一种沙门氏菌抗体乳胶凝集检测方法与流程

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种沙门氏菌抗体乳胶凝集检测方法。

背景技术：

沙门氏菌(salmonellaspp)是一种条件致病菌。也是一种人畜共患病病原菌，对人和动物均有致病性，也是全世界引起人类食物中毒的最主要病原菌之一，主要侵染人的肠道上皮细胞，可以造成各种病症，轻者引起轻度腹泻，重者出现伤寒发热。沙门氏菌的传播主要是通过污染的环境、食物以及饮用水，而且能够长时间存在于环境中，长期保持感染能力，导致其难以彻底净化。准确检测沙门氏菌无论是在动物临床实践还是人类自我保护方面，都具有重要意义。

目前多种沙门氏菌检测技术种类很多，主要包括：传统的分离培养等检测方法、分子生物学检测方法和免疫学检测方法。

传统检测方法主要包括：沙门氏菌分离纯化、生化鉴定和血清型鉴定。传统检测方法中分离纯化和生化鉴定操作虽然简单，但细菌生长较慢，耗时较长；血清型鉴定虽然简便快捷，但是特异性不高，可能会出现交叉反应。分子生物学检测方法包括：pcr检测技术、基因芯片技术、下一代基因测序技术(nextgenerationsequencing，又称第二代基因测序)。分子生物学检测法快速、灵敏、特异性强，但成本较高，且要求较高技术水平，大范围应用尚有一定难度。

免疫学检测方法包括：酶联免疫吸附(elisa)、乳胶凝集试验(latexagglutinationtest,lat)等。其中酶联免疫吸附较传统检测方法耗时短可以实现自动化处理大量样品，比培养方法特异性高。但使用多抗血清检测，则特异性不强，如果使用单抗提高灵敏度和特异性，相应抗体的制备要求较高。

乳胶凝集试验是一种间接凝集反应，首先需要将可溶性抗原(或抗体)吸附到乳胶微球表面，该乳胶微球需要具备不溶性和不发生免疫反应等条件，制成致敏乳胶后，在电解质的条件下，与特异性抗体(或抗原)反应会出现肉眼可见的凝集现象。乳胶凝集试验具有高特异性和敏感性，而且操作简单，试验耗时短，适用于临床样本的大量检测。但是乳胶凝集试验存在的缺点为不易找到吸附到乳胶微的特异性和免疫反应性较好的抗原或抗体。

实验室常用的鉴定沙门氏菌的方法为pcr和elisa。虽然准确率高，但实验条件要求高，且耗费大量时间。因此，迫切需要开发一种快速准确、简便易行的检测方法。

sen4030是沙门氏菌表达的一段多拷贝蛋白，有5559个氨基酸，在沙门氏菌中具有高度保守性。通过生物信息学分析氨基酸序列发现，sen4030蛋白跟鼠伤寒沙门氏菌的粘附素蛋白siie高度相似，只有76个氨基酸不同，由此推断sen4030蛋白也应该是一种粘附素类蛋白，在沙门氏菌入侵宿主细胞过程中起作用，可以影响沙门氏菌的致病性。

技术实现要素：

本发明为了克服目前沙门氏菌检测方法难以实现快速准确、简便易行的问题，提出一种沙门氏菌抗体乳胶凝集检测方法。

sen4030a蛋白为sen4030的一部分，其编码基因为sen4030编码基因中截取的第6600-8100bps序列，约1500bps。通过前期研究，sen4030a蛋白包含免疫球蛋白样的结构域，可以影响沙门氏菌的致病性，elisa等相关试验证明有较强的特异性和免疫反应性，可以应用于沙门氏菌特异性诊断。

