q-17.02660这一非编码氨基酸可以作为少弱精子症的潜在生物标志物，从而对这一病症进行预测。
5.akap4蛋白733位发生+211.09682质量偏移的赖氨酸(标记为k+211.09682)
经过质谱数据分析，我们发现akap4蛋白的733位的赖氨酸有211.09682的质量偏移(k+211.09682)，经过比较发现这一非编码氨基酸k+211.09682在重度少弱精样本显著性下调了4.4倍，p值为5.79e-11<0.05。
图9为akap4蛋白733位非编码氨基酸k+211.09682检测频率的roc曲线，roc分析显示这一非编码氨基酸k+211.09682的auc为0.804>0.7，说明具有较好的诊断效果。在检验频次为3.5时，灵敏度为74.6％，特异度为71.4％。当进行个体检测时，检测频次小于3.5时，被判为少弱精患者(假阳性率为28.6％)。
健康和少弱精样本的非编码氨基酸k+211.09682检测频率比较见图10，由图10可以看出这一非编码氨基酸在健康人样本中平均发生了14次而在病理样本中发生了3次(图中实线)，并且其中位数(图中虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一非编码氨基酸有较大程度地丢失。
鉴于上述结果，akap4蛋白的733位点的赖氨酸k+211.09682这一非编码氨基酸可以作为少弱精子症的潜在生物标志物，从而对这一病症进行预测。
6.atp5a1蛋白531位发生+42.01108质量偏移的赖氨酸
经过质谱数据分析，我们发现atp5a1蛋白531位赖氨酸上发生了乙酰化修饰k+42.01108，经过比较发现这一乙酰化修饰在重度少弱精样本显著性下调了10.5倍，p值为3.48e-16<0.05。
图11为atp5a1蛋白531位赖氨酸乙酰化修饰k+42.01108检测频率的roc曲线，roc分析显示这一乙酰化修饰的auc为0.848>0.7，说明具有较好的诊断效果。在检验频次为0.5时，灵敏度为76.2％，特异度为85.7％。当进行个体检测时，检测频次小于0.5时，被判为少弱精患者(假阳性率为14.3％)。
健康和少弱精样本的atp5a1蛋白531位赖氨酸乙酰化修饰k+42.01108检测频率比较见图12，可以看出这一非编码氨基酸在健康人样本中平均发生了1.7次而在病理样本中发生了0.2次(图中实线)，并且其中位数(图中虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一非编码氨基酸有较大程度地丢失。
鉴于上述结果，atp5a1蛋白531位赖氨酸上的乙酰化修饰k+42.01108可以作为少弱精子症的潜在生物标志物，从而对这一病症进行预测。
7.cox4i1蛋白87位发生+42.01108质量偏移的赖氨酸(标记为k+42.01108)
经过质谱数据分析，我们发现cox4i1蛋白87位赖氨酸上发生了乙酰化修饰k+42.01108，经过比较发现这一乙酰化修饰在重度少弱精样本显著性下调了11.3倍，p值为5.06e-13<0.05。
图13为cox4i1蛋白87位赖氨酸乙酰化修饰k+42.01108检测频率的roc曲线，roc分析显示这一乙酰化修饰的auc为0.803>0.7，说明具有较好的诊断效果。在检验频次为0.5时，灵敏度为66.7％，特异度为95.2％。当进行个体检测时，检测频次小于0.5时，被判为少弱精患者(假阳性率为4.8％)。
图14为健康和少弱精样本的cox4i1蛋白87位赖氨酸乙酰化修饰k+42.01108检测频率比较，由图14可以看出这一非编码氨基酸在健康人样本中平均发生了1.1次而在病理样本中发生了0.1次(图中实线)，并且其中位数(图中虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一非编码氨基酸有较大程度地丢失。
鉴于上述结果，cox4i1蛋白87位赖氨酸上的乙酰化修饰k+42.01108可以作为少弱精子症的潜在生物标志物，从而对这一病症进行预测。
8.gapdhs蛋白64位发生+79.96685质量偏移的苏氨酸(标记为t+79.96685)
经过质谱数据分析，我们发现gapdhs蛋白的64位苏氨酸上发生了磷酸化修饰t+79.96685，经过比较发现这一磷酸化修饰在重度少弱精样本显著性下调了4.1倍，p值为1.82e-14<0.05。
图15为gapdhs蛋白64位苏氨酸上的磷酸化修饰t+79.96685检测频率的roc曲线，roc分析显示这一磷酸化修饰的auc为0.868>0.7，说明具有较好的诊断效果。在检验频次为3.5时，灵敏度为71.4％，特异度为92.1％。当进行个体检测时，检测频次小于3.5时，被判为少弱精患者(假阳性率为7.9％)。
图16为健康和少弱精样本中gapdhs蛋白64位苏氨酸上的磷酸化修饰t+79.96685检测频率比较，由图16可以看出这一非编码氨基酸在健康人样本中平均发生了5.8次而在病理样本中发生了1.4次(图中实线)，并且其中位数(图中虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一非编码氨基酸有较大程度地丢失。
鉴于上述结果，gapdhs蛋白64位苏氨酸上的磷酸化修饰t+79.96685可以作为少弱精子症的潜在生物标志物，从而对这一病症进行预测。
9.kiaa1683蛋白692位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸(标记为s+79.96685)
经过质谱数据分析，我们发现kiaa1683蛋白692位丝氨酸上发生了磷酸化修饰s+79.96685，经过比较发现这一磷酸化修饰在重度少弱精样本显著性下调了22倍，p值为2.73e-10<0.05。
图17为kiaa1683蛋白692位丝氨酸磷酸化修饰s+79.96685检测频率的roc曲线，roc分析显示这一磷酸化修饰的auc为0.808>0.7，说明具有较好的诊断效果。在检验频次为0.5时，灵敏度为65.1％，特异度为95.2％。当进行个体检测时，检测频次小于0.5时，被判为少弱精患者(假阳性率为4.8％)。
图18为健康和少弱精样本中kiaa1683蛋白692位丝氨酸磷酸化修饰s+79.96685检测频率比较，由图18可以看出这一非编码氨基酸在健康人样本中平均发生了2.1次而在病理样本中发生了0.1次(图中实线)，并且其中位数(图中虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一非编码氨基酸有较大程度地丢失。
鉴于上述结果，kiaa1683蛋白692位丝氨酸上的磷酸化修饰s+79.96685可以作为少弱精子症的潜在生物标志物，从而对这一病症进行预测。
实施例2：临床检测验证
以4例健康样本、8例已临床确诊的重度少弱精样本作为研究对象进行验证，分别检测上述样本的akap3蛋白208位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸、akap4蛋白186位发生-113.05347质量偏移的天门冬酰胺、akap4蛋白186位发生-114.04278质量偏移的天门冬酰胺、akap4蛋白617位发生-17.02660质量偏移的谷氨酰胺、akap4蛋白733位发生+211.09682质量偏移的赖氨酸、atp5a1蛋白531位发生+42.01108质量偏移的赖氨酸、cox4i1蛋白87位发生+42.01108质量偏移的赖氨酸、gapdhs蛋白64位发生+79.96685质量偏移的苏氨酸和kiaa1683蛋白692位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸各自的检测频次，并按实施例1中各生物标志物进行个体检测时的判断标准对待测样本进行诊断。
结果表明：分别以上述各生物标志物进行单独诊断时，诊断结果与已知结果一致。说明本发明筛选得到的9个生物标志物可以各自作为重度少弱精的诊断标志物。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
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