透明质酸化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明属于体外检测
技术领域：
，具体涉及一种透明质酸化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：透明质酸(ha)又称玻璃酸、玻尿酸，是目前所知唯一不含硫的黏多糖，ha由间质细胞合成、分泌，其代谢大部分由肝脏内皮细胞完成，慢性肝炎时由于肝脏代谢能力下降，肝窦内皮细胞清除减少，ha释放入血。肝硬化时因内皮细胞摄入和分解ha的能力下降，使血清ha水平增高。因此血清ha水平是衡量肝纤维化活动程度的参考指标。目前测定透明质酸的方法主要有酶联免疫法和板式化学发光法，这两种方法检测原理基本相同，都是将抗体包被在特定的包被板上，通过另一株标记的抗体与被检测物形成双抗体夹心结构，通过od值计算相对浓度。这两种检测方法主要技术原理都是双抗体夹心法，灵敏度及线性范围等性能较低。透明质酸化学发光免疫测试试剂盒相比传统的检测方法，技术原理是竞争法。抗原、抗体及结合蛋白的结合是在相似的液体条件下进行，反应更加迅速灵敏；另一方面，透明质酸化学发光免疫测试试剂盒与化学发光免疫检测仪器组成封闭系统，试剂、样本的添加及检测任务均由仪器自动完成，降低了人为操作的误差，提高了整个系统的灵敏度与准确度；试剂所需原料相对较少，节约成本。技术实现要素：本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种准确度高、线性范围宽、抗干扰能力强的透明质酸化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：本发明提供一种透明质酸化学发光免疫检测试剂盒，包括：r1试剂、r2试剂、和r3试剂；所述r1试剂为磁颗粒包被的透明质酸抗原的缓冲液；所述r2试剂为化学发光标记物标记的透明质酸结合蛋白单克隆抗体的缓冲液；所述r3试剂为透明质酸结合蛋白的缓冲液。在上述技术方案中，优选的是：所述r1试剂中磁颗粒包被的透明质酸抗原中磁颗粒的质量比是0.01％～1％。在上述技术方案中，优选的是：所述r1试剂中磁颗粒包被的透明质酸抗原中磁颗粒的包被比例为1％～3％。在上述技术方案中，优选的是：所述r1试剂中磁颗粒包被的透明质酸抗原中磁颗粒的官能团为羧基、氨基、甲苯黄酰基(tosyl)、或者环氧乙烷。在上述技术方案中，优选的是：所述r2试剂中化学发光标记物标记的透明质酸结合蛋白单克隆抗体中透明质酸结合蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:3～10。在上述技术方案中，优选的是：所述r2试剂中化学发光标记物标记的透明质酸结合蛋白单克隆抗体中化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或者三联吡啶钌。在上述技术方案中，进一步优选的是：所述吖啶酯的结构式如下：在上述技术方案中，优选的是：所述r1试剂的缓冲液为100～500mmbistris、0.05％～0.1％吐温-20、及0.05％～0.1％proclin300，ph6.0～8.0，磁颗粒浓度为质量比是0.01％～1％；所述r2试剂的缓冲液为100～500mmbistris、0.05％～0.1％pc300及0.05％～0.1％吐温-20，ph6.0～8.0，抗体终浓度为0.5～2μg/ml；所述r3试剂的缓冲液为100～500mmbistris、0.05％～0.1％pc300及0.05％～0.1％吐温-20，ph6.0～8.0，透明质酸结合蛋白终浓度终浓度为2～3μg/ml。本发明提供一种透明质酸化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：步骤1、r1试剂的制备：透明质酸抗原经过置换后，将磁颗粒与透明质酸抗原一起混悬过夜，加入封闭剂后集磁取上清，得到1％～3％包被的透明质酸抗原的磁颗粒；接着在100～500mmbistris、0.05％～0.1％吐温-20、0.05％～0.1％proclin300，ph6.0～8.0的缓冲液中配成磁颗粒浓度为质量比是0.01％～1％的r1试剂；步骤2、r2试剂的制备：将透明质酸结合蛋白单克隆抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入化学发光标记物的dmf溶液，经过封闭、纯化步骤后得到化学发光标记物标记的透明质酸结合蛋白单克隆抗体；将化学发光标记物标记的透明质酸结合蛋白单克隆抗体浓溶液用100～500mmbistris、0.05％～0.1％pc300及0.05％～0.1％吐温-20，ph6.0～8.0的缓冲液配制成抗体终浓度为0.5-2μg/ml的r2试剂；步骤3、r3试剂的制备：透明质酸结合蛋白使用bca方法测得原料的浓度后，将透明质酸结合蛋白用100～500mmbistris、0.05％～0.1％pc300及0.05％～0.1％吐温-20，ph6.0～8.0的缓冲液配制成透明质酸结合蛋白终浓度为2-3μg/ml的r3试剂。