为此，本发明的具体技术方案如下：

一种沙门氏菌抗体乳胶凝集检测方法，包括以下步骤：

将sen4030a蛋白，连接到空白乳胶微球上，制备致敏乳胶微球；

将致敏乳胶微球与待测样品混匀反应，观察凝集结果。

上述检测方法中，所述sen4030a蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

上述检测方法中，所述致敏乳胶微球的制备方法为：

将预处理后的空白乳胶微球溶液与sen4030a蛋白溶液混合，在4-60℃下偶联1-10小时。

上述检测方法中，所述空白乳胶微球溶液的浓度为0.1-10wt％，所述sen4030a蛋白溶液的浓度为0.1-5mg/ml。

上述检测方法中，优选的，在10-40℃下偶联3-7小时，所述空白乳胶微球溶液的浓度为0.1-3wt％，所述sen4030a蛋白溶液的浓度为0.1-3mg/ml。

上述检测方法中，最优选的，在37℃下偶联5小时，所述空白乳胶微球溶液的浓度为1wt％，所述sen4030a蛋白溶液的浓度为0.6-0.7mg/ml。

上述检测方法中，所述预处理的方法为：将空白乳胶微球加入去离子水，离心，再加入缓冲液稀释，然后加入tritonx-100。

上述检测方法中，所述sen4030a蛋白的制备方法为：

根据肠炎沙门氏菌(salmonellaenteritis)的sen4030a的基因序列，如seqidno.2所示，设计引物克隆目的基因，构建其pet-32a表达载体，转化至工程菌中bl21中进行蛋白诱导表达，然后分离纯化sen4030a蛋白。

上述检测方法中，所述蛋白诱导表达的方法为：将细菌培养至od600nm为0.4-0.8时，加入iptg培养1-7h，其中iptg浓度为0.1-3mm/ml；

所述分离纯化的方法为：裂菌后收集上清，上层析柱，然后透析。

上述检测方法中，所述待测样品可以是血清、血浆、全血、新鲜组织、鲜奶或者经过处理过可以与致敏乳胶微球均匀接触的待检样品，所述处理，可以为，例如新鲜组织研磨后、离心取上清。

一种沙门氏菌蛋白乳胶凝集检测试剂盒，包括：

sen4030a蛋白溶液、空白乳胶微球悬浊液；

缓冲溶液a、处理液b；

所述缓冲溶液a为40mmol/l的mes缓冲液；处理液b为体积浓度为0.05％的tritonx-100溶液。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种沙门氏菌感染抗体乳胶凝集检测方法，利用sen4030a蛋白作为抗原制备致敏乳胶来检测沙门氏菌，sen4030a蛋白具有较强的特异性和免疫原性，制备的致敏乳胶无自凝现象、特异性强，重复性好且性质稳定。本发明的方法快速准确、简便易行，和商品化检测抗原相比，具有较高的准确性。

附图说明

图1为制备沙门氏菌蛋白乳胶凝集检测试验技术路线图。

图2为sen4030基因pcr结果；m：5000bpdna标准分子量，1:sen4030a基因片段。

图3为图4-2dh5α阳性克隆筛选结果；m：5000bpdna标准分子量，1-7:dh5α菌株。

图4为bl21(de3)测序结果。

图5为bl21(de3)阳性克隆筛选结果，m：5000bpdna标准分子量1-5:bl21(de3)菌株。

图6为重组蛋白sen4030apet-32a/bl21(de30)表达形式结果，m-蛋白标准分子量，1-细菌沉淀，2-细菌上清，3-空载体菌蛋白。

图7为重组蛋白sen4030apet-32a/bl21(de30)经不同浓度iptg诱导表达，m-蛋白标准分子量，1-未加iptg菌液上清，2-0.1mmol/liptg细菌上清，3-0.2mmol/liptg细菌上清，4-0.5mmol/liptg细菌上清，5-空载体细菌上清。

图8为重组蛋白sen4030apet-32a/bl21(de30)经不同时间诱导表达结果；m-蛋白标准分子量，1-空载体细菌上清，2-1h细菌上清，3-2h细菌上清，4-3h细菌上清，5-4h细菌上清，6-5h细菌上清。

