本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种血管内皮生长因子检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：vegf是ferrara等(1989)从牛垂体滤泡细胞分离出的可特异性促进血管内皮细胞生长的蛋白质，其作为血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，在体内外均可特异性的促进血管内皮细胞的生长和诱导血管生成。vegf是一个分子量为45kd的高度糖基化的碱性蛋白，是一种有高度特异性的促进血管内皮细胞分裂，诱导血管新生的因子，它可以特异地作用于血管内皮细胞，促进血管生成，维持血管的正常状态和完整性，提高血管通透性。血管内皮细胞生长因子参与许多病理和生理的表达，在参与骨折愈合的表达全过程中起到重要因素，在糖尿病肾病的发病过程中会表达增强，另外在对白血病和严重肢体缺血的表达中可作为一种基因治疗的药物。研究发现，vegf在许多病理生理过程中都有表达，例如创伤修复中的血管内皮细胞和巨噬细胞、糖尿病视网膜病变细胞、心脑血管病和肝脏疾病等，并以自分泌、旁分泌和胞内分泌的方式特异地作用于血管内皮细胞膜上的vegf受体从而引发细胞内信号转导而实现的。在众多血管生成因子当中，vegf是公认的主要的诱导血管生成的物质，它能强烈地促进血管内皮有丝分裂和新生血管形成。因此目前在诊断疾病时通过对vegf的检测作为一种良好的诊断手段。现有vegf诊断试剂盒使用的多为上一代检测技术，信号放大基数不够，而vegf在人血清中的含量很少，正常人血清中含量为10-80pg/ml，即使是肿瘤中期病人，血清中vegf含量也只有400-1000pg/ml。现有的试剂盒灵敏度不高，在实际应用中一旦检测到vegf的含量，基本上标示该例病人为肿瘤晚期患者，无法起到早期诊查的目的；而且在对样本检测时还存在漏检的情况，此外现有的vegf试剂稳定性较差。因此针对上述问题有必要开发一种血管内皮生长因子的检测试剂盒。技术实现要素：本发明的第一个目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种血管内皮生长因子的检测试剂盒，该试剂盒检测结果准确、稳定性好、灵敏度高、线性范围宽。为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：一种血管内皮生长因子检测试剂盒，所述检测试剂盒包括包被有vegf抗体的磁性微球混悬液、vegf参考品、vegf质控品、vegf标记物、浓缩洗涤液和发光底物液；其中所述vegf标记物通过吖啶酯修饰物对改造的vegf抗体进行标记。作为一种改进的技术方案，所述吖啶酯修饰物为吖啶酯dems-nhs,所述改造的vegf抗体是指将vegf抗体与双功能螯合剂反应制备而成。作为一种改进的技术方案，所述包被vegf抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:50-1:100的比例配制；所述vegf标记物的浓度按照其与标记物稀释液1:500-1:10000的比例稀释；所述vegf参考品和所述vegf质控品均由vegf标准品与参考品稀释液配制而成，所述vegf参考品的浓度范围为0-2500pg/ml；所述vegf质控品的浓度为125pg/ml、1000pg/ml。作为一种进一步优选的技术方案，所述包被vegf抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:50的比例配制，所述vegf标记物的浓度按照其与标记物稀释液1:2000的比例稀释。作为一种优选的技术方案，所述参考品稀释液为ph7.5的hepes缓冲液，且每1l缓冲液中还含有18-22g酪蛋白钠盐、14-15gsds、3.8-4gdtt和0.3-0.5ml的pc300。所述浓缩洗涤液按照每1lph7.5的tris-hcl缓冲液中含有7-10gnacl、0.3-0.6ml吐温-80和6-8mlproclin-300进行配制。作为一种优选的技术方案，所述发光底物液包括发光底物液a和发光底物液b,所述发光底物液a的ph为2.5-2.6，所述发光底物液a的成分为双氧水和硝酸；所述发光底物液b的ph为12.3-12.7，所述发光底物液b的成分为氢氧化钾和tritonx-100。本发明的第二个目的在于：提供一种血管内皮生长因子的检测试剂盒的制备方法。