一种基于单个量子点的用于检测DNA甲基转移酶的纳米传感器的制作方法

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种基于单个量子点的用于检测dna甲基转移酶的纳米传感器。

背景技术：

dna甲基化是细胞中主要的表观遗传修饰，在各种重要细胞过程中起关键作用，如基因调控，染色质结构维持和细胞发育。dna甲基化由dna甲基转移酶(mtases)家族催化。通过将甲基从s-腺苷甲硫氨酸(sam)转移到特定dna序列中的腺嘌呤或胞嘧啶残基，dna甲基转移酶可以建立和维持一定的基因组甲基化模式。异常的dna甲基转移酶活性可能会干扰正常的甲基化模式，导致包括癌症在内的许多疾病的发生。例如，dna甲基转移酶(1,3a和3b)的过表达与视网膜母细胞瘤的肿瘤发生密切相关。胞嘧啶dna甲基转移酶的活性在结肠癌进展期间增加。在非小细胞肺癌中dna甲基转移酶-1的表达升高。此外，通过特异性抑制剂抑制dna甲基转移酶活性为人类癌症的治疗提供了新的机会。因此，dna甲基转移酶的准确检测以及抑制剂的筛选对于疾病诊断和治疗至关重要。

目前，dna甲基转移酶检测的标准方法是基于其辅因子的放射性标记([甲基-³氢]-s-腺苷甲硫氨酸)，然而放射性物质的参与大大限制了该方法的广泛应用。为了避免放射性污染，已经开发了非放射性高效液相色谱(hplc)测定法，但是该方法过程繁琐，耗时多。最近，建立了各种新方法，包括比色法，化学发光法，荧光法，电化学法等。虽然这些方法为dna甲基转移酶的定量检测提供了有效的平台，但是它们仍然不足以灵敏的检测非常低丰度的靶标。为了提高检测的灵敏度，已经引入了几种信号扩增方法用于dna甲基转移酶的检测，例如核酸外切酶iii辅助的靶循环，核酸内切酶辅助的扩增，双链特异性核酸酶辅助扩增，滚环扩增(rca)和链置换扩增(sda)。在这些方法中，dna甲基转移酶的检测限已大大改善，然而，它们需要繁琐的多重探针和扩增模板来完成信号扩增步骤，并且由于非特异性扩增经常产生高背景信号。与传统的荧光蛋白和有机染料相比，半导体量子点具有光稳定性好，量子产量高，宽激发，窄发射的独特光学特性，已经广泛应用于生物成像和生物传感领域。然而迄今为止，鲜有通过整合单分子荧光检测和量子点技术用于检测dna甲基转移酶的报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，本发明提出一种基于单量子点的纳米传感器，所述纳米传感器仅涉及单个检测探针，避免了复杂的检测设计和繁琐的信号放大步骤，同时具有对dna甲基转移酶的高选择性与高灵敏度。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

首先，本发明提供一种基于单量子点的纳米传感器，所述纳米传感器包括：

3'末端生物素化的发夹检测探针，所述检测探针5'末端标记荧光团花菁5(cy5)，3'末端还标记有猝灭基团黑洞猝灭剂(bhq2)，茎区包含靶dna甲基转移酶的识别序列5'-gatc-3'；

表面包被链霉亲和素的量子点；

所述探针通过链霉亲和素-生物素相互作用连接到链霉亲和素修饰的量子点表面上，形成量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物；

所述纳米传感器还包括甲基化特异性核酸内切酶(dpni)。

本发明所述的纳米传感器，依靠量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物中cy5与量子点的荧光共振能量转移，对于荧光分子cy5的选择，虽然现有技术已有多种可与量子点发生荧光共振能量转移的荧光染料分子，如tamra/cy3/texasred/罗丹明等，但发明人通过对比试验研究发现，qd/cy5这一对组合在本发明所述方法中的荧光共振能量转移(fret)效率更高。

优选的，所述发夹检测探针长度为36nt，所述发夹检测探针的碱基序列为：5'-blackholequencher2(bhq2)-acagtgatcattgttttcaatgatcactgt-cy5-tttttt-biotin-3'；

