狂犬病毒胶体金检测试剂及试剂盒的制作方法

本实用新型涉及检测检验技术领域，具体地涉及一种狂犬病毒胶体金检测试剂。

背景技术：

狂犬病(Rabies Virus，RV)病毒属于弹状病毒科、狂犬病病毒属，形态呈子弹状，病毒颗粒由外壳和核心两部分组成。病毒基因组由11930左右个核苷酸组成，为单链、不分节段的负链RNA，病毒粒子由5个结构蛋白构成，核蛋白(N)、磷蛋白(P)、膜基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和转录大蛋白(L)。狂犬病毒是一种人兽共患传染性病原体，该病是迄今为止人类唯一病死率高达100％的急性传染病，每年在世界范围内造成约5万以上死亡病例，亚洲是狂犬病持续高发地区，我国是养犬大国，也是狂犬病发病率较高的国家。预防狂犬病唯一有效的办法是及时接种狂犬病疫苗，同时加强检测疫苗免疫效果，以掌握免疫情况。

目前常见的狂犬病病毒病原检测方法为快速荧光灶抑制试验(RFFIT)法、荧光抗体病毒中和试验(FAVN)法、间接免疫荧光试验(IF)或分子生物学方法等，这些方法都具有特异性强、敏感性高等优点。但这些方法均存在检测时间长、对实验室条件要求高、操作技能要求高、操作繁琐及需要单份样品量多等缺点。鉴于此，开发免疫金标检测法，建立对犬分泌样品的病毒检测，以防止控制病毒的传播是非常必要的。

因此，本领域急需开发稳定性好、灵敏度高、使用方便快速的特异性检测狂犬病毒胶体金检测试剂。本实用新型狂犬病毒胶体金检测试剂现实上述特性要求。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于提供一种狂犬病毒胶体金检测试剂。

具体地，本实用新型的目的在于提供一种免疫快速检测狂犬病毒的检测卡，本实用新型的检测卡具有较高的灵敏度和准确性。

在本实用新型的第一方面，提供了一种狂犬病毒胶体金检测试剂，所述检测试剂包括一检测卡(侧流片)，所述的检测卡包括背衬(7)，以及位于所述背衬上的从近端到远端的以下结构：样品垫(1)、金标垫(2)、检测区(3)、质控区(4)、硝酸纤维素膜(5)、和吸收垫(6)；

并且所述的金标垫(2)包被有胶体金标记的狂犬病毒抗体-1；

并且所述检测区(3)包被有狂犬病毒抗体-2。

在另一优选例中，所述的抗体-1和所述的抗体-2结合于狂犬病毒的不同表位。

在另一优选例中，所述的抗体-1和所述的抗体-2为狂犬病毒特异性抗体。

在另一优选例中，所述的质控区(4)包被有能结合于所述狂犬病毒抗体-1的二抗。

在另一优选例中，所述的二抗为羊抗鼠IgG。

在另一优选例中，所述的40nm胶体金颗粒。

在另一优选例中，所述的背衬(7)为PVC板。

在另一优选例中，所述样品垫(1)为玻璃纤维。

在另一优选例中，所述吸收垫(6)为吸水纸。

在另一优选例中，所述的样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(5)、和吸收垫(6)粘贴于所述背衬上。

在另一优选例中，所述的样品垫(1)和金标垫(2)部分重叠。

在另一优选例中，所述的检测区(3)设置在靠近金标垫(2)的一侧，且所述的质控区(4)设置在靠近吸收垫(6)的一侧。

在另一优选例中，所述检测试剂还包括卡盒(8)，以及位于所述卡盒上的加样孔(9)和观察窗(10)。

在另一优选例中，所述的检测卡完全设置于卡盒(8)中，所述加样孔(9)对应于所述检测卡上的样品垫(1)，且所述观察窗(10)对应于所述检测卡上的检测区(3) 和质控区(4)。

在另一优选例中，所述卡盒的长度为80-90mm，宽度为10-20mm，且高度为 4-5mm。

在另一优选例中，所述检测卡的长度为60-70mm，且宽度为3-4mm。

在另一优选例中，所述的检测区(3)和质控区(4)位于硝酸纤维素膜(5)上。

在另一优选例中，所述检测试剂检测的样本包括全血、血浆、血清、分泌液(如唾液)、或组织样本。

在本实用新型的第二方面，提供了一种用于狂犬病毒胶体金检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(i)一容器；以及

(ii)如本实用新型第一方面所述的狂犬病毒胶体金检测试剂。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括说明书。

应理解，在本实用新型范围内中，本实用新型的上述各技术特征和在下文 (如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为本实用新型一种优选例的检测卡的结构剖视图。其中，1为样品垫，2 为金标垫，3为检测区，4为质控区，5为硝酸纤维素膜，6为吸收垫，7为背衬。