为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：一种血管内皮生长因子的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)制备vegf磁性微球混悬液取磁珠母液，加入磁珠包被缓冲液i混匀，吸取液体后再加入磁珠包被缓冲液i混匀，加入vegf抗体混匀后再加入磁珠包被缓冲液ii，混匀经过一段时间的反应，反应结束后吸取液体，再加入磁珠包被缓冲液iii混匀，反应结束后吸取液体，再加入磁珠保存液混匀，再加入磁珠包被缓冲液iv，混匀后得到vegf磁性微球混悬液；(2)制备vegf参考品及质控品用参考品稀释液将vegf标准品按一定的比例稀释成系列参考品，其参考品浓度范围为0pg/ml-2000pg/ml；按照上述操作制备浓度为125pg/ml、1000pg/ml的质控品，分装、冻干；(3)vegf标记物的制备①溶液配制用0.1m，ph7.5的n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙磺酸溶液作为缓冲体系，配制浓度为1mg/mlvegf抗体工作液；②蛋白交联反应取2ml，1mg/mlvegf抗体工作液，加入300μl，体积浓度为25％戊二醛，经过反应得到蛋白复合物vegf-ga,再将该蛋白复合物置于hbs缓冲液中透析8h，备用；③吖啶酯标记取0.1mg/ml的吖啶酯dmae-nhs溶液，按照体积比1:1的比例加入1mg/ml透析后的vegf-ga溶液，搅拌混匀经过反应得到的vegf-ga-dmae反应标记物经过透析，备用；④vegf-ga-dmae标记物配置将透析后的vegf-ga-dmae反应标记物与标记物稀释液按照体积比1：1000-5000的比例进行配置；(4)配制浓缩洗涤液按照每1l、0.1mhepes缓冲体系中含有7-10gnacl、0.5-2gkcl、0.3-0.6mltritonx-100、6-8mlproclin-300和0.5-1gnan3进行配置；(5)配制发光底物液a和发光底物液b发光底物液a：取10-20l纯水，再加入200-278.4mlhno3，100-132.8mlh2o2，纯水定容至30-40l，调ph到2.55±0.5；发光底物液b：取10-20l纯水，再加入300-400gkoh和600-800mltritonx-100，纯水定容至30-40l，调ph到12.50±0.2；(6)将上述步骤(1)-(5)制备的磁性微球混悬液、vegf标记物、参考品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液a和发光底物液b分别进行分装。作为一种改进的技术方案，所述磁微粒为粒径1-3μm，且表面包裹有羧基或磺酰基活性基团的磁性微球，vegf磁性微球混悬液制备时按照按照每50mg磁性微球的用量对1.0-2.5mg的vegf抗体进行包被。作为一种优选的技术方案，所述步骤(3)中标记物稀释液为ph7.5的pbs缓冲液，且每1lpbs缓冲液中还含有5-6g氯化钙、0.02-0.04％v/v的proclin-300和0.3～1.0％v/v的aes。本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：vegf抗体原料主要为体外cho细胞表达的重组抗体fab片段，分子力量约50kd，抗体片段上羧基较少，难以与带有nhs修饰基团的吖啶酯进行交联，标记效率极低。本发明通过对vegf抗体片段进行处理，使vegf抗体片段的氨基变为羧基，以增加抗体表面的羧基反应位点，从而提升与吖啶酯修饰物的结合率，大大提高了试剂盒的灵敏度。本发明的试剂盒产品中的各组分配方是通过多次实验得出的配方组分，上述各组分配合保证了本发明试剂盒产品的稳定性和准确性，使得本发明试剂盒在0-2500pg/ml之间成良好的线性关系，灵敏度可达到1pg/ml，大大提高了检测效率，降低了漏检率。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1一种血管内皮生长因子检测试剂盒，包括包被有vegf抗体的磁性微球混悬液、vegf参考品、vegf质控品、vegf标记物、浓缩洗涤液和发光底物液；其中所述vegf标记物通过吖啶酯修饰物对改造的vegf抗体进行标记。其中吖啶酯修饰物为吖啶酯dems-nhs,改造的vegf抗体是指将vegf抗体与双功能螯合剂反应制备而成。其中包被vegf抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:50的比例配制；其中所述vegf标记物的浓度按照其与标记物稀释液1:2000的比例稀释；其中vegf参考品和所述vegf质控品均由vegf标准品与参考品稀释液配制而成，所述vegf参考品的浓度范围为0-2500pg/ml；其中vegf质控品的浓度为125pg/ml、1000pg/ml。