优选的，本发明所述量子点为605qds；本发明所述605qds是指从公司invitrogencorporation(california,u.s.a.)购买得到的qdot605itk，它是一种streptavidin-coatedcdse/znsqds，最大发射波长为605nm。

优选的，所述纳米传感器还包括s-腺苷甲硫氨酸和甲基化特异性核酸内切酶反应缓冲溶液；

进一步优选的，所述甲基化特异性核酸内切酶反应缓冲溶液组成为：50毫摩尔每升的醋酸钾，20毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-醋酸，10毫摩尔每升的醋酸镁，100微克每毫升的牛血清白蛋白，ph7.9。

本发明还公开了所述纳米传感器用于检测dna甲基转移酶的方法，具体方法如下：

(1)将待测样品加入所述生物素化的发夹检测探针溶液中进行反应，反应结束后进行高温失活；

(2)向步骤(1)中加入表面包被链霉亲和素的量子点进行孵育反应；

(3)采用全内角反射荧光技术(tirf)的单分子成像系统对cy5的荧光信号进行检测，以定量检测待测样品中的dna甲基转移酶。

优选的，所述步骤(1)中反应温度为30-40℃(最佳为37℃)，反应时间为1h；高温失活反应温度为70-90℃(最佳为80℃)，反应时间为20分钟；

优选的，所述步骤(2)中孵育反应温度为室温(20℃)，反应时间为10min。

本发明还公开了上述纳米传感器和/或检测方法在检测dna甲基转移酶活性和/或筛选dna甲基转移酶抑制剂中的应用。

本发明所述纳米传感器检测方法的原理为：本发明技术方案首先设计了一个生物素化的发夹检测探针，其5'末端标记荧光团花菁5(cy5)，3'末端标记猝灭基团黑洞猝灭剂(bhq2)，茎区包含靶dna甲基转移酶的识别序列5'-gatc-3'。探针通过链霉亲和素-生物素相互作用连接到链霉亲和素修饰的量子点表面上，形成量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物。在该复合物中，由于量子点和花菁5可忽略的发射串扰以及量子点的发射和花菁5激发之间的显着光谱重叠，量子点用作荧光共振能量转移的供体，且花菁5用作荧光共振能量转移的受体。理论上，dna中相邻碱基之间的距离约为0.34nm，链霉亲和素修饰的量子点的最大半径为7.5nm。量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物中的量子点与花菁5之间的距离计算为9.2nm，且在荧光共振能量转移的范围内(对于量子点/花菁5，2r0＝14nm)。因此，量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂纳米结构中的量子点和花菁5之间可能发生有效的荧光共振能量转移，产生明显的花菁5发射，然而，花菁5的发射被附近的黑洞猝灭剂完全淬灭。当靶dna甲基转移酶存在时，dna甲基转移酶将催化识别序列5'-gatc-3'的甲基化，产生甲基化产物5'-ga^mtc-3'。随后，限制性核酸内切酶(dpni)可以切割甲基化的探针，导致黑洞猝灭剂部分从量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物中释放。因此，花菁5的发射恢复。最后，通过计算基于全内反射荧光成像的花菁5的光子，可以定量检测靶dna甲基转移酶。

本发明的有益效果：

1.本发明制备得到的纳米传感器用于检测dna甲基转移酶时，当靶dna甲基化酶dam的存在时，检测探针被特异性甲基化，随后被甲基化限制性核酸内切酶dpni切割，导致黑洞猝灭剂bhq2从检测探针中释放。因此，来自荧光共振能量转移的cy5的发射恢复，并且可以通过基于全内反射荧光(tirf)成像的单分子计数检测。整个过程仅涉及单个检测探针，避免了复杂的检测设计和繁琐的信号放大步骤，同时利用单分子检测技术分析时间短，样品消耗少的优点，提高了检测的简便性，并有效降低了假阳性信号的产生；

2.本发明充分利用了单分子检测的高信噪比以及基于单个量子点的荧光共振能量转移的纳米传感器的非常低的背景水平，通过结合单分子计数技术和基于单量子点的荧光共振能量转移，实现了极好的选择性以及非常高的灵敏度，经试验验证，计算得出检测限为0.002u/ml，比以往技术的检测限要低，甚至比无扩增步骤的内切酶介导的靶循环荧光测量的检测限低5倍，本方法可以进一步用于甲基化酶抑制剂的筛选以及复杂生物样品中的精确检测，极具推广应用之价值。

