一种水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法与流程

本发明属于生物鉴定方法技术领域，尤其涉及一种水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法。

背景技术：

种子纯度是评价油菜种子质量以及质量分级的一项重要指标，目前，鉴定油菜种子纯度的方法主要有田间种植鉴定、籽粒及幼苗形态鉴定法、生化鉴定法、dna分子标记技术等方法。田间种植鉴定准确可靠，但检验周期长，一般需要一个生长季节；籽粒及幼苗形态鉴定法要求品种有比较特异的籽粒或农艺性状，并且要求检验人员要有丰富的经验，否则，鉴定的准确程度就会受到限制；dna分子标记技术对操作复杂，且成本较高，生化鉴定法主要是通过电泳把种子或植株中的蛋白质或者同工酶分离出来，染色后进行图谱差异分析，由于油菜中的蛋白质、同工酶具有丰富的多态性，检测结果比形态鉴定更加准确，操作简单，效率高，在油菜杂交种纯度鉴定中有非常广阔的应用，

研究表明，对不同农作物而言，往往适宜采用不同的种子蛋白电泳方法进行纯度鉴定，目前，已有酯酶同工酶、醇溶蛋白电泳技术应用于杂交油菜种子鉴定工作，但是尚未有成功利用水溶蛋白电泳技术鉴定杂交油菜种子纯度的报道。

技术实现要素：

本发明实施例提供一种水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法，旨在解决已有技术的不足，建立一种快速、准确的油菜种子纯度检测方法，为油菜制种提供技术保障。

本发明实施例是这样实现的，一种水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法，其步骤如下：

1)蛋白质提取：将用于鉴定的甘蓝型油菜杂交种种子及其母本种子压扁，每粒种子加纯水35μl～40μl，100℃水浴5分钟后，放置半小时，获得提取液用于上样；

2)凝胶制备：采用水平灌胶的方式组装玻璃板，分离胶灌至离后玻璃板顶部3～4cm处，轻轻加一层蒸馏水覆盖静置30min以上；浓缩胶灌胶至玻璃板顶端，插好点样梳，浓缩胶凝固后拔出点样梳；

3)点样：每粒种子取25μl提取液上样；

4)电泳：步骤3)上样完毕后，用电极缓冲液封样，然后将电泳槽注满电极缓冲液，滴加溴酚蓝作指示剂，4-15℃条件下，每电泳槽20-40ma稳流电泳；30min后，调电流至50-70ma继续稳流电泳，待指示剂至凝胶底部时结束电泳；

5)卸板、染色：电泳结束后，取出胶板，将分离胶转移至染色液中染色30-40min后，置于观片灯上读带；

6)纯度计算：对比甘蓝型油菜杂交种及其母本水溶蛋白谱带的差异，统计制种样中具有母本水溶蛋白电泳谱带类型的个体数量；根据纯度计算公式计算出甘蓝型油菜杂交种种子纯度，所述纯度计算公式为：

水溶蛋白鉴定种子纯度＝(1-母本带型数量/总检测种子数量)×100％。

步骤1)中所述用于鉴定的甘蓝型油菜杂交种种子及其母本种子的选取采取四分法取样，具体为，将用于鉴定的甘蓝型油菜杂交种种子晃动均匀，取出9-11g，放在纸上，剔除瘪粒及霉、烂种子，采用四分法取样。

步骤1)中所述用于鉴定的甘蓝型油菜杂交种种子优选为“沣油520”甘蓝型油菜杂交种种子。

步骤2)中所述分离胶为：300g丙烯酰胺，8g亚甲基双丙烯酰胺，ddh2o定容至1000ml，4℃保存。

步骤2)中所述浓缩胶为：100g丙烯酰胺，25g亚甲基双丙烯酰胺，ddh2o定容至1000ml,4℃保存。

步骤4)中所述电极缓冲液为：360gtris(三羟甲基氨基甲烷，下同)，480ml1mol/l的hcl，4.6mltemed(四甲基乙二胺，下同),用ddh2o定容至1000ml,4℃保存。

