六味地黄制剂多成分的hplc双波长指纹图谱测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药测试技术领域，更具体涉及一种六味地黄制剂多成分的HPLC双波长指纹图谱测定方法。
【背景技术】
[0002]六味地黄作为“滋补肾阴”的代表方剂，其疗效不容置疑，现今市场上的六味地黄制剂众多，故只有确保其质量，才能让这一经典古方充分发挥其治疗优势。2010版中国药典规定的含量测定:对于水蜜丸、小蜜丸、大蜜丸这三种剂型，含牡丹皮以丹皮酚计，水蜜丸每Ig不得少于0.90mg ;小蜜丸每Ig不得少于0.70mg ;大蜜丸每丸不得少于6.3mg。含酒萸肉以马钱苷计，水蜜丸每Ig不得少于0.70mg ;小蜜丸每Ig不得少于0.50mg ;大蜜丸每丸不得少于4.5mgo对于浓缩丸，每Ig含酒萸肉以马钱苷计，不得少于1.4mg，每Ig含牡丹皮以丹皮酚计，不得少于1.Smgo胶囊剂每粒含牡丹皮以丹皮酚计，规格(I)不得少于3.0mg ;规格(2)不得少于1.5mg，酒萸肉以熊果酸计，规格(I)不得少于0.60mg ;规格(2)不得少于0.30mg。其中丹皮酚和马钱苷采用高效液相色谱检测，且色谱条件不同，检测波长分别为274nm和236nm，熊果酸采用薄层色谱法进行含量测定，质量标准简单、粗糙，不科学。通常用单一成分或几个成分来标化和控制复方制剂的质量，它控制的只是药品的某个成分，而不是药品本身。如果在药品生产过程中，药材质量不符合药用要求，又要满足成药质量标准中规定的含量要求时，就会出现在该产品中添加化学标准品或其他成分的现象。化学标准品的添加改变了原有的药效组分，其疗效也就发生变化，给人们用药带来了不安全或无效性因素。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于，针对现有技术中存在的缺陷，提供一种六味地黄制剂多成分的高效液相色谱(HPLC)双波长指纹图谱测定方法。本发明提供的方法可以实现对六味地黄制剂中的主要成分进行快速、全面的检测，仪器易得，方法简便，操作性强。
[0004]本发明提供了一种六味地黄制剂多成分的HPLC双波长指纹图谱测定方法，所述方法包括以下步骤:
[0005](I)取六味地黄制剂，粉碎后精密称取，以浓度lg/ΙΟ?30ml溶解于甲醇中，超声提取，离心，取上清液过滤，即得六味地黄制剂溶液，备用；
[0006](2)精密称取标准品，以浓度20?30 μ g/ml溶解于甲醇中，即得标准品溶液，备用；
[0007](3)采用高效液相色谱法，在相同的检测条件下分别获得六味地黄制剂溶液和标准品溶液的色谱图；所述检测条件包括:
[0008]色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；
[0009]采用梯度洗脱；其中，流动相A为浓度0.08ml/100ml的磷酸水溶液，流动相B为乙腈；洗脱程序为:0?15min，2?15%流动相B ; 15?25min，15?25%流动相B ；25?40min，25 ?70% 流动相 B ；
[0010]检测波长为200-220nm 和 238_250nm ；
[0011](4)根据标准品的浓度、标准品在色谱图中的峰面积以及六味地黄制剂中与标准品相对应成分在色谱图中的峰面积，计算六味地黄制剂中与标准品相对应成分的含量。
[0012]本发明所述六味地黄制剂为六味地黄水蜜丸、大蜜丸、浓缩丸或胶囊。
[0013]本发明步骤(I)对六味地黄制剂的提取以及溶液的配制方法进行优化，从而增加了检测的准确度。具体而言，所述超声提取的超声波频率优选为35000?45000Hz，提取时间优选为20?40min在上述提取条件下，离心的速度优选为5000?20000转/分，离心时间为5?15min。离心后，可使用孔径0.2?0.3 μm的滤膜过滤对上清液进行过滤。通过对上述条件的优选，可以提高后续步骤中检测的准确度。
[0014]作为一种优选方案，本发明步骤⑴具体为:取六味地黄制剂，粉碎后精密称取，以浓度lg/10ml溶解于甲醇中，用频率40000Hz的超声波提取30min，以10000转/分的速度离心lOmin，取上清液，用孔径0.22 μ m的滤膜过滤，即得六味地黄制剂溶液。
[0015]本发明步骤(2)所述标准品根据六味地黄制剂中的有效成分和药典规定的检测成分进行选取，包括没食子酸、原儿茶酸、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、丹皮酚、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、苯甲酸和苯甲酰芍药苷。在本发明中，所述标准品的浓度是指每种标准品分别的浓度，在实际操作时，可将各种标准品分别精密称量后，合并，溶解于特定量的甲醇中，并混合均匀，得到混合标准品溶液。所述标准品的浓度优选为:没食子酸、原儿茶酸、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、丹皮酚、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、苯甲酸和苯甲酰芍药苷的浓度均为25 μ g/ml ο
[0016]由于不同成分在不同波长下出峰情况不同，因此，本发明优选在在检测波长为200-220nm的条件下检测没食子酸、原儿茶酸、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、丹皮酚；在检测波长为238-250nm的条件下，检测5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、苯甲酸、苯甲酰芍药苷。