附图说明

图1：基于单量子点的纳米传感器灵敏的检测dna甲基转移酶的原理说明示意图。

图2：检测探针的甲基化及切割产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)分析。其中，泳道1，单独存在96纳摩尔每升的探针时的产物表征；泳道2，96纳摩尔每升的探针与10个单位的甲基化特异性核酸内切酶(dpni)存在时的产物表征；泳道3，96纳摩尔每升的探针与20个单位的dna甲基转移酶存在时的产物表征；泳道4，96纳摩尔每升的探针与10个单位的甲基化特异性核酸内切酶(dpni)和20个单位的dna甲基转移酶存在时的产物表征。

图3：(a)不存在靶dna甲基转移酶(对照)与存在靶dna甲基转移酶时的全内反射荧光成像(tirf)分析图。(b)不存在靶dna甲基转移酶(对照)与存在靶dna甲基转移酶时花菁5的计数，靶dna甲基转移酶的用量为40个单位每毫升。误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。

图4：不同浓度的dna甲基转移酶对应的花菁5的计数图。附图显示花菁5计数与dna甲基转移酶浓度的对数形式之间的线性关系。误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。

图5：溶血性嗜血杆菌甲基转移酶(hhaimtase)(40个单位每毫升)，cpg甲基转移酶(m.sssimtase)(40个单位每毫升)，dna甲基转移酶(40个单位每毫升)，牛血清白蛋白(bsa)(100纳摩尔每升)存在时的花菁5的计数测量值，使用不用任何酶处理的样品作为对照组(control)。误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。

图6：庆大霉素抑制dna甲基转移酶活性的分析，误差棒表示的是三次重复实验的标准偏差。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中对检测dna甲基转移酶的方法普遍存在检测灵敏度低、放射性污染、耗时较长等缺点。

有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种基于单量子点的纳米传感器，所述纳米传感器包括：

3'末端生物素化的发夹检测探针，所述检测探针5'末端标记荧光团花菁5(cy5)，3'末端标记猝灭基团黑洞猝灭剂(bhq2)，茎区包含靶dna甲基转移酶的识别序列5'-gatc-3'；

表面包被链霉亲和素的量子点；

所述探针通过链霉亲和素-生物素相互作用连接到链霉亲和素修饰的量子点表面上，形成量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物；

所述纳米传感器还包括甲基化特异性核酸内切酶dpni。

本发明的又一典型实施方式中，所述发夹检测探针长度为36nt，所述发夹检测探针的碱基序列为：5'-blackholequencher2(bhq2)-acagtgatcattgttttcaatgatcactgt-cy5-tttttt-biotin-3'；

本发明的又一典型实施方式中，所述量子点为605qds；本发明所述605qds是指从公司invitrogencorporation(california,u.s.a.)购买得到的qdot605itk，它是一种streptavidin-coatedcdse/znsqds，最大发射波长为605nm。

本发明的又一典型实施方式中，所述纳米传感器还包括s-腺苷甲硫氨酸和甲基化特异性核酸内切酶反应缓冲溶液；

本发明的又一典型实施方式中，所述甲基化特异性核酸内切酶反应缓冲溶液组成为：50毫摩尔每升的醋酸钾，20毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-醋酸，10毫摩尔每升的醋酸镁，100微克每毫升的牛血清白蛋白，ph7.9。

本发明的又一典型实施方式中，提供所述纳米传感器用于检测dna甲基转移酶的方法，具体方法如下：

(1)将待测样品加入所述生物素化的发夹检测探针溶液中进行反应，反应结束后进行高温失活；

(2)向步骤(1)中加入表面包被链霉亲和素的量子点进行孵育反应；

(3)采用全内角反射荧光技术(tirf)的单分子成像系统对cy5的荧光信号进行检测，以定量检测待测样品中的dna甲基转移酶。

本发明的又一典型实施方式中，所述生物素化的发夹检测探针溶液包含有生物素化的发夹检测探针，s-腺苷甲硫氨酸和甲基化限制性核酸内切酶(dpni)，所述发夹检测探针5'末端标记荧光团花菁5(cy5)，3'末端标记猝灭基团黑洞猝灭剂(bhq2)，茎区包含靶dna甲基转移酶的识别序列5'-gatc-3'；