其中参考品稀释液为ph7.5的hepes缓冲液，且每1l缓冲液中还含有18-22g酪蛋白钠盐、14-15gsds、3.8-4gdtt和0.3-0.5ml的pc300。其中浓缩洗涤液按照每1lph7.5的tris-hcl缓冲液中含有7-10gnacl、0.3-0.6ml吐温-80和6-8mlproclin-300进行配制。其中发光底物液包括发光底物液a和发光底物液b,所述发光底物液a的ph为2.5，所述发光底物液a的成分为双氧水和硝酸；其中发光底物液b的ph为12.5，所述发光底物液b的成分为氢氧化钾和tritonx-100。其制备方法，包括以下步骤：(1)制备vegf磁性微球混悬液取m270羧基磁珠母液，加入磁珠包被缓冲液i，混匀，吸取液体后再加入磁珠包被缓冲液i(包括0.97gtris、6.59gtris-hci、9.00gnacl，用ddh2o定容至1l，并用1mnaoh/1mhci调制ph7.0±0.1)混匀，再加入vegf抗体，混匀后再加入磁珠包被缓冲液ii(包括9.54g硼砂、6.18g硼酸，由ddh2o定容至1l，并用1mnaoh/1mhci调制ph9.5±0.1)，混匀经过16-20h的反应，反应结束后吸取液体，再加入磁珠包被缓冲液iii(bs3(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)thermofisher1mg和tris缓冲液配置100μl)混匀，经过3h的反应后吸取液体，再加入磁珠保存液(包括tris0.97g、tris-hci6.59g、nacl9.00g，ddh2o定容至1l，1mnaoh/1mhci调制ph7.4±0.1)混匀，再加入磁珠包被缓冲液iv(包括14.5gna2hpo4.12h20、1.48gnah2po4.2h20、0.50gpc300、5.00gbsa、0.50g吐温-20，用ddh2o定容至1l，用1mnaoh/1mhci调制ph9.5±0.1)，混匀后得到vegf磁性微球混悬液；(2)制备vegf参考品及质控品用参考品稀释液将vegf标准品按一定的比例稀释成系列参考品，其参考品浓度范围为0pg/ml-2500pg/ml(参考品的浓度范围分别为0pg/ml、50pg/ml、200pg/ml、500pg/ml、1200pg/ml和2500pg/ml)；按照上述操作制备浓度为125pg/ml、1000pg/ml的质控品，分装、冻干；(3)vegf标记物的制备①溶液配制用0.1m，ph7.5的n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙磺酸溶液作为缓冲体系，配制浓度为1mg/mlvegf抗体工作液；②蛋白交联反应取2ml，1mg/mlvegf抗体工作液，加入300μl，体积浓度为25％的戊二醛，经过反应得到蛋白复合物vegf-ga,再将该蛋白复合物置于hbs缓冲液中透析8h，备用；③吖啶酯标记取0.1mg/ml的吖啶酯dmae-nhs溶液，按照体积比1:1的比例加入1mg/ml透析后的vegf-ga溶液，搅拌混匀经过反应得到的vegf-ga-dmae反应标记物经过透析，备用；④vegf-ga-dmae标记物配置将透析后的vegf-ga-dmae反应标记物与标记物稀释液按照体积比1：1000-5000的比例进行配置；(4)配制浓缩洗涤液按照每1l、0.1mhepes缓冲体系中含有7-10gnacl、0.5-2gkcl、0.3-0.6mltritonx-100、6-8mlproclin-300和0.5-1gnan3进行配置；(5)配制发光底物液a和发光底物液b发光底物液a：取10-20l纯水，再加入200-278.4mlhno3，100-132.8mlh2o2，纯水定容至30-40l，调ph到2.55±0.5；发光底物液b：取10-20l纯水，再加入300-400gkoh和600-800mltritonx-100，纯水定容至30-40l，调ph到12.50±0.2；(6)将上述步骤(1)-(5)制备的磁性微球混悬液、vegf标记物、参考品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液a和发光底物液b分别进行分装。其中，vegf磁性微球混悬液制备时按照按照每50mg磁性微球的用量对2mg的vegf抗体进行包被，抗体的浓度为40ug/mg。其中，步骤(3)中标记物稀释液为ph7.5的pbs缓冲液，且每1lpbs缓冲液中还含有5-6g氯化钙、0.02-0.04％v/v的proclin-300和0.3～1.0％v/v的aes。实施例2一种血管内皮生长因子检测试剂盒，包括包被有vegf抗体的磁性微球混悬液、vegf参考品、vegf质控品、vegf标记物、浓缩洗涤液和发光底物液；其中所述vegf标记物通过吖啶酯修饰物对改造的vegf抗体进行标记。