图9为蛋白sen4030a纯化结果；m-蛋白标准分子量，1-纯化蛋白，2-空载体菌蛋白。

图10为sen4030a蛋白western-blot鉴定结果，m-蛋白标准分子量，1-空载体蛋白，2-纯化蛋白。

图11为乳胶自凝性检验结果：a.致敏乳胶与pbs反应(-)，b.致敏乳胶与生理盐水反应(-)。

图12为抗体致敏乳胶与各病毒反应结果；a.沙门氏菌(+++)，b.巴氏杆菌(-)，c.大肠杆菌(-)，d.鸭肝炎病毒(-)，e.pbs(-)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1sen4030a蛋白的表达

1重组质粒的构建

1.1肠炎沙门氏菌(salmonellaenteritis)的基因组dna提取

⑴.取1ml过夜振荡培养菌液于干净离心管中，12000rpm离心1min,吸除上清。

⑵.向细菌沉淀中加入300μl65℃预热重悬液，从分吹打混匀。

⑶.向溶液中加入150μl65℃预热裂解液，颠倒混匀，然后置于65℃水浴锅5min。

⑷.加入200μl氯仿，震荡混匀20s，此时呈乳白色浑浊状，12000rpm离心2min，将上清移至新的离心管，避免触及中间白色膜状物。

⑸.向上清中加入1.5倍体积膜结合液，颠倒混匀，吸出至吸附柱中，室温放置2min，然后12000rpm离心1min，倒掉收集管中废液。

⑹.向吸附柱中加入500μl通用漂洗液，12000rpm离心1min，倒掉收集管废液，重复洗一次。然后倒出废液，将吸附柱放入收集管12000rpm离心2min，除去残留液体。

⑺.将吸附柱放入新的离心管，加入50μl洗脱液，室温放置3min，12000rpm离心1min，重复洗脱一次以收集更多dna。

1.2pcr扩增

根据沙门氏菌sen4030a基因序列，其序列如如seqidno.2所示，设计引物，并在引物前分别添加bamhi和xhoi两个酶切位点，引物为：

f:cgggatccagggtggaagatgaggc,

r:ccgctcgagttattctaccgtcagggtatgta。以沙门氏菌(salmonellaenteritis)基因组dna为模板进行pcr扩增，预期片段大小为1500bp。

pcr的反应体系

将混合物混匀后进行pcr扩增，循环参数为：94℃预变性5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸7min。离心回收扩增产物目的片段。

1.4pet-32a质粒的提取

⑴.3ml过夜培养含有pet-32a质粒的菌液后抽提pet-32a质粒

1.5回收产物及质粒双酶切

酶切体系如下，37℃2h，然后进行凝胶电泳，

回收酶切产物，回收操作同上。

1.6pcr产物与pet-32a质粒连接

将混合物置于16℃恒温水浴锅中连接过夜。

1.7dh5α感受态的转入及阳性克隆的筛选

1.将dh5α感受态细胞放置在冰上融化，取50μl于新离心管，加入20μl连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min。

2.将离心管放入42℃预热水浴锅热激45s，迅速转入冰上保持2min，过程中注意不要摇动离心管。

3.向离心管中加入500μl37℃预热lb肉汤培养基，37℃200rpm摇菌1h，最后将菌液涂到加有氨苄的lb琼脂培养基中，过夜培养。

4.在培养基中随机挑选10个菌落，做好编号，分别接种于含氨苄的lb肉汤培养基中，37℃200rpm摇菌3h。

5.取50μl菌液于pcr管中，100℃煮菌10min做模板，进行pcr鉴定。

6.筛选出阳性的菌液扩大培养，提取质粒，操作同上。

通过带有amp的lb平板筛选，选出7个阳性菌落，分别命名为d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7，pcr鉴定结果如图3所示。选取一个菌落继续摇菌8小时，送去北京华大科技有限公司测序，结果与genbank中sen4030基因序列一致，如图4所示。

