抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法及应用与流程

本发明涉及免疫分析检测，特别涉及一种用于免疫分析检测的抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒及检测方法，属于化学领域。

背景技术：

可视化免疫分析法具有操作简单、不需要特殊仪器等特点，在各种疾病的预防、诊断和治疗中受到了广泛的关注。目前，标准化的可视化免疫分析法通常使用酶标记的抗体来催化显色反应，进而达到定量分析的目的。然而，在实际应用中，天然酶存在诸多问题，比如热稳定性差、易受环境影响、制备和纯化费用高、灵敏度低等。

随着纳米科技与纳米材料的发展，基于纳米材料的可视化免疫分析法的灵敏度和稳定性得到了显著提升。一般来说，纳米材料在可视化免疫分析实验中的作用可以分为四种类型：作为纳米酶催化显色反应；作为显色底物，通过目标分子引起纳米材料聚集或形貌尺寸的变化；作为载体，负载大量的天然酶或者显色剂；作为前驱体，释放出能够催化显色反应的金属离子。其中，纳米酶具有成本低、催化活性可控、稳定性高等优点。纳米酶主要包括碳、金属和金属氧化物等纳米材料。在葡萄糖和过氧化氢的催化反应中，它们通常发挥类似于氧化酶、过氧化氢酶或歧化酶的功能。基于纳米酶的免疫分析方法简单有效，但是，纳米酶在可视化免疫分析的实际应用方面仍存在着一些问题。例如，相比于天然酶，大部分纳米酶具有较低的催化活性，弱的结合力和较差的底物特异性。在实验过程中，需要对纳米材料的表面进行修饰，从而进行分子识别和降低非特异性吸附。然而，这些修饰成分通常会降低纳米酶（特别是金属和金属氧化物类纳米材料）的催化活性。因此，构建用于可视化免疫分析的新型纳米酶或纳米催化体系具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服目前的抗原检测方法中存在的上述缺陷，提供一种抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法及应用。

为实现本发明的目的，采用了下述的技术方案：抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法，所述制备方法为：将聚乙烯亚胺包裹的中孔二氧化硅纳米颗粒加入到将含有吡咯喹啉醌的磷酸缓冲溶液，震荡12小时左右；然后加入含有检测抗体的磷酸缓冲溶液，继续震荡反应1小时左右，离心洗涤，下层沉淀分散于磷酸缓冲溶液，于4 ℃下保存备用；使用前，用含有牛血清白蛋白的磷酸缓冲溶液稀释。

进一步的；所述的聚乙烯亚胺包裹的中孔二氧化硅纳米颗粒采用以下方法制备：

A：中孔二氧化硅纳米颗粒的制备：将十六烷基三甲基溴化铵溶解于超纯水中，然后加入氢氧化钠溶液，于80 ℃下搅拌反应15 min，再缓慢加入四乙氧基硅烷溶液，剧烈搅拌20 min，将得到的白色沉淀抽滤，用水和甲醇依次洗涤，再于80 ℃下干燥；干燥后的固体分散于盐酸和甲醇的混合溶液中，回流反应12小时左右，再次用水和甲醇洗涤，在60 ℃下进行真空干燥，即得到中孔结构的二氧化硅纳米颗粒；

B：聚乙烯亚胺包裹的中孔二氧化硅纳米颗粒的制备：即将步骤（1）中制备得到的中孔二氧化硅纳米颗粒加入到聚乙烯亚胺水溶液中，搅拌反应12小时左右，离心洗涤，在60 ℃下进行真空干燥。

抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒的应用，所述的抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒用于抗原检测。

进一步的；用于抗原检测的具体方法步骤为：向链霉亲和素功能化的磁球中加入含生物素功能化的捕获抗体的磷酸缓冲溶液，反应30~60分钟，采用磁铁进行分离，用磷酸缓冲溶液洗涤，弃掉上层清液，下层沉淀分散于磷酸缓冲溶液；然后加入含抗原的磷酸缓冲溶液，混合震荡，孵育；磁力分离和洗涤，下层沉淀分散于磷酸缓冲溶液，再加入检测抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒和牛血清白蛋白混合溶液，震荡反应；磁力分离和洗涤，下层沉淀分散于含三(2-羧乙基)膦和三价铁离子-菲嗪络合物的磷酸缓冲溶液，用肉眼观察溶液颜色变化或者用紫外可见分光光度计测定溶液在562 nm处的吸收值。