其中吖啶酯修饰物为吖啶酯dems-nhs,改造的vegf抗体是指将vegf抗体与双功能螯合剂反应制备而成。其中包被vegf抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:80的比例配制；其中所述vegf标记物的浓度按照其与标记物稀释液1:1000的比例稀释；其中vegf参考品和所述vegf质控品均由vegf标准品与参考品稀释液配制而成，所述vegf参考品的浓度范围为0-2500pg/ml(参考品的浓度分别为0pg/ml、50pg/ml、200pg/ml、500pg/ml、1200pg/ml和2500pg/ml)；其中vegf质控品的浓度为125pg/ml、1000pg/ml。其中参考品稀释液为ph7.5的hepes缓冲液，且每1l缓冲液中还含有18-22g酪蛋白钠盐、14-15gsds、3.8-4gdtt和0.3-0.5ml的pc300。其中浓缩洗涤液按照每1lph7.5的tris-hcl缓冲液中含有7-10gnacl、0.3-0.6ml吐温-80和6-8mlproclin-300进行配制。其中发光底物液包括发光底物液a和发光底物液b,所述发光底物液a的ph为2.5，所述发光底物液a的成分为双氧水和硝酸；其中发光底物液b的ph为12.3，所述发光底物液b的成分为氢氧化钾和tritonx-100。其制备方法，包括以下步骤：(1)制备vegf磁性微球混悬液取m270羧基磁珠母液，加入磁珠包被缓冲液i，混匀，吸取液体后再加入磁珠包被缓冲液i(包括0.97gtris、6.59gtris-hci、9.00gnacl，用ddh2o定容至1l，并用1mnaoh/1mhci调制ph7.0±0.1)混匀，再加入vegf抗体，混匀后再加入磁珠包被缓冲液ii(包括9.54g硼砂、6.18g硼酸，由ddh2o定容至1l，并用1mnaoh/1mhci调制ph9.5±0.1)，混匀经过16-20h的反应，反应结束后吸取液体，再加入磁珠包被缓冲液iii(bs3(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)thermofisher1mg和tris缓冲液配置100μl)混匀，经过3h的反应后吸取液体，再加入磁珠保存液(包括tris0.97g、tris-hci6.59g、nacl9.00g，ddh2o定容至1l，1mnaoh/1mhci调制ph7.4±0.1)混匀，再加入磁珠包被缓冲液iv(包括14.5gna2hpo4.12h20、1.48gnah2po4.2h20、0.50gpc300、5.00gbsa、0.50g吐温-20，用ddh2o定容至1l，用1mnaoh/1mhci调制ph9.5±0.1)，混匀后得到vegf磁性微球混悬液；(2)制备vegf参考品及质控品用参考品稀释液将vegf标准品按一定的比例稀释成系列参考品，其参考品浓度范围为0pg/ml-2500pg/ml(参考品的具体浓度分别为0pg/ml、50pg/ml、200pg/ml、500pg/ml、1200pg/ml和2500pg/ml)；按照上述操作制备浓度为125pg/ml、1000pg/ml的质控品，分装、冻干；(3)vegf标记物的制备①溶液配制用0.1m，ph7.5的n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙磺酸溶液作为缓冲体系，配制浓度为1mg/mlvegf抗体工作液；②蛋白交联反应取2ml，1mg/mlvegf抗体工作液，加入300μl，体积浓度为25％的戊二醛，经过反应得到蛋白复合物vegf-ga,再将该蛋白复合物置于hbs缓冲液中透析8h，备用；③吖啶酯标记取0.1mg/ml的吖啶酯dmae-nhs溶液，按照体积比1:1的比例加入1mg/ml透析后的vegf-ga溶液，搅拌混匀经过反应得到的vegf-ga-dmae反应标记物经过透析，备用；④vegf-ga-dmae标记物配置将透析后的vegf-ga-dmae反应标记物与标记物稀释液按照体积比1：1000-5000的比例进行配置；(4)配制浓缩洗涤液按照每1l、0.1mhepes缓冲体系中含有7-10gnacl、0.5-2gkcl、0.3-0.6mltritonx-100、6-8mlproclin-300和0.5-1gnan3进行配置；(5)配制发光底物液a和发光底物液b发光底物液a：取10-20l纯水，再加入200-278.4mlhno3，100-132.8mlh2o2，纯水定容至30-40l，调ph到2.55±0.5；发光底物液b：取10-20l纯水，再加入300-400gkoh和600-800mltritonx-100，纯水定容至30-40l，调ph到12.50±0.2；(6)将上述步骤(1)-(5)制备的磁性微球混悬液、vegf标记物、参考品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液a和发光底物液b分别进行分装。