一种肝素测定的试剂盒的制作方法

本发明属于医学体外诊断领域，具体涉及一种肝素测定的试剂盒，尤其是涉及一种发色底物法(一步法)检测肝素活性的肝素测定试剂盒。

背景技术：

肝素是一种酸性黏多糖，由分布在肠黏膜的肥大细胞合成。正常人血液中含量极少，生理情况下其抗凝作用很小。它可通过加速抗凝血酶、hcⅱ起抗凝作用，对tfpi和蛋白c系统也有影响。天然肝素是不均一的，其分子量在3-57kd之间(王振义.血栓与止血基础理论与临床[m].第三版.上海：上海科学基础出版社，2004:119-119)。临床上把肝素作为抗凝剂药物而广泛使用，主要用于血栓性疾病的治疗及心血管手术上、血液透析、体外循环等过程的抗凝处理。

肝素是临床医学中一种最常用的抗凝治疗剂，肝素类药物在抗血栓药物中占有极大的市场份额，其中又以低分子肝素类药物占主导。作为药物，肝素活性功能的精确检测无论对于生产过程的质量控制还是临床治疗中患者的动态监控均具有重要的意义。目前肝素测定方法主要为凝固法和发色底物法(us4234682、us4948724、us5308755a、cn104048931a、cn103063592a、cn103323416a；tench,lampingrj,hennycp,etal.automatedamidolyticmethodfordeterminingheparin,aheparinoid,andalow-mrheparinfragment,basedontheiranti-xaactivity[j].clinicalchemistry,1984,30(6):860-864)。凝固法是较为传统的肝素活性测定方法，其操作繁琐、专属性差、耗时费力、精确度低，而发色底物法利用肝素糖链中含有与抗凝血酶高亲和的五糖结构域，能够特异性结合体内抗凝血酶(at)，形成肝素-抗凝血酶复合物，肝素-抗凝血酶复合物能够抑制活化的凝血因子ⅹ(或凝血因子ⅱ)水解发色底物的显色反应的基本原理，具有灵敏度高、操作简便、特异性强的特点。研究显示在抗ⅹa因子相互作用过程中，只需含肝素核心五糖结构域糖链激活at进而达到抗凝血的目的；在抗ⅱa因子相互作用过程中不仅需要肝素包含有核心五糖结构域，还要包括至少十八个单糖组成的糖链(laneda,dentonj,flynnam,etal.anticoagulantactivitiesofheparinoligosaccharidesandtheirneutralizationbyplateletfactor4.[j].biochemicaljournal,1984,218(3):725-732)。目前国际上已有用发色底物法取代血液凝固法的趋势。在第六次肝素国际标准品协作标定中，who已将抗ⅹa因子和抗ⅱa因子活性测定作为推荐使用的标定方法，美国药典第37版以及欧洲药典第8.3版均采用该方法测定肝素效价。2015年版的《中国药典》肝素效价的测定方法也将凝固法改为发色底物法测定肝素抗ⅱa因子活性。

临床上使用试剂盒测定以有效地反应肝素在血浆中的浓度，目前市面上有许多商品化的肝素测定试剂盒出售，绝大多数产品为发色底物法且多为进口产品。市面上采用发色底物法的肝素测定试剂盒有两种，一种是两步法，该法不依赖于血浆中的at含量，检测样品血浆中总肝素含量。该法的肝素测定试剂盒有两类，一类市售试剂盒中包含抗凝血酶(at)、牛fⅹa或者人fⅹa、缓冲液和发色底物，如sekisui公司的heparin(anti-fⅹa)、il公司的heparin-0020009400、siemens公司的heparin、stago公司的heparin及aniara公司的biophenheparinanti-ⅹa(2stages)等，另一类市售试剂盒中包含抗凝血酶(at)、牛fⅱa、缓冲液和发色底物，如sekisui公司的heparin(anti-fⅱa)及aniara公司biophenheparinanti-ⅱa(2stages)等，此类试剂无法用于检测低分子量肝素(lmwh)。另外一种是一步法，该法市售试剂盒中包含牛fⅹa和发色底物，如il公司的liquidheparin-0020300100，aniarabiophenheparinlrt(液体)及biophenheparin(冻干)等，该法检测样品血浆中起抗凝作用的肝素。