[0017]本发明步骤(3)所述检测的波长优选为210nm和238nm。采用这两个波长对上述成分进行检测，可以实现最佳的分析效果。
[0018]本发明步骤⑶所述磷酸水溶液浓度0.08ml/100ml的含义为??每10ml溶液中含有0.08ml磷酸。所述梯度洗脱程序中，流动相B的百分比是指流动相B占两相体积之和的体积百分比。
[0019]本发明步骤(3)还可以包括以下检测条件:色谱柱的规格为250_X4.6_。色谱柱填充剂的粒径为5 μ m。所述填充剂可选用购自安捷伦科技公司的Agilent C18。色谱柱的柱温为25?35°C，优选为30°C。流动相流速为0.5?1.5ml/min，优选为1.0ml/min。进样量为10?30 μ I，优选为20 μ I。
[0020]由于标准品溶液和六味地黄制剂溶液的检测条件相同，在色谱图中，六味地黄制剂中与标准品相对应成分出峰的保留时间和峰形应与标准品基本相同，因此，可以通过相同的保留时间判断两幅色谱图中相对应的成分，并通过峰的形状辅助确认。本发明步骤(4)通过比较标准品溶液色谱图和六味地黄制剂溶液色谱图中相对应成分的峰面积，根据标准品的已知浓度，计算出六味地黄制剂溶液中与标准品相对应成分的浓度，进一步计算出六味地黄制剂中与标准品相对应成分的含量。
[0021]本发明选定两个波长同时检测六味地黄制剂中的多个成分，全面定量了六味地黄丸及胶囊制剂，有利于从整体上评价该六味地黄制剂的质量，确保其临床疗效。
【附图说明】
[0022]图1是实施例1中第一批六味地黄浓缩丸样品与混合标准品在2 1nm波长下的对比图；图中标记:a、六味地黄样品，b、混合标准品，1、没食子酸，2、原儿茶酸，3、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖，4、丹皮酚。
[0023]图2是实施例1中第一批六味地黄浓缩丸样品与混合标准品在238nm波长下的对比图；图中标记:a、六味地黄样品，b、混合标准品；5、5_羟甲基糠醛，6、莫诺苷，7、马钱苷，8、獐牙菜苷，9、芍药苷，10、苯甲酸，11、苯甲酰芍药苷。
[0024]图3是实施例1中另外五个不同批次的六味地黄浓缩丸剂样品在双波长(210nm和238nm)模式下的色谱图；图中标记:a、检测波长为210nm，b、检测波长为238nm ;1、第二批，2、第三批，3、第四批，4、第五批，5、第六批。
[0025]图4是实施例1中四种不同剂型的六味地黄制剂样品在双波长(210nm和238nm)模式下的色谱图；图中标记:a、检测波长为210nm，b、检测波长为238nm ;1、六味地黄浓缩丸，2、六味地黄水蜜丸，3、六味地黄大蜜丸，4、六味地黄胶囊。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
[0027]本发明实施例采用的仪器与试药包括:安捷伦1260高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，万分之一电子天平(ME204E，Mettler-Toledo)，超纯水(MiIl1-Q, Millipore)，乙腈(色谱纯，Merk)，磷酸(色谱纯，DikmaPure)。标准品:没食子酸(北京赛百草有限公司，130718)，原儿茶酸(北京赛百草有限公司，130106)，1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖(北京赛百草有限公司，130508)，丹皮酚(中国食品药品监督管理局，110708-200506)，5_羟甲基糠醛(北京赛百草有限公司，131124)，莫诺苷(北京赛百草有限公司，130912)，马钱苷(北京赛百草有限公司，1201204)，獐牙菜苷(北京赛百草有限公司，140425)，芍药苷(北京赛百草有限公司，130726)，苯甲酸(北京赛百草有限公司)，苯甲酰芍药苷(北京赛百草有限公司，131108)。
[0028]实施例1
[0029]按照以下步骤对六味地黄制剂进行检测:
[0030](I)取六味地黄制剂，粉碎后精密称取，以浓度lg/10ml溶解于甲醇中，用频率40000Hz的超声波提取30min，以10000转/分的速度离心lOmin，取上清液，用孔径0.22 μ m的滤膜过滤，即得六味地黄制剂溶液，备用；
[0031](2)精密称取没食子酸、原儿茶酸、1，2，3，4，6_五没食子酰葡萄糖、丹皮酚、5_羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、苯甲酸和苯甲酰芍药苷，以甲醇为溶剂，配制成浓度分别为25 μ g/mL的标准品溶液，备用；
[0032](3)采用高效液相色谱法，在相同的检测条件下分别获得六味地黄制剂溶液和标准品溶液的色谱图；所述检测条件包括:
[0033]色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶Agilent C18，粒径为5 μπι ;色谱柱规格为250mmX4.6mm ；
[0034]采用梯度洗脱；其中，流动相A为浓度0.08ml/100ml的磷酸水溶液，流动相B为乙腈；洗脱程序为:0?15min，2?15%流动相B ; 15?25min，15?25%流动相B ；25?40min，25 ?70% 流动相 B ；
[0035]检测波长为21nm和238nm ；
[0036]柱温为30 °C ；
[0037]流动相流速为1.0mL/min ；
[0038]进样量为20 μ L ;
[0039](4)根据标准品的浓度、标准品在色谱图中的峰面积以及六味地黄制剂中与标准品相对应成分在色谱图中的峰面