表面包被链霉亲和素的量子点；

所述探针通过链霉亲和素-生物素相互作用连接到链霉亲和素修饰的量子点表面上，形成量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物；

所述纳米传感器还包括甲基化特异性核酸内切酶dpni。

本发明的又一典型实施方式中，所述发夹检测探针长度为36nt，所述发夹检测探针的碱基序列为：5'-blackholequencher2(bhq2)-acagtgatcattgttttcaatgatcactgt-cy5-tttttt-biotin-3'；

本发明的又一典型实施方式中，所述量子点为605qds；本发明所述605qds是指从公司invitrogencorporation(california,u.s.a.)购买得到的qdot605itk，它是一种streptavidin-coatedcdse/znsqds，最大发射波长为605nm。

本发明的又一典型实施方式中，所述纳米传感器还包括s-腺苷甲硫氨酸和甲基化特异性核酸内切酶反应缓冲溶液；

本发明的又一典型实施方式中，所述甲基化特异性核酸内切酶反应缓冲溶液组成为：50毫摩尔每升的醋酸钾，20毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-醋酸，10毫摩尔每升的醋酸镁，100微克每毫升的牛血清白蛋白，ph7.9。

本发明的又一典型实施方式中，所述步骤(1)中反应温度为30-40℃(最佳为37℃)，反应时间为1h；高温失活反应温度为70-90℃(最佳为80℃)，反应时间为20分钟；

本发明的又一典型实施方式中，所述步骤(2)中孵育反应温度为室温(20℃)，反应时间为10min。

本发明的又一典型实施方式中，公开了上述纳米传感器和/或检测方法在检测dna甲基转移酶活性和/或筛选dna甲基转移酶抑制剂中的应用。

下面结合实施例做进一步具体说明。

实施例1

dna甲基转移酶的检测及量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂纳米结构的形成：dna甲基转移酶的检测包括三个连续的步骤：第一，所有寡核苷酸用10×三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(tris-edta)缓冲液稀释制备储备溶液。1微摩尔每升的发夹探针于95℃在退火缓冲溶液(50毫摩尔每升的氯化钠，5毫摩尔每升的ph8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl))中反应4分钟，然后缓慢降至室温，形成的发夹探针基底储存在4℃使用。第二，发夹探针的甲基化和切割反应在50微升的反应体系中进行，包括96纳摩尔每升的发夹探针，不同浓度的dna甲基转移酶，1×甲基转移酶反应缓冲溶液(50毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl)，10毫摩尔每升的乙二胺四乙酸，5毫摩尔每升的2-巯基乙醇，ph7.5),160微摩尔每升的s-腺苷甲硫氨酸,6个单位的甲基化限制性核酸内切酶(dpni)以及1×限制性核酸内切酶反应缓冲溶液(50毫摩尔每升的醋酸钾，20毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-醋酸，10毫摩尔每升的醋酸镁，100微克每毫升的牛血清白蛋白，ph7.9)。反应在37℃下反应1小时，后在80℃下失活20分钟。第三,以上50微升的反应产物和2纳摩尔每升的量子点(605qd)于100微升的孵育缓冲溶液(3毫摩尔每升的氯化镁，100毫摩尔每升的ph8.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl)，10毫摩尔每升的硫酸铵)中室温反应10分钟，形成量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂纳米结构。

凝胶电泳：在与量子点反应前，甲基化和切割反应的产物用12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