我国对血液的管理比较严格，人血来源受限，且牛fⅹa的制备方法简便且由来已久，因而专利报道中优选的fⅹa来源以及市售肝素测定试剂盒(发色底物法)中fⅹa组分绝大部分来自牛血。然而，相比牛血资源，我国猪血资源更为丰富，利用率却不高。此外，临床上应用的肝素类药物种类较多，目前发色底物法测定肝素时需要依据不同种类的肝素制定相应的新的标准曲线。这一定程度上降低了肝素测定试剂盒(发色底物法)的简便性。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对目前现有肝素测定试剂盒存在的不足，提供一种发色底物法(一步法)检测肝素活性的试剂盒，该试剂盒一定程度下解决血浆的来源，更符合中国国情，同时制备方便，操作简便，具有较高的灵敏度和稳定性，检测结果精确度高，市场竞争优势强。

为实现本发明的目的，本发明提供如下技术方案。

一种肝素测定的试剂盒，包含猪fⅹa、acharansulfate裂解酶和发色底物。

其中，所述猪fⅹa为活化猪血浆凝血因子ⅹ，可由本领域技术人员通过已知的分离纯化方法从猪血浆中提取纯化制备得到,如参考churchwr等人的文献(churchwr,mannkg.asimplepurificationofhumanfactorxusingahighaffinitymonoclonalantibodyimmunoadsorbant[j].thrombosisresearch,1985,38(4):417-424.)。

本发明所述试剂盒中的所述acharansulfate裂解酶与肝素酶ⅱ性质相似，能够修饰和剪切糖胺聚糖链，对肝素及硫酸肝素均有一定的裂解作用，可由本领域技术人员通过已知的分离纯化方法从bacteroidesstercoris制备而得，如参考kimbt等人的文献(kimbt,hongsw,kimws,etal.purificationandcharacterizationofacharansulfatelyases,twonovelheparinases,frombacteroidesstercoris,hj-15[j].europeanjournalofbiochemistry,2001,268(9):2635-2641.)。

在发色底物法检测肝素的活性的过程中，发色底物作为fⅹa底物，要求具有较高的敏感性和较好的水溶性，才能有效提高检测的灵敏度，保证检测结果的准确性。作为优选，本发明所述试剂盒中的所述发色底物为suc-ile-glu-(γ-piperidyl)-gly-arg-pna·hcl、z-d-arg-gly-arg-pna·hcl或bz-ile-glu(-or)-gly-arg-pna·hcl。更优选为suc-ile-glu-(γ-piperidyl)-gly-arg-pna·hcl。

在一些实施方案中，所述试剂盒包含r1试剂和r2试剂，所述r1试剂包含猪fⅹa，所述r2试剂包含acharansulfate裂解酶和发色底物。即猪fⅹa单独作为试剂盒的其中一个组分，而将acharansulfate裂解酶和发色底物作为试剂盒的另一个组分。

本发明所述试剂盒中所述r1试剂和r2试剂为冷冻干燥试剂。

所述r1冷冻干燥剂由猪fⅹa、缓冲剂、稳定剂和赋形剂的试剂经冷冻干燥制成。

所述r1试剂中的缓冲剂选自磷酸盐缓冲液和tris缓冲液的任意一种，优选为tris-hcl缓冲液，浓度为10-50mm，ph范围为6.5-9.0。

所述r1试剂中的所述稳定剂和赋形剂选择本领域技术人员已知的稳定剂和赋形剂。所述稳定剂为bsa、peg6000、edta及抑肽酶中至少一种，优选bsa和/或peg6000，浓度为1-10mg/ml。所述赋形剂为右旋糖酐40、蔗糖及甘露醇中至少一种，优选甘露醇，浓度为50-200mm。

所述r2冷冻干燥剂由acharansulfate裂解酶、发色底物、缓冲剂、硫酸葡聚糖、稳定剂和赋形剂的试剂经冷冻干燥制成。

所述r2试剂中的缓冲剂选自磷酸盐缓冲液和tris缓冲液的任意一种，优选为tris-hcl缓冲液，浓度为10-50mm，ph范围为6.5-9.0。

所述r2试剂中的所述硫酸葡聚糖浓度为0.01-0.025g/l，硫酸葡聚糖可以降低样品血浆中pf4等对肝素测定的影响。

所述r2试剂中的稳定剂和赋形剂选择本领域技术人员已知的稳定剂和赋形剂。优选的，所述稳定剂为bsa、peg6000及edta中至少一种，优选peg6000，其浓度为1-10mg/ml。所述赋形剂为右旋糖酐40、蔗糖及甘露醇中至少一种，优选甘露醇，浓度为50-200mm。