进一步的；所述的抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒用于前列腺特异抗原的检测，具体检测方法为：向链霉亲和素功能化的磁球中加入含生物素功能化的前列腺特异性抗原的捕获抗体的磷酸缓冲溶液，反应30~60分钟，采用磁铁进行分离，用磷酸缓冲溶液洗涤，弃掉上层清液，下层沉淀分散于磷酸缓冲溶液；取制备的捕获抗体修饰的磁球，加入含前列腺特异性抗原的磷酸缓冲溶液，混合震荡，孵育30分钟左右；磁力分离和洗涤，加入检测抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒和牛血清白蛋白混合溶液，所述的检测抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒中的抗体为前列腺特异性抗原的抗体，震荡反应30分钟左右；磁力分离和洗涤两次，下层沉淀分散于含三(2-羧乙基)膦和三价铁离子-菲嗪络合物的磷酸缓冲溶液，用肉眼观察溶液颜色变化，或者用分光光度计测定溶液在562 nm处的吸收值。

本技术发明积极有益技术效果为：（1）中孔的二氧化硅纳米颗粒能够负载大量的负载吡咯喹啉醌；（2）通过吡咯喹啉醌催化三(2-羧乙基)膦和三价铁离子-菲嗪络合物间的氧化还原循环反应，建立用于抗原检测的比色分析方法，具有简单灵敏、直观、高通量、不需要特殊仪器等优点，该技术的研制成功将实现不同类型抗原的检测。

附图说明

图1是抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒的透射电镜图。

图2是链霉亲和素功能化的磁球经生物素功能化的捕获抗体、前列腺特异性抗原、抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒处理步骤后的透射电镜图。

图3是在不同浓度的前列腺特异性抗原存在下，溶液的紫外可见吸收光谱曲线。

图4是吸收值与前列腺特异性抗原浓度的关系曲线。

图5是该分析方法的选择性图示。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供本发明的实施实例。这些实施实例仅仅是对该工艺的阐述，不限制本发明的范围，本发明中用以下实施例说明，但不限于下述实施例，任何变化实施都包含在本发明的技术范围内。

本发明中抗体是前列腺特异性抗原的抗体。以下实施例以前列腺特异性抗原为例进行具体阐述。对附图进一步的解释，图1是抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒的透射电镜图。从图1中可以看出，所合成的纳米颗粒分散性较好，尺寸为80 nm左右。

图2是链霉亲和素功能化的磁球经生物素功能化的捕获抗体、前列腺特异性抗原、抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒处理步骤后的投射电镜图。从图中可以看出，抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒被磁珠捕获。

图3是在不同浓度的前列腺特异性抗原存在下，溶液的紫外可见吸收光谱曲线，前列腺特异性抗原的浓度依次是0, 0.005, 0.05, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 ng/mL。图4是吸收值与前列腺特异性抗原浓度的关系曲线，前列腺特异性抗原的浓度依次是0.005, 0.05, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 ng/mL，线性范围是0.005 ~ 0.5 ng/mL（见图4中的插图）。图5是不同蛋白质对紫外吸收值的影响，从1到6依次对应的是：50 ng/mL的免疫球蛋白G，50 ng/mL的甲胎蛋白，50 ng/mL的癌胚抗原，50 ng/mL的凝血酶，空白样品，2.5 ng/mL的前列腺特异性抗原。本发明中聚乙烯亚胺包裹的中孔二氧化硅纳米颗粒在目前的文献技术中具有成熟的技术方案。

一、多肽功能化的磁球的制备：

A：中孔二氧化硅纳米颗粒的制备：将50 mg十六烷基三甲基溴化铵溶解于200 mL超纯水中，然后加入1.75 mL的2 M氢氧化钠溶液，于80 ℃下搅拌反应15 min，再缓慢加入2.5 mL四乙氧基硅烷溶液，剧烈搅拌20 min，将得到的白色沉淀抽滤，用水和甲醇依次洗涤，再于80 ℃下干燥；干燥后的固体分散于盐酸（0.5 mL）和甲醇（50 mL）的混合溶液中，回流反应12小时左右，再次用水和甲醇洗涤，在60 ℃下进行真空干燥，即得到中孔结构的二氧化硅纳米颗粒；

B：聚乙烯亚胺包裹的中孔二氧化硅纳米颗粒的制备：即将500 mg步骤（1）中制备得到的中孔二氧化硅纳米颗粒加入到300 mg聚乙烯亚胺水溶液中，搅拌反应12小时左右，离心洗涤，在60 ℃下进行真空干燥。