步骤5)中所述染色液为：12.5g三氯乙酸,30ml甲醇，27ml乙醇，10ml冰乙酸，0.015g考马斯亮蓝r-250，0.045g考马斯亮蓝g-250，ddh2o定容至100ml，避光保存。

步骤4)中所述溴酚蓝指示剂的用量优选为1滴0.2％溴酚蓝。

作为优选的实施方式，所述水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法，还包括纯度验证步骤，所述纯度验证具体步骤如下：

将用于鉴定的甘蓝型油菜杂交种种子的制种样同时进行种植鉴定和醇溶蛋白鉴定，其中种植鉴定利用盛花期育性表现调查纯度，纯度计算公式为：种植鉴定种子纯度＝(1-不育株数/总调查株数)×100％；醇溶蛋白鉴定利用杂交种与母本醇溶蛋白谱带的差异，纯度计算公式为：醇溶蛋白鉴定种子纯度＝(1-母本带型数量/总检测种子数量)×100％；分析三种方法的鉴定结果，验证该方法进行纯度鉴定的准确性。

本发明与现有技术相比，具有如下的有益效果：

本发明成功得到一种适合于甘蓝型油菜杂交种的水溶蛋白检测方法，并利用该方法鉴定甘蓝型油菜杂交种纯度，得到了一种快速鉴定甘蓝型油菜杂交种纯度的方法。本发明利用本方法、田间种植及醇溶蛋白3种不方法对同一批种子进行纯度鉴定，结果表明，3种方法鉴定的结果吻合，证明本发明的方法可在甘蓝型油菜杂交种的纯度鉴定中成功应用。该方法既可以克服油菜纯度鉴定中检验周期长等缺陷，又比醇溶蛋白样品迁移的速度快，鉴定效率高，而且提取液经济环保，提取效率高，谱带清晰，分辨高，为甘蓝型油菜杂交种种子纯度的严格把关奠定了基础。

附图说明

图1为实施例一中的沣油520水溶蛋白电泳图谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法，旨在解决已有技术的不足，建立一种快速、准确的油菜种子纯度检测方法，为油菜制种提供技术保障。

实施例一

本实施例以甘蓝型油菜杂交品种“沣油520”的陕西杂交制种基地生产的杂交种种子为材料。

本实施例中主要试剂配制：

(1)提取液：纯水。

(2)分离胶:300g丙烯酰胺，8g亚甲基双丙烯酰胺，ddh2o定容至1000ml,4℃保存。

(3)浓缩胶:100g丙烯酰胺，25g亚甲基双丙烯酰胺，ddh2o定容至1000ml,4℃保存。

(4)分离胶缓冲液:360gtris(三羟甲基氨基甲烷，下同)，480ml1mol/l的hcl，4.6mltemed(四甲基乙二胺，下同),用ddh2o定容至1000ml,4℃保存。

(5)浓缩胶缓冲液:59gtris，480ml1mol/l的hcl，4.6mltemed，ddh2o定容至1000ml,4℃保存。

(6)电极缓冲液:0.6gtris，2.9g甘氨酸，ddh2o定容至1l,4℃避光保存。

(7)40％的蔗糖:40g蔗糖，ddh2o定容至100ml,4℃保存。

(8)染色液:12.5g三氯乙酸,30ml甲醇，27ml乙醇，10ml冰乙酸，0.015g考马斯亮蓝r-250，0.045g考马斯亮蓝g-250，ddh2o定容至100ml，避光保存。

(9)脱色液:120ml乙醇，70ml冰乙酸，ddh2o定容至1l，常温下保存。

本实施例中提供了一种水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法，包括甘蓝型油菜种子水溶蛋白检测方法和鉴定甘蓝型油菜杂交种纯度两部分，其中：