单分子检测及数据分析：在单分子检测之前，先将反应产物用成像缓冲溶液(1毫克每毫升的葡萄糖氧化酶，0.4％(w/v)的d-葡萄糖，0.04％毫克每毫升的过氧化氢酶，50微克每毫升的牛血清白蛋白，67毫摩尔每升的甘氨酸-氢氧化钾，1毫克每毫升的水溶性维生素e，2.5毫摩尔每升的氯化镁，ph为9.4)稀释10倍。对于全内反射荧光成像，将10μl样品直接吸取到盖玻片上。使用蓝宝石488纳米的激光(50毫瓦，coherent，usa)激发量子点(605qd)。通过100×物镜(olympus，japan)收集量子点和花菁5的光子，并通过andorixondu897ememcd以500ns的曝光时间成像。使用图像j(imagej)软件选择图像区域(200×400像素)用于花菁5(cy5)分子的计数。

特异性和抑制剂分析：40个单位每毫升的cpg甲基转移酶(m.sssimtase)和5'-cg-3'甲基转移酶(hhaimtase)以及100纳摩尔每升的牛血清白蛋白(bsa)用于探究该方法的特异性。为了进一步探究庆大霉素的抑制作用，不同浓度的庆大霉素和96纳摩尔每升的发夹探针在1×甲基化反应缓冲溶液中于37℃反应15分钟。然后，将40个单位每毫升的dna甲基转移酶(mtase),6个单位的甲基化特异性核酸内切酶(dpni)和160微摩尔每升的s-腺苷甲硫氨酸加入到溶液中，在37℃反应1小时，后于80℃失活20分钟。实验与上述检测dna甲基转移酶的检测方式相同。

血清样品中dna甲基转移酶的检测：一个总反应体积为50微升的混合物，包括加入不同浓度dna甲基转移酶的5％的人血清，96纳摩尔每升的发夹探针，160微摩尔每升的s-腺苷甲硫氨酸，6个单位的甲基化特异性核酸内切酶(dpni),1×特异性核酸内切酶反应缓冲溶液，在37℃反应1小时，后在80℃失活20分钟。实验与上述检测dna甲基化酶的检测方式相同。

实施例2

2.1原理的实验验证

本发明技术方案原理：本发明技术方案首先设计了一个生物素化的发夹检测探针，其5'末端标记荧光团花菁5(cy5)，3'末端标记猝灭基团黑洞猝灭剂(bhq2)，茎区包含靶dna甲基转移酶的识别序列5'-gatc-3'。探针通过链霉亲和素-生物素相互作用连接到链霉亲和素修饰的量子点表面上，形成量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物。在该复合物中，由于量子点和花菁5可忽略的发射串扰以及量子点的发射和花菁5激发之间的显着光谱重叠，量子点用作荧光共振能量转移的供体，且花菁5用作荧光共振能量转移的受体。理论上，dna中相邻碱基之间的距离约为0.34nm，链霉亲和素修饰的量子点的最大半径为7.5nm。量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物中的量子点与花菁5之间的距离计算为9.2nm，且在荧光共振能量转移的范围内(对于量子点/花菁5，2r0＝14nm)。因此，量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂纳米结构中的量子点和花菁5之间可能发生有效的荧光共振能量转移，产生明显的花菁5发射，然而，花菁5的发射被附近的黑洞猝灭剂完全淬灭。当靶dna甲基转移酶存在时，dna甲基转移酶将催化识别序列5'-gatc-3'的甲基化，产生甲基化产物5'-ga^mtc-3'。随后，限制性核酸内切酶(dpni)可以切割甲基化的探针，导致黑洞猝灭剂部分从量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物中释放。因此，花菁5的发射恢复。最后，通过计算基于全内反射荧光成像的花菁5的光子，可以定量检测靶dna甲基转移酶。

为了验证探针的甲基化以及随后的切割反应，我们在不同条件下处理花菁5/黑洞猝灭剂双标记探针，通过直接激发花菁5，用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)来分析产物。如图2所示，当仅存在探针时，不能观察到花菁5激发的特征条带(泳道1)，说明探针中的黑洞猝灭剂完全淬灭了花菁5。相比之下，当甲基化限制性核酸内切酶(dpni)和dna甲基转移酶同时存在时，可以明显地观察到花菁5激发的特征条带(泳道4)，表明探针被切割，黑洞猝灭剂从中释放，且花菁5的荧光恢复。此外，在没有dna甲基转移酶或甲基化限制性核酸内切酶(dpni)的情况下，同样观察不到花菁5的特征条带(泳道2和泳道3)，表明探针的切割只能在两种酶同时存在时发生。这些结果清晰地表明，检测探针可以被靶dna甲基转移酶甲基化，随后被甲基化限制性核酸内切酶(dpni)特异性切割。