将r1、r2和r3试剂组装成成品试剂即透明质酸化学发光免疫检测试剂盒，这种化学发光免疫分析试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，使用竞争法完成对透明质酸的检测。这种化学发光免疫分析试剂盒与仪器配套，缩短了临床检测所需的时间，提高检测的灵敏度。本发明的有益效果是：1、选择吖啶酯为化学发光免疫分析系统的标记材料，该材料有激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光，不需要酶的参与，节约时间及成本。2、采用磁颗粒包被的透明质酸抗原，磁颗粒作为固相载体，比表面积大，可以进一步提高灵敏度。3、透明质酸化学发光免疫检测试剂盒为全自动的测量样本，并直接给出数值，减少人为操作误差，并且实现无人值守。4、吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽。5、试剂与仪器组成封闭系统，系统误差小。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。图1为本发明的透明质酸化学发光免疫检测试剂盒的制备流程设计图；图2为实施例1得到的ha标准曲线图。具体实施方式为了使本发明的优点、目的和方法更加详实易懂，下面结合附图和具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了诸多细节以便于理解，但本发明可以以不同于描述的其他方式来实施。本发明提供一种透明质酸化学发光免疫检测试剂盒，包括：r1试剂、r2试剂、和r3试剂；所述r1试剂为将磁颗粒包被的透明质酸抗原在缓冲液中配制成所需浓度得到的磁颗粒包被的透明质酸抗原的缓冲液；所述r2试剂为将化学发光标记物标记的透明质酸结合蛋白单克隆抗体在缓冲液中配制成所需浓度得到的化学发光标记物标记的透明质酸结合蛋白单克隆抗体的缓冲液；所述r3试剂为将透明质酸结合蛋白在缓冲液中配制成所需浓度得到的透明质酸结合蛋白的缓冲液。优选的是：所述r1试剂中磁颗粒包被的透明质酸抗原中磁颗粒的质量比是0.01％～1％，进一步优选质量比是0.072％。优选的是：所述r1试剂中磁颗粒包被的透明质酸抗原中磁颗粒的包被比例为1％～3％，进一步优选包被比例为2％。优选的是：所述r1试剂中磁颗粒包被的透明质酸抗原中磁颗粒的官能团为羧基、氨基、tosyl、或者环氧乙烷；进一步优选为tosyl。优选的是：所述r1试剂的缓冲液为100～500mmbistris、0.05％～0.1％吐温-20、及0.05％～0.1％proclin300，ph6.0～8.0，磁颗粒浓度为质量比是0.01％～1％；优选的是：所述r2试剂中化学发光标记物标记的透明质酸结合蛋白单克隆抗体中透明质酸结合蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:3～10，缓冲液为100～500mmbistris、0.05％～0.1％pc300及0.05％～0.1％吐温-20，抗体终浓度为0.5～2μg/ml；进一步优选缓冲液为100mmbistris，0.05％pc300及0.05％吐温-20，抗体终浓度为0.5～2μg/ml。其中所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或者三联吡啶钌；化学发光标记物优选为吖啶酯，吖啶酯结构如式1：优选的是：所述r3试剂中透明质酸结合蛋白为游离状态，无需标记及处理，缓冲液为100～500mmbistris、0.05％～0.1％pc300及0.05％～0.1％吐温-20，透明质酸结合蛋白终浓度为2～3μg/ml；进一步优选缓冲液为100mmbistris，0.05％pc300及0.05％吐温-20，透明质酸结合蛋白终浓度为2～3μg/ml。本发明的检测试剂盒还包括化学发光底物液，包括a液和b液。进一步还包括透明质酸校准品，所述透明质酸校准品的浓度分别为0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的透明质酸蛋白溶液。这种透明质酸化学发光免疫检测试剂盒用于检测透明质酸时，利用全自动化学发光免疫分析仪(cm180)对透明质酸校准品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件；然后根据需求测试临床样本，根据样本的光量子数计算透明质酸的浓度。