用本发明所示试剂盒检测样本肝素活性的过程中，检测方法可以是终点法或者动态法。

本发明还提供了一种肝素测定的方法，含acharansulfate裂解酶和发色底物的试剂直接与待测样品血浆混合后于37℃下孵育0.5-2分钟，再加入含猪fⅹa的试剂混合均匀，于37℃下作用3分钟后，读取上述样品于405nm波长下的吸光度值，根据已知的标准曲线计算得到待测样品血浆中的肝素含量。

acharansulfate裂解酶能够使待测样品中的肝素部分降解，但保留其与at结合的能力。acharansulfate裂解酶酶活定义为在特定条件下，1min内转化1μmol肝素不饱和寡糖链所需酶量，称为一个国际单位(iu或u)。

值得注意的是，在上述任一试剂检测样品肝素活性的过程中，所述冻干型试剂用蒸馏水复溶后各组分的浓度被定义为其工作浓度。

在一些实施方案中，所述试剂盒包含r1试剂和r2试剂，所述r1试剂包含猪fⅹa，所述r2试剂包含acharansulfate裂解酶和发色底物。其中，所述猪fⅹa的工作浓度优选为0.1-0.45u/ml，更优选为0.25u/ml。所述acharansulfate裂解酶的工作浓度优选为0.05u/ml-0.7u/ml，更优选为0.5u/ml；所述发色底物的工作浓度优选为1.2-3.0mg/ml，更优选为1.5mg/ml。所述r2试剂与样品血浆混合体积比为1:1。

与现有技术相比，本发明所述试剂盒至少具有如下特点之一：

(1)所述fⅹa由猪血浆制备而得，解决血浆来源，适合中国国情，制备方便，降低成本；

(2)一条标准曲线可用于多种肝素类药物的检测，无需制定多条不同肝素类药物的标准曲线，操作简便；

(3)检测血浆样品无需稀释，检测结果灵敏度高，稳定性好，精确度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明试剂盒的校准曲线；

图2为本发明试剂盒与现有市售试剂盒检测结果的相关性分析。

具体实施方式

本发明公开了一种肝素测定试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中，所述猪fⅹa参考churchwr等人的文献(churchwr,mannkg.asimplepurificationofhumanfactorxusingahighaffinitymonoclonalantibodyimmunoadsorbant[j].thrombosisresearch，1985，38(4):417-424.)制备得到。所述发色底物均购自吉尔生化(上海)有限公司，如suc-ile-glu-(γ-piperidyl)-gly-arg-pna·hcl。

实施例1肝素测定试剂盒的组成及制备方法

r1试剂主要由以下原料配制而成：猪fⅹa浓度为1.25u/ml，tris为50mm、bsa为6.64mg/ml、聚乙二醇-6000为10mg/ml及甘露醇为100mm，用6mhcl调ph至8.4，以1ml/瓶分装冻干。

r2试剂由以下试剂配制而成：发色底物suc-ile-glu-(γ-piperidyl)-gly-arg-pna·hcl为3.0mg/ml，acharansulfate裂解酶为1.0u/ml，tris为50mm，硫酸葡聚糖0.02g/l，聚乙二醇-6000为10mg/ml及甘露醇为100mm，用6mhcl调ph至7.5，以1ml/瓶分装冻干。