1.8bl21(de3)感受态细胞的转入及阳性筛选

1.取3μl上述提取质粒加入到50μlbl21(de3)感受态细胞中，冰浴30min，转42℃45s，迅速冰浴2min，加入lb肉汤培养基，37℃摇菌1h，涂板过夜培养。

2.随机选取10个菌落接种于含有氨苄的lb肉汤培养基中培养3h，取菌液煮沸10min作为模板，挑选5个菌落进行pcr鉴定，均得到1500bp片段，结果如图5所示。

实施例2目的蛋白的诱导表达

2.1阳性的细菌的培养

经过pcr筛选出的阳性菌株37℃摇菌，当菌液od为0.4-0.8时，加入0.5mmol/liptg诱导蛋白表达，表达4小时后收集菌液，超声裂解后离心，分别将上清和沉淀进行sds-page电泳，结果上清和沉淀均出现明显条带，证明蛋白表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在，如图6所示。

包涵体的形成一般是在外源基因在大肠杆菌中表达时，由于蛋白合成速度过快，导致蛋白无法正确折叠，从而以包涵体形式存在，许多实验研究表明适当降低表达温度和摇床转数可以提高可溶性蛋白的表达量，但是本研究分别将菌置于150rpm/min摇床，25℃和16℃条件下过夜表达后进行sds-page，结果发现蛋白量变化并不明显。

按上述实验步骤，其他条件不变，分别加入0.1mmol/l、0.5mmol/l、1.0mmol/liptg，表达4小时后收集菌液，超生裂解后离心，取上清进行sds-page电泳，通过条带亮度判断蛋白表达量的高低，结果如图7所示。

按上述实验步骤，其他条件不变，在加入0.5mmol/liptg后，每隔一小时取菌液超声裂解，取上清进行sds-page电泳，结果如图8所示，通过条带亮度判断蛋白表达量的高低，表达时间4小时时，效果较优。

以上实验表明，该蛋白37℃条件下，加入0.5mmol/liptg摇菌4h蛋白表达最高，条件最优。

2.3蛋白纯化和鉴定

以上述条件大量表达蛋白后，进行蛋白纯化：按1：100比例加入菌液摇菌500ml，收集菌液，加入适量pbs，超生裂解菌体至溶液透亮，4℃8000rpm离心10min，收集上清。用ni-agarosehis标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化，纯化结果如图9所示。

将纯化后的蛋白透析48h，除掉杂质，用bca蛋白浓度测定试剂盒测定16倍稀释后的蛋白浓度为0.31mg/ml，进而得出透析蛋白浓度为4.96mg/ml。

将透析后的蛋白做western-blot鉴定，分别用沙门氏菌免疫小鼠血清作一抗，辣根酶标记山羊抗小鼠igg作二抗，曝光后结果如图10所示。结果证明预期蛋白(70kd左右)具有良好抗原性。

实施例3乳胶凝集实验方法

本实施例中所用的mes缓冲液为40mmol/l的mes缓冲液，配制方法为：mes7.81g，加入适量去离子水，然后用浓盐酸调节ph值至6.1，用去离子水定容至1l。

0.01mpbs缓冲液ph7.2配制方法为：nacl8.0g，kcl0.2g，kh2po40.2g,na2hpo4·12h2o2.9g加入去离子水定容至1l，用浓盐酸调整ph至7.2。

3.1乳胶预处理

取0.1μl，2.5％(w/v)空白乳胶微球，加入10ml去离子水，12000rpm离心15min，再加入10mlmes缓冲液稀释至1％(v/v)，加入tritonx-100，浓度至0.05％(v/v)，得到空白乳胶微球溶液。