1.一种甘蓝型油菜种子水溶蛋白检测方法，其步骤如下：

1)蛋白质提取：将用于鉴定的甘蓝型油菜杂交种种子晃动均匀，取出10g左右，放在纸上，剔除瘪粒及霉、烂种子，采用四分法取样；将用于提取蛋白的种子压扁，置于96孔pcr板或类似可以用于提取水溶蛋白的器具，确保每个孔内只有一粒种子，每孔加纯水35μl～40μl，100℃水浴5分钟后放置半小时即上样；

2)凝胶制备：采用水平灌胶的方式组装玻璃板，分离胶灌至离后玻璃板顶部3cm处，轻轻加一层蒸馏水覆盖静置30min以上；浓缩胶灌胶至玻璃板顶端，并迅速插好点样梳，浓缩胶凝固后拔出点样梳；

3)点样：每粒种子取25μl提取液上样，每加一个样品后用纯水清洗两次进样器；

4)电泳：上样完毕后，用电极缓冲液封样，然后将电泳槽注满电极缓冲液，加1滴0.2％溴酚蓝作指示剂，4-15℃条件下，每电泳槽30ma稳流电泳；30min后，调电流至60ma继续稳流电泳，待指示剂至凝胶底部时结束电泳；

5)卸板、染色：电泳结束后，取出胶板，将分离胶转移至染色液中染色30min后，置于观片灯上读带。

申请人已将上述水溶蛋白检测方法成功地应用在甘蓝型油菜杂交品种的种子纯度鉴定上。

2.鉴定甘蓝型油菜杂交种纯度的方法，其步骤如下：

a)以甘蓝型油菜杂交品种“沣油520”的陕西杂交制种基地生产的杂交种种子为材料，按上述1所述水溶蛋白检测方法检测其水溶蛋白谱带类型；

b)找出根据步骤a)中杂交种与母本水溶蛋白谱带的差异，检测“沣油520”制种样中具有母本水溶蛋白电泳谱带类型的个体数量；

c)纯度计算公式为：水溶蛋白鉴定种子纯度＝(1-母本带型数量/总检测种子数量)×100％。

沣油520水溶蛋白电泳图谱图1所示，纯度鉴定结果为91.2％。

纯度验证：将同一批“沣油520”制种样同时进行种植鉴定和醇溶蛋白鉴定，其中种植鉴定利用盛花期育性表现调查纯度，纯度计算公式为：种植鉴定种子纯度＝(1-不育株数/总调查株数)×100％；醇溶蛋白鉴定利用杂交种与母本醇溶蛋白谱带的差异，纯度计算公式为：醇溶蛋白鉴定种子纯度＝(1-母本带型数量/总检测种子数量)×100％。分析三种方法的鉴定结果，验证该方法进行纯度鉴定的准确性。

纯度验证结果显示，将同一批“沣油520”制种样利用醇溶蛋白鉴定，纯度鉴定结果为90.3％；

在西宁进行种植鉴定，纯度鉴定结果为91.3％。

纯度验证结果如表1显示，水溶蛋白鉴定甘蓝型油菜杂交种种子纯度方法的鉴定结果与种植鉴定和醇溶蛋白鉴定都较高的一致性。

表1：不同方法鉴定沣油520种子纯度比较

本发明成功得到一种适合于油菜杂交种的水溶蛋白检测方法，并利用该方法鉴定甘蓝型油菜杂交种纯度，得到了一种快速鉴定甘蓝型油菜杂交种纯度的方法。本发明利用本方法、田间种植及醇溶蛋白3种不方法对同一批种子进行纯度鉴定，结果表明，3种方法鉴定的结果吻合，证明本发明的方法可在甘蓝型油菜杂交种的纯度鉴定中成功应用。该方法既可以克服油菜纯度鉴定中检验周期长等缺陷，又比醇溶蛋白样品迁移的速度快，鉴定效率高，而且提取液经济环保，提取效率高，谱带清晰，分辨高，为甘蓝型油菜杂交种种子纯度的严格把关奠定了基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。