为了验证dna甲基转移酶检测的可行性，通过基于全内反射荧光(tirf)成像的单分子计数来检测dna甲基转移酶的活性。如图3a所示，随着量子点(605qd)在波长488nm的激发，在靶dna甲基转移酶的存在下，可以检测到明显的花菁5(cy5)信号。相反，在没有dna甲基转移酶的存在下(control)，则不能检测到花菁5(cy5)信号。此外，通过花菁5的计数也可以定量测量dna甲基转移酶的活性。如图3b所示，在dna甲基转移酶的存在下可以检测到显著高的花菁5计数，而在没有dna甲基转移酶(control组)的情况下，则不能观察到明显的花菁5计数。综上所述，本技术方案完全可行。

2.2灵敏度检测

为了测定本技术方案检测dna甲基转移酶的灵敏度，我们在不同浓度的dna甲基转移酶下测量花菁5的计数。如图4所示，随着dna甲基转移酶的浓度从0增加到80u/ml，花菁5计数依次增加。值得注意的是，在对数刻度上，花菁5的计数与dna甲基转移酶的浓度从0.004至2u/ml的范围内呈现线性相关(图4)。

其回归方程为n＝57.02+16.98log10c，计算得出检测限为0.002u/ml，比以往技术的检测限要低，甚至比无扩增步骤的内切酶介导的靶循环荧光测量的检测限低5倍。提高的灵敏度主要由于以下原因：(1)一个单量子点上连接多个检测探针，使荧光共振能量转移的效率足够高；(2)单分子检测有足够高的信噪比；(3)基于单量子点的荧光共振能量转移的纳米传感器会产生。综上说明该技术方案的灵敏度足够高。

2.3特异性检测

为了评估本技术方案的特异性，我们用cpg甲基转移酶(m.sssimtase)，溶血性嗜血杆菌甲基转移酶(hhaimtase)以及牛血清白蛋白(bsa)作为负对照进行特异性实验。cpg甲基转移酶(m.sssimtase)催化序列5'-gcgc-3'中的胞嘧啶残基的甲基化，溶血性嗜血杆菌甲基转移酶(hhaimtase)催化序列5'-cg-3'中胞嘧啶残基的甲基化，牛血清白蛋白(bsa)作为不相关的蛋白对照。理论上，这些非特异性靶标都不能催化检测探针的甲基化，以产生甲基化特异性核酸内切酶(dpni)的5'-ga^mtc-3'识别位点，因此黑洞猝灭剂无法从量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物中释放出来，进而检测不到花菁5的信号。如图5所示，在靶dna甲基转移酶存在时，可以观察到明显增强的花菁5的信号。相比之下，cpg甲基转移酶(m.sssimtase)，溶血性嗜血杆菌甲基转移酶(hhaimtase)以及牛血清白蛋白(bsa)存在时，与没有任何酶的对照组相比，都没有明显的花菁5信号变化。由此表明，本技术方案有高度特异性，能够区分靶dna甲基转移酶和非靶dna甲基转移酶以及其他不相关蛋白，能够用于在复杂的生物环境中检测靶dna甲基转移酶。

2.4dna甲基转移酶的抑制剂分析

为了检测本技术方案能否用于检测dna甲基转移酶的抑制剂，我们用一种众所周知的广谱抗生素—庆大霉素，作为模型抑制剂。如图6所示，随着庆大霉素浓度从0增加到50微摩尔每升，dna甲基转移酶的相对活性显著降低。计算得到庆大霉素的半抑制浓度(ic50，即将dna甲基转移酶的活性降低50％所需的抑制剂浓度)为11.25微摩尔每升，这与所报告的半抑制浓度(ic50)为10.0微摩尔每升是一致的。这些结果清晰地表明，我们所提出的检测方法可以成功应用于dna甲基转移酶抑制剂的筛选，对抗生素的发现具有很大的潜力。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。