使用化学发光免疫检测试剂盒检测透明质酸具有如下优点：1、选择吖啶酯为化学发光免疫分析系统的标记材料，该材料有激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光，不需要酶的参与，节约时间及成本。2、采用磁颗粒包被的透明质酸抗原，磁颗粒作为固相载体，比表面积大，可以进一步提高灵敏度。3、透明质酸化学发光免疫检测试剂盒为全自动的测量样本，并直接给出数值，减少人为操作误差，并且实现无人值守。4、吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽。5、试剂与仪器组成封闭系统，系统误差小。图1为本发明的透明质酸化学发光免疫检测试剂盒的制备流程设计图，包括：抗体原料筛选：化学发光物标记及试剂缓冲液的配制；磁颗粒与抗原包被，固相试剂配制；抗原原料筛选，校准品配制，最后组装试剂及配套校准品。本发明提供的透明质酸化学发光免疫检测试剂盒的制备方法具体包括以下步骤：步骤1、r1试剂的制备：透明质酸抗原经过置换后，将磁颗粒与透明质酸抗原一起混悬过夜，加入封闭剂后集磁取上清，得到1％～3％包被的透明质酸抗原的磁颗粒；接着在100～500mmbistris、0.05％～0.1％吐温-20、0.05％～0.1％proclin300，ph6.0～8.0的缓冲液中配成磁颗粒浓度为质量比是0.01％～1％的r1试剂；步骤2、r2试剂的制备：将透明质酸结合蛋白单克隆抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入化学发光标记物的dmf溶液，经过封闭、纯化步骤后得到化学发光标记物标记的透明质酸结合蛋白单克隆抗体；将化学发光标记物标记的透明质酸结合蛋白单克隆抗体浓溶液用100～500mmbistris、0.05％～0.1％pc300及0.05％～0.1％吐温-20，ph6.0～8.0的缓冲液配制成抗体终浓度为0.5-2μg/ml的r2试剂；步骤3、r3试剂的制备：透明质酸结合蛋白使用bca方法测得原料的浓度后，将透明质酸结合蛋白用100～500mmbistris、0.05％～0.1％pc300及0.05％～0.1％吐温-20，ph6.0～8.0的缓冲液配制成透明质酸结合蛋白终浓度为2-3μg/ml的r3试剂。以下实施例所用的吖啶酯的结构式如下：实施例1:透明质酸化学发光免疫检测试剂盒的制备：r1试剂的制备：透明质酸抗原经过置换后，将tosyl磁珠与透明质酸抗原一起混悬过夜，加入封闭剂后集磁取上清，得到2％包被的透明质酸抗原的tosyl磁颗粒。在100mmbistris、0.05％吐温-20、0.05％proclin300，ph6.0的缓冲液中配成磁珠浓度为0.072％的r1试剂。r2试剂的制备：将500μg透明质酸结合蛋白单克隆抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入吖啶酯的dmf溶液，按照透明质酸结合蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:10进行标记，经过封闭、纯化等步骤后得到透明质酸结合蛋白化学发光标记物抗体。将透明质酸化学发光标记物抗体浓溶液用100mmbistris、0.05％吐温、0.05％proclin300，ph6.0的缓冲液配制成抗体终浓度为0.5μg/ml的r2试剂。r3试剂的制备：透明质酸结合蛋白无需预处理，使用bca方法测得原料的浓度后，将透明质酸结合蛋白用100mmbistris、0.05％吐温、0.05％proclin300，ph6.0的缓冲液配制成透明质酸结合蛋白终浓度为2μg/ml的r3试剂。实施例2:透明质酸化学发光免疫检测试剂盒的制备：r1试剂的制备：透明质酸抗原经过置换后，将tosyl磁珠与透明质酸抗原一起混悬过夜，加入封闭剂后集磁取上清，得到3％包被的透明质酸抗原的tosyl磁颗粒。在500mmbistris、0.1％吐温-20、0.1％proclin300，ph6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.05％的r1试剂。r2试剂的制备：将500μg透明质酸结合蛋白单克隆抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入吖啶酯的dmf溶液，按照透明质酸结合蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:3进行标记，经过封闭、纯化等步骤后得到透明质酸结合蛋白化学发光标记物抗体。将透明质酸化学发光标记物抗体浓溶液用500mmbistris、0.1％吐温、0.1％proclin300，ph6.5的缓冲液配制成抗体终浓度为2μg/ml的r2试剂。