图2为本实用新型一种优选例的狂犬病毒胶体金检测试剂(检测卡和卡盒)的俯视图。其中，8为卡盒，9为加样孔，10为观察窗。

具体实施方式

本实用新型人经过广泛而深入地研究，首次开发了一种狂犬病毒胶体金检测试剂，所述检测试剂包括一检测片和一卡盒，检测片包括背衬7以及位于背衬上的样品垫1，金标垫2，检测区3，质控区4，硝酸纤维素膜5，吸收垫6，所述的金标垫(2)包被有胶体金标记的狂犬病毒抗体-1；并且所述检测区(3)包被有狂犬病毒抗体-2。本实用新型的检测试剂可特异性检测狂犬病毒，稳定性好、灵敏度高、使用方便。在此基础上，完成了本实用新型。

检测方法和工作原理

为了便于理解本实用新型，给出本实用新型检测试剂的检测原理。应理解，本实用新型的保护范围并不受该原理的影响或限制。

本发明提供的一种快速检测狂犬病毒的免疫检测试剂，其包括一检测卡和一卡盒，采用双抗体免疫夹心法原理检测狂犬病毒。具体地，是将胶体金标记的特异性抗狂犬病毒的抗体-1并吸附在结合垫上，将特异性抗狂犬病毒的抗体 -2固定在硝酸纤维膜上，再将结合垫和硝酸纤维膜组装到PVC板上，两头分别贴样品垫和吸水纸便形成检测条。检测时，当待检样本加到试纸条(检测卡)一端的样品垫后，液体样通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记物，如果样本中含有被检测的病毒时，病毒被胶体金标记的抗体捕获形成复合物，当复合物移动到膜的检测线处，又被固定在膜上的抗体捕获形成双夹心复合物，也就是病毒与胶体标记抗体(抗体-1)的结合物又被检测线处的特异性抗体 (抗体-2)结合而截留聚积在检测带上形成颜体色带，颜色强弱程度反映样品中病毒多少；如果样品中没有病毒，溶解的胶体金没有被检测线截留，在检测区没有出现颜色带，样品为阴性样品。为了便于判断反应进行和试剂的好坏，在质控区(C)固定质控线，所以不管结果怎样，质控线C始终出现色带，来证明试剂有效性。由此所述的检测试剂便于携带和保存、操作简单、检测过程 5-10min之内完成。

灵敏度

本实用新型的狂犬病毒胶体金检测试剂的灵敏度在10^3.0FCID50/ml以上。

特异性

本实用新型的狂犬病病毒检测试剂对犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒等病原检测结果均为阴性。

检测试剂的制造

在本实用新型中，所述检测试剂的各组分(或组件)可选用本领域已有的材料制成。

背衬7可以用任何稳定的、无孔的材料制成，其强度应足以支承材料和粘于其上的各组分。因为许多测定用水作为扩散介质，因此背衬7较佳地是基本上不透水的。在一个优选例中，背衬7是用聚合物膜制成的，更佳地是用聚氯乙烯膜制成的(如PVC胶板)。

样品垫1可用任何吸收性材料制成。可使用的材料例子包括：纤维素、玻璃纤维等。

吸收垫6可以用任何能吸收样品检测液的材料制成。吸收垫6的吸收能力应足够大，以便吸收添加至检测卡的液体全部经过检测区。适用于吸收垫6的材料的例子包括纤维素和吸水滤纸。

胶体金标记

胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。

胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA 等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

检测试剂的制备

本实用新型检测试剂的各组分(或组件)采用本领域通用的技术方法制造和组装。

优选地，用包被缓冲液稀释狂犬病毒抗体-2和质控抗体，将稀释后的两种捕获液分别均匀地包被于作为检测部件的硝酸纤维膜上，两种捕获液体渗入硝酸纤维素膜后分别形成检测区和质控区。

分别将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫通过粘合剂粘贴于背衬上。用切条机切成4mm的检测卡，置于卡盒内，加样孔对准检测卡样品垫位置，压紧后组装成检测试剂盒，加入干燥剂用铝箔密封包装保存。

检测试剂的结构

本实用新型的狂犬病毒胶体金检测试剂包括卡盒和位于卡盒内的检测卡 (侧流片、试纸条、检测条、或测试条)。

一种优选的检测卡的结构如图1所示，其包括背衬7，以及位于背衬上的：样品垫1、金标垫2、检测区3、质控区4(或对照区、对照线、质控线)、硝酸纤维素膜5、和吸收垫6。

