定义：胰岛素抵抗指数（HOMA-IR)
[0029] 应用稳态模型评估方法，计算方法为HOMA-IR =空腹胰岛素（μ IU/ml) *空腹血糖 (mmol/L) /22. 5〇
[0030] 定义：代谢综合征
[0031] 依据NCEP/ATPIII标准以及调整后的亚洲标准，以下五项满足三项或以上即：1) 中心性肥胖：男性腰围^ 90cm，女性腰围大于^ 80cm ;2)高TG血症：空腹TG ^ I. 69mmol/ L ;3)低 HDL 血症：女性空腹 HDL < I. 29mmol/L(50mg/dl)，男性空腹 HDL〈1. 04mmol/ L(40mg/dl) ;4)血糖升高：空腹血糖彡5. 6mmol/L或已诊断为2型糖尿病；5)高血压： SBP彡130mmHg或DBP彡85mm Hg，或正在接受降压药物治疗。
[0032] 2.研究人群按照血清GREM2水平分组的基本特征。
[0033] 为进一步研究GREM2与肥胖的相关性，我们根据血清GREM2水平四分位 将人群分为四组 ：0皿竹丨16 1组：61?]\12〈517.32口8/1111山皿竹丨16 2组：517.32口8/ ml〈GREM2〈600.80pg/ml;Quartile 3 组：600.80pg/ml