r3试剂的制备：透明质酸结合蛋白无需预处理，使用bca方法测得原料的浓度后，将透明质酸结合蛋白用500mmbistris、0.1％吐温、0.1％proclin300，ph6.5的缓冲液配制成透明质酸结合蛋白终浓度为3μg/ml的r3试剂。实施例3:透明质酸化学发光免疫检测试剂盒的制备：r1试剂的制备：透明质酸抗原经过置换后，将tosyl磁珠与透明质酸抗原一起混悬过夜，加入封闭剂后集磁取上清，得到3％包被的透明质酸抗原的tosyl磁颗粒。在200mmbistris、0.08％吐温-20、0.08％proclin300，ph8.0的缓冲液中配成磁珠浓度为0.1％的r1试剂。r2试剂的制备：将500μg透明质酸结合蛋白单克隆抗体放入离心管中，保证抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入吖啶酯的dmf溶液，按照透明质酸结合蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:7进行标记，经过封闭、纯化等步骤后得到透明质酸结合蛋白化学发光标记物抗体。将透明质酸化学发光标记物抗体浓溶液用200mmbistris、0.08％吐温、0.08％proclin300，ph8.0的缓冲液配制成抗体终浓度为1μg/ml的r2试剂。r3试剂的制备：透明质酸结合蛋白无需预处理，使用bca方法测得原料的浓度后，将透明质酸结合蛋白用200mmbistris、0.08％吐温、0.08％proclin300，ph8.0的缓冲液配制成透明质酸结合蛋白终浓度为2.5μg/ml的r3试剂。实施例4：透明质酸化学发光免疫检测试剂盒性能评价根据实施例1进行线性的检测：将校准品浓度为其中所述透明质酸校准品的浓度分别为0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的透明质酸蛋白溶液作标准曲线(参见图2)，得到线性相关系数r＝0.9998。浓度光量子数0670044505846161004714332503367945002164281000125952根据实施例1进行灵敏度评价。分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定光量子数，取其平均值减两倍的标准差，带入0值校准品及相近校准品的标准曲线所得即为灵敏度；计算透明质酸化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为4.03ng/ml，检测范围为4.03-1000ng/ml。实施例5：透明质酸化学发光免疫检测试剂盒性能评价根据实施例2进行线性的检测：将校准品浓度为其中所述透明质酸校准品的浓度分别为0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的透明质酸蛋白溶液作标准曲线，得到线性相关系数r＝0.9998。浓度光量子数0688412505914121005000172503316475002157381000127397根据实施例2进行灵敏度评价。分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定光量子数，取其平均值减两倍的标准差，带入0值校准品及相近校准品的标准曲线所得即为灵敏度；计算透明质酸化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为4.07ng/ml，检测范围为4.07-1000ng/ml。实施例6：透明质酸化学发光免疫检测试剂盒性能评价根据实施例3进行线性的检测：将校准品浓度为其中所述透明质酸校准品的浓度分别为0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的透明质酸蛋白溶液作标准曲线，得到线性相关系数r＝0.9998。浓度光量子数0632863505321321004499522503067895001937151000111367根据实施例3进行灵敏度评价。分析灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定光量子数，取其平均值减两倍的标准差，带入0值校准品及相近校准品的标准曲线所得即为灵敏度；计算透明质酸化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度为3.71ng/ml，检测范围为3.71-1000ng/ml。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。当前第1页12