一种优选的卡盒8的结构如图2所示，其上包括加样孔9和观察窗10。并且，所述的检测卡完全设置于卡盒8中，所述加样孔9对应于所述检测卡上的样品垫1，且所述观察窗10对应于所述检测卡上的检测区3和质控区4。

具体地，本实用新型的检测试剂具有以下特点：

背衬7的长度与检测卡相同。

样品垫1位于检测卡的一端，吸收垫6位于检测卡的另一端。

金标垫2上负载有胶体金标记的狂犬病毒抗体-1。

检测区3(也称检测线)位于样品垫1和吸收垫6之间，检测区3位于靠近样品垫1的一端，通常检测区设置在硝酸纤维素膜5上，通过所述硝酸纤维素膜连接标记的金标垫2和吸收垫6。优选地，所述硝酸纤维素膜5上还设置有质控区4(也称质控线)，质控区4位于检测区3和吸收垫6之间。

其中，所述的检测区3包被有狂犬病毒抗体-2，质控区4包被有二抗，所述二抗能结合于所述的狂犬病毒抗体-1。

本实用新型的优点：

本实用新型检测试剂可特异性检测狂犬病毒，稳定性好、灵敏度高、使用方便、常温保存和运输。

下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

狂犬病毒抗体制备

1.试验动物

2-3月龄健康比格犬，狂犬病病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒等抗原和抗体均为阴性。

2.动物免疫

用狂犬病病Flury-LEP株、CVS-11株、PV株和SAD株培养得到的狂犬抗原，此抗原与等体积的弗氏完全佐剂(弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司)混合均匀，并乳化完全，分别免疫3只比格犬，分点背部皮下注射，每只犬免疫5点，1ml/点。14天后进行第二次免疫，二免时，将每种抗原解冻后分别与等体积的弗氏不完全佐剂混合均匀，并乳化完全，免疫方法同一免。此后每间隔14 天按照弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂分别进行免疫，三免后每次免疫前采血测定血清中和抗体，直至中和抗体效价达到1:512以上时，一周后心脏采血，血液收集在灭菌容器内，置37℃孵育2小时，2～8℃过夜。无菌提取血清。将每种抗原的犬血清混合后用0.45μm滤器过滤除菌。分装，2ml/瓶，置-20℃以下保存，或冻干保存。

3.抗体纯化，饱和硫酸铵和免疫血清按1：2沉淀，离心弃上清，沉淀用10mM pH7.2的PBS透析，再用亲和柱进一步纯化得到抗狂犬病毒抗体。

实施例2

检测狂犬病毒的检测卡的制备

1、金标垫制备

选40nm胶体金，用0.1M K2CO3调pH到等电点附近，以每毫升胶体金5μg 抗体-1进行标记，标记液离心后得沉淀，沉淀用10mM pH7.2PBS溶解，并在 650nm下测定吸光值OD，以基础液稀释到1-3OD，涂铺聚脂材料上，在37℃，在相对湿度小于20％干燥室烘干10小时，即狂犬抗体-Au金标垫。

2、硝酸纤维素膜检测区和对照区的制备

在硝酸纤维膜的检测区上包被浓度0.4mg/ml含2％蔗糖的0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液中的抗体-2，同时在对照区包被浓度为0.8mg/ml含2％蔗糖的0.01M pH7.3磷酸盐缓冲的羊抗鼠IgG，包被量为10μl/cm²，在37℃，相对湿度小于 20％干燥室烘干15小时。

3、样品垫的制备

按下20mM pH7.4磷酸缓冲液含胆酸钠0.5％，S17 1％配制，均匀铺在样品垫聚酯纤维上并维持在37℃，相对湿度小于20％烘干。

4、测试卡组装

将包被抗体和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、吸水纸、一定宽度的胶体金标记垫、样品垫依次贴在PVC板上组成测试大卡，将大卡切3-4mm条装入卡中，装入铝箔袋中封好，就是组成完整的相应的病毒测试卡。

实施例3

样品的检测

1.采集检测样本，样本可以是全血、血浆、血清、分泌液(如唾液、脑积液)、排泄物或组织样本，本实施例采用新鲜唾液或脑积液的稀释液作为检测样本；

2.将检测卡平放，用滴管吸取待检样本液，垂直滴加2-3滴于加样孔中，加样后开始计时。

3.5-10分钟读取检测结果。

4.结果判断：

A：检测区、和质控区同时变色(红色)，表明检测样本中含有狂犬病毒，检测结果为阳性。

B:质控区变色(红色)，而检测区不变色，表明检测样本中不含狂犬病毒或狂犬病毒的浓度低于最低检测值，检测结果为阴性。

C：质控区不变色，无论检测区是否变色，均表明本次检测无效。

在本实用新型提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本实用新型的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。