3.1致敏乳胶微球的制备

将上述预处理后的空白乳胶微球溶液与sen4030a蛋白溶液混合，在4-60℃下偶联10小时。

通过调整蛋白sen4030a浓度、致敏温度、时间等条件，探讨乳胶微球的最佳制备条件：

将透析后的蛋白sen4030a用mes缓冲液作2倍、4倍、8倍、16倍、32倍稀释，加入等体积预处理后的空白乳胶微球悬液，bca法测定初始蛋白浓度，将混合液置于37℃水浴锅偶联4h，13000rpm离心10min终止偶联，测定上清中蛋白浓度，每组4个重复，计算平均值，得出偶联率，观察有无自凝现象，确定最佳偶联浓度。偶联率，其中a：偶联前蛋白浓度，b：偶联后蛋白浓度。结果如表1所示，在浓度为0.62mg/ml时，效果最好。

表1不同浓度蛋白致敏乳胶结果

(2)将蛋白用mes缓冲液作8倍稀释，加入等体积乳胶微球悬液，分别置于4℃、25℃、37℃、56℃中，每组4个重复，偶联4h，测定蛋白偶联率，并观察凝集情况，结果如表2所示。

表2不同温度下致敏乳胶

(3)将蛋白用mes缓冲液作8被稀释后，加入等体积乳胶微球悬液，置于37℃中，分别偶联1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，每组4个重复，测定偶联前后蛋白浓度，计算偶联率并观察凝集情况，结果如表3所示。

表3不同时间致敏乳胶结果

3.3乳胶自凝性检测

吸取适量致敏乳胶，分别于等量pbs、mes缓冲液在37℃偶联5hr，观察是否出现凝集现象。结果如图12所示，与pbs和mes均无凝集现象，说明致敏乳胶无自凝现象。

3.4乳胶特异性检测

吸取适量致敏乳胶，分别于巴氏杆菌血清、大肠杆菌血清进行反应，同时设立阴阳性对照，观察是否有凝集现象。结果如图12所示，说明致敏乳胶特异性强。

其中lat操作方法为：

取一洁净玻片，在玻片上滴加25μl抗体致敏乳胶，在其旁边滴加一滴待检血清样品并将两者迅速混合，并轻摇玻片约2min，使抗体致敏乳胶与待检血清样品混合均匀，在5min内观察结果并记录。同时设标准阴阳性对照。凝集判定标准：

⑴“++++”为全部乳胶凝集，乳胶颗粒完全凝集并聚集于液滴周围，液滴呈透明状态。

⑵“+++”为75％乳胶凝集，可见明显的乳胶颗粒，但液体稍浑浊。

⑶“++”为50％乳胶凝集，乳胶凝集颗粒不明显，液体亦比较浑浊。

⑷“+”为仅有少量乳胶颗粒凝集，液体仍为浑浊状态。

⑸“-”为乳胶不凝集，乳胶仍呈原有乳状，未见乳胶颗粒。

结果判定：当标准阳性抗原出现“++++”(100％)凝集现象且标准阴性抗原出现“-”(即不凝集)现象时，试验方可成立，否则重试。最终判定乳胶出现50％以上凝集者为阳性。

3.5沙门氏菌检测

采用上述3.4中lat操作方法，取一洁净玻片，在玻片上滴加25μl致敏乳胶，在其旁边滴加一滴待检血清样品，并将两者迅速混合，并轻摇玻片约2min，使抗体致敏乳胶与待检血清样品混合均匀，在5min内观察结果并记录。同时设标准阴阳性对照。根据凝集程度，进行判定。

3.6乳胶重复性检测

空白乳胶微球溶液的浓度为1wt％，sen4030a蛋白溶液的浓度为0.62mg/ml，37℃下偶联5小时，制备致敏乳胶。

重复检测乳胶微球的结果如表4，表明该抗原致敏乳胶重复性好且性质稳定。

表4重复性试验

3.6乳胶对比试验试验

用致敏乳胶和商品化检测抗原(鸡白痢沙门氏菌平板凝集抗原)同时检测80份血清，对比阳性数量，做好记录。结果如表5所示。

表5乳胶凝集与平板凝集对比

以上实验表明，lat具有较高的准确性。

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<110>中国农业大学

<120>一种沙门氏菌抗体乳胶凝集检测方法

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