二、抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒的制备：

将1 mg聚乙烯亚胺包裹的中孔二氧化硅纳米颗粒加入到将1 mL含有吡咯喹啉醌（12 µM）的磷酸缓冲溶液，震荡12小时左右；然后加入1 mL含有前列腺特异性抗原的检测抗体（50 µg）的磷酸缓冲溶液，继续震荡反应1小时左右，于5000 rpm条件下离心15 min，超纯水洗涤，下层沉淀分散于1 mL磷酸缓冲溶液（50 mM，pH 7.4），于4 ℃下保存备用；使用前，用含有牛血清白蛋白（0.1% w/v）的磷酸缓冲溶液稀释。

三、前列腺特异性抗原的检测

向l mL的200 µg/mL链霉亲和素功能化的磁球中加入含l mL的20 µg/mL生物素功能化的前列腺特异性抗原的捕获抗体的磷酸缓冲溶液，反应30~60分钟左右，采用磁铁进行分离，用磷酸缓冲溶液洗涤，弃掉上层清液，下层沉淀分散于4 mL磷酸缓冲溶液；取90 µL制备的捕获抗体修饰的磁球，加入10 µL含前列腺特异性抗原的磷酸缓冲溶液，混合震荡，孵育30分钟左右；磁力分离和洗涤，加入50 µL检测抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒和牛血清白蛋白混合溶液，震荡反应30分钟左右；磁力分离和洗涤两次，下层沉淀分散于100 µL含三(2-羧乙基)膦（0.5 mM）和三价铁离子-菲嗪络合物（0.2 mM）的磷酸缓冲溶液（pH 8.6），最后用肉眼观察溶液颜色变化，或者用分光光度计测定溶液在562 nm处的吸收值。图3是在不同浓度的前列腺特异性抗原存在下，溶液的紫外可见吸收光谱，结果表明，前列腺特异性抗原的浓度越大，溶液颜色越来越红，溶液的吸收光谱强度越强，该吸收是由溶液中生成的二价铁离子-菲嗪络合物产生的，当前列腺特异性抗原的浓度高于0.05 ng/mL时，用肉眼即可观察到溶液颜色的变化；图4是溶液在562 nm处的吸收值与不同浓度前列腺特异性抗原检测的关系图，可以看出，随着浓度的增大，溶液的吸收值越大，表明根据生成的二价铁离子-菲嗪络合物的吸收强度变化，可以测定前列腺特异性抗原的浓度，采用分光光度计可以检测到0.005 ng/mL 前列腺特异性抗原，表明该方法可以用于前列腺特异性抗原的比色分析检测，线性范围是0.005 ~ 0.5 ng/mL。

实施例3：选择性

步骤参照实施例2步骤，将前列腺特异性抗原换成待测试的物质，其他的步骤条件不改变，实验结果如图5。结果表明，只有前列腺特异性抗原能够产生较强的吸收值，导致溶液变为紫红色，其它物质没有引起溶液颜色变化，这些物质引起的紫外吸收值变化可以忽略不计，表明该方法对前列腺特异性抗原的检测具有较好的选择性。

本发明的机理探讨与分析：吡咯喹啉醌能够被三(2-羧乙基)膦还原，还原产物进而将无色的三价铁离子-菲嗪络合物还原为紫红色的二价铁离子-菲嗪络合物；而生成的吡咯喹啉醌又重新被三(2-羧乙基)膦还原，再次开始与三价铁离子-菲嗪络合物反应，多次循环后，将产生大量的二价铁离子-菲嗪络合物，从而形成紫红色溶液。基于这一原理，当样品中存在前列腺特异性抗原时，负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒将被磁珠捕获，负载的吡咯喹啉醌能够将无色的三价铁离子-菲嗪络合物还原，形成紫色的二价铁离子-菲嗪络合物。采用肉眼或者分光光度计即可监测这一变化过程。具体技术方案为：向链霉亲和素功能化的磁球中加入含生物素功能化的捕获抗体的磷酸缓冲溶液，反应30 ~ 60分钟，采用磁铁进行分离，用磷酸缓冲溶液洗涤，弃掉上层清液，下层沉淀分散于磷酸缓冲溶液；然后加入含抗原的磷酸缓冲溶液，混合震荡，孵育；磁力分离和洗涤，下层沉淀分散于磷酸缓冲溶液，再加入检测抗体功能化的负载吡咯喹啉醌的中孔二氧化硅纳米颗粒和牛血清白蛋白混合溶液，震荡反应；磁力分离和洗涤，下层沉淀分散于含三(2-羧乙基)膦和三价铁离子-菲嗪络合物的磷酸缓冲溶液，用肉眼观察溶液颜色变化或者用紫外可见分光光度计测定溶液在562 nm处的吸收值。

在详细说明本发明的实施方式之后，熟悉该项技术的人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围，且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。