其中，vegf磁性微球混悬液制备时按照按照每50mg磁性微球的用量对1.0mg的vegf抗体进行包被，抗体的浓度为20ug/mg。其中，步骤(3)中标记物稀释液为ph7.5的pbs缓冲液，且每1lpbs缓冲液中还含有5-6g氯化钙、0.02-0.04％v/v的proclin-300和0.3～1.0％v/v的aes。实施例3一种血管内皮生长因子检测试剂盒，包括包被有vegf抗体的磁性微球混悬液、vegf参考品、vegf质控品、vegf标记物、浓缩洗涤液和发光底物液；其中所述vegf标记物通过吖啶酯修饰物对改造的vegf抗体进行标记。其中吖啶酯修饰物为吖啶酯dems-nhs,改造的vegf抗体是指将vegf抗体与双功能螯合剂反应制备而成。其中包被vegf抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:100的比例配制；其中所述vegf标记物的浓度按照其与标记物稀释液1:5000的比例稀释；其中vegf参考品和所述vegf质控品均由vegf标准品与参考品稀释液配制而成，所述vegf参考品的浓度范围为0-2500pg/ml(参考品的浓度范围分别为0pg/ml、50pg/ml、200pg/ml、500pg/ml、1200pg/ml和2500pg/ml)；其中vegf质控品的浓度为125pg/ml、1000pg/ml。其中参考品稀释液为ph7.5的hepes缓冲液，且每1l缓冲液中还含有18-22g酪蛋白钠盐、14-15gsds、3.8-4gdtt和0.3-0.5ml的pc300。其中浓缩洗涤液按照每1lph7.5的tris-hcl缓冲液中含有7-10gnacl、0.3-0.6ml吐温-80和6-8mlproclin-300进行配制。其中发光底物液包括发光底物液a和发光底物液b,所述发光底物液a的ph为2.6，所述发光底物液a的成分为双氧水和硝酸；其中发光底物液b的ph为12.7，所述发光底物液b的成分为氢氧化钾和tritonx-100。其制备方法，包括以下步骤：(1)制备vegf磁性微球混悬液取m270羧基磁珠母液，加入磁珠包被缓冲液i，混匀，吸取液体后再加入磁珠包被缓冲液i(包括0.97gtris、6.59gtris-hci、9.00gnacl，用ddh2o定容至1l，并用1mnaoh/1mhci调制ph7.0±0.1)混匀，再加入vegf抗体，混匀后再加入磁珠包被缓冲液ii(包括9.54g硼砂、6.18g硼酸，由ddh2o定容至1l，并用1mnaoh/1mhci调制ph9.5±0.1)，混匀经过16-20h的反应，反应结束后吸取液体，再加入磁珠包被缓冲液iii(bs3(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)thermofisher1mg和tris缓冲液配置100μl)混匀，经过3h的反应后吸取液体，再加入磁珠保存液(包括tris0.97g、tris-hci6.59g、nacl9.00g，ddh2o定容至1l，1mnaoh/1mhci调制ph7.4±0.1)混匀，再加入磁珠包被缓冲液iv(包括14.5gna2hpo4.12h20、1.48gnah2po4.2h20、0.50gpc300、5.00gbsa、0.50g吐温-20，用ddh2o定容至1l，用1mnaoh/1mhci调制ph9.5±0.1)，混匀后得到vegf磁性微球混悬液；(2)制备vegf参考品及质控品用参考品稀释液将vegf标准品按一定的比例稀释成系列参考品，其参考品浓度范围为0pg/ml-2500pg/ml(参考品的浓度范围分别为0pg/ml、50pg/ml、200pg/ml、500pg/ml、1200pg/ml和2500pg/ml)；按照上述操作制备浓度为125pg/ml、1000pg/ml的质控品，分装、冻干；(3)vegf标记物的制备①溶液配制用0.1m，ph7.5的n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙磺酸溶液作为缓冲体系，配制浓度为1mg/mlvegf抗体工作液；②蛋白交联反应取2ml，1mg/mlvegf抗体工作液，加入300μl，体积浓度为25％的戊二醛，经过反应得到蛋白复合物vegf-ga,再将该蛋白复合物置于hbs缓冲液中透析8h，备用；③吖啶酯标记取0.1mg/ml的吖啶酯dmae