实施例2检测试剂盒的测定方法

(1)将实施例1所得r1试剂、r2试剂进行复溶重建：

每瓶r1试剂用5ml蒸馏水复溶，每瓶r2试剂用2ml蒸馏水复溶。

(2)以biotekelx800酶标仪操作(终点法)为例，根据仪器说明，设定分析程序：测定波长为405nm；

首先用生理盐水将已知效价的肝素稀释成100u/ml的肝素。取10μl100u/ml的肝素，加入990μl人血浆标准品稀释，得1.0u/ml的肝素标准品。继续用人血浆标准品稀释1.0u/ml的肝素标准品，配制0.0、0.2、0.5、0.8、1.0u/ml的肝素5个标准点的样本，在37℃孵育30秒。取50μl稀释后样本，加入50μlr2试剂在37℃孵育60秒，再加入50μlr1试剂在37℃孵育180秒，再加入50μl20％乙酸溶液终止反应，于405nm下测定吸光度值(od405nm)。每管重复测定3次，以od405nm的均值为纵坐标，对应的肝素活性为横坐标，制作“活性-吸光度值”标准曲线。同理制定低分子量肝素标准曲线。肝素和低分子量肝素各个标准点的测定结果如表1所示，依照线性检验结果，普通肝素(ufh)和低分子量肝素(lmwh)的标准曲线很相近，且有较好的相关系数，运用spss17.0软件检验两条标准曲线间的显著性差异，协方差分析结果显示在置信度95％的水平下，两条标准曲线截距和斜率的检验结果sig.p值分别为0.693和0.524，均大于0.05，即两条标准曲线的截距和斜率无显著性差异，两者可以合并成一条共用的标准曲线。因此如图1所示，取各标准点两组测定数据的总平均值制定标准曲线，标准曲线方程为：y＝-0.5168x+1.0273，相关系数r＝0.9952。

表1各标准点测定结果分析

取待测样本，同上方法测定样本的吸光度值，代入标准曲线，即可以计算出待测样本中肝素的活性。

本试剂盒适用于各种品牌和型号半自动和全自动的检测仪上(生化分析仪或者血凝分析仪)。如法国思达高stacompact血凝仪、美国贝克曼库尔特aclelite血凝仪、德国becompactx血凝仪等，具体参数可根据仪器不同进行适当调整。

实施例3本发明试剂盒的分析性能评估

(1)灵敏度

以0.0u/ml的肝素标准品为空白样本，使用实施例1所得本发明试剂盒、实施例2所述检测方法，重复测定20次，计算此样本od405nm均值和标准差(sd)，以空白均值减两倍标准差代入校准曲线方程，计算最低检测限，其结果如表2所示。

表2最低检测限分析

表2结果显示：本发明试剂盒检测肝素的最低检测限可达0.02u/ml，低于市售肝素检测试剂盒(发色底物法，法国aniara公司biophenheparin试剂盒，货号：221006)说明书中所述的最低检测限(0.05u/ml)，即本发明试剂盒检测肝素的灵敏度高。

(2)稳定性

实施例1所得本发明试剂盒中r1、r2冷冻干燥试剂经蒸馏水复溶后均放置在常温下(18-25℃)。每天吸取一定体积的试剂，以理论值为0.2u/mllmwh、0.25u/mlufh、0.5u/mlufh及0.75u/mllmwh的肝素标准品为检测样品，然后按照实施例2所述检测方法进行检测，单个样品每天重复测定10次，市售肝素测定试剂盒(发色底物法)同步进行测定。单个样品每天吸光度测定均值结果以及spss17.0软件进行线性回归分析斜率的显著性检验结果如表3与表4所示。

表3本发明试剂盒试剂稳定性结果分析

表4法国aniara公司biophenheparin试剂盒试剂稳定性结果分析

表3及表4结果显示：试剂复溶后同样在常温下(18-25℃)下放置10天，在置信度95％的水平下，本发明试剂盒测定结果的回归线斜率在统计学上均无显著性(p≥0.05)，而法国aniara公司biophenheparin试剂盒(货号：221006)回归线斜率有显著性(p＜0.05)，即本发明试剂盒复溶后在室温下可以稳定保存10天，明显高于市售的试剂盒。这一结果说明本发明的试剂盒可以减少浪费，从而降低成本。

实施例4与已上市产品的比较

从上海交通大学医学院附属瑞金医院和上海中医药大学附属龙华医院的住院及门诊随机抽取经肝素治疗的病人血液样本共200份。血液按9:1的比例与0.109mol/l枸橼酸钠抗凝液混匀后，3000r/min离心15分钟，分离得到血浆。用实施例1所得本发明试剂盒和法国aniara公司biophenheparin试剂盒(货号：221006)分别对样本测定，计算两者的相关系数，并进行线性回归。结果显示两种试剂盒的相关系数r＝0.9935，线性回归方程为y＝1.0104x-0.0087，见图2。

根据美国临床实验室标准化组织(clsi)文件的要求(r＞0.975)，本发明试剂盒和法国aniara公司进口试剂盒的检测数据具有良好的一致性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。