-nhs溶液，按照体积比1:1的比例加入1mg/ml透析后的vegf-ga溶液，搅拌混匀经过反应得到的vegf-ga-dmae反应标记物经过透析，备用；④vegf-ga-dmae标记物配置将透析后的vegf-ga-dmae反应标记物与标记物稀释液按照体积比1：1000-5000的比例进行配置；(4)配制浓缩洗涤液按照每1l、0.1mhepes缓冲体系中含有7-10gnacl、0.5-2gkcl、0.3-0.6mltritonx-100、6-8mlproclin-300和0.5-1gnan3进行配置；(5)配制发光底物液a和发光底物液b发光底物液a：取10-20l纯水，再加入200-278.4mlhno3，100-132.8mlh2o2，纯水定容至30-40l，调ph到2.55±0.5；发光底物液b：取10-20l纯水，再加入300-400gkoh和600-800mltritonx-100，纯水定容至30-40l，调ph到12.50±0.2；(6)将上述步骤(1)-(5)制备的磁性微球混悬液、vegf标记物、参考品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液a和发光底物液b分别进行分装。其中磁珠为m270羧基磁珠，vegf磁性微球混悬液制备时按照按照每50mg磁性微球的用量对2.5mg的vegf抗体进行包被，抗体的浓度为50ug/mg。其中，步骤(3)中标记物稀释液为ph7.5的pbs缓冲液，且每1lpbs缓冲液中还含有5-6g氯化钙、0.02-0.04％v/v的proclin-300和0.3～1.0％v/v的aes。实施例4一种血管内皮生长因子检测试剂盒的主要产品性能指标为：(1)试剂盒的最低检测限(灵敏度)10孔平行测定样本稀释液，计算测定结果的平均数(m)与标准差(sd)，得出m+2sd对应的发光值，代入剂量-反应曲线，计算出相应的浓度值，该浓度值即为本试剂盒的最低检测限。经验证，本试剂盒的最低检测限指标检测结果见表1。表1试剂盒最低检测限的测定结论：测定的vegf样本稀释液的平均发光值m＝3025.1，sd＝238.6，将(m+2sd)的值带入此次反应曲线，得其灵敏度为：1pg/ml(<5pg/ml)，符合要求。(2)试剂盒的剂量-反应曲线的线性复孔测定试剂盒的参考品(浓度依次为0pg/ml、50pg/ml、200pg/ml、500pg/ml、1200pg/ml和2500pg/ml的参考品进行两孔测定)，用四参数进行拟合，本试剂盒的剂量-反应曲线的线性检测结果见表2。表2试剂盒剂量-反应曲线的线性结论：测定的vegf剂量-反应曲线线性相关系数(r)为：0.997(>0.9900)，符合要求。(3)试剂盒的准确度检测浓度为125pg/ml和1000pg/ml的参考品，每个浓度参考品检测3次，计算测定结果的均值m，本试剂盒的准确度检测结果见表3。表3试剂盒的准确度编号125pg/ml1000pg/ml1126.52962.252126.28998.123127.031008.89平均值126.61989.75bias％1.28％1.02％结论：测定的125pg/ml和1000pg/ml准确度参考品的相对偏差(bias％)分别为：1.29％和1.02％，测定值与靶值的相对偏差(bias％)均<15.0％，符合要求。(4)试剂盒的稳定性将试剂盒放于37℃恒温箱中进行加速破坏性实验，分别加速1天，3天，5天，7天，观察试剂盒的信号值的下降程度。根据阿累尼乌斯反应方程，37℃加速7天相当于4℃保存一年，信号值降幅小于20％，认为试剂稳定性极其优秀，信号值下降低于50％认为试剂稳定性合格，具体结果见表4和表5。表4加速稳定性试验表5加速稳定性试验通过表4和表5中数据可以发现，信号值降幅小于20％，本发明试剂盒稳定性较好。从上述测定的数据可以看出，本发明设计的一种血管内皮生长因子检测试剂盒在灵敏度、准确度、稳定性等各项质量参数均处于领先地位。实施例5一种血管内皮生长因子检测试剂盒的临床检测实例如下：采用本发明实施例2中的试剂盒对50例初期肿瘤患者进行vegf检测，对照试剂为市场是现有的vegf检测试剂，数据如下表所示；通过上数据表可以得出，利用本发明试剂盒可以检测出样本编号13、17、19、20、23、32、33的vegf异常，而对照试剂未检测到，因此本发明试剂盒的灵敏度以及准确度更好。剔除本发明由于灵敏度提升而特别检出的肿瘤样本外，本发明的试剂盒与市场上现有产品具有良好的测值一致性，y＝0.9767x+0.518(r2＝0.9869)，其相关系数r大于0.95。专利不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本专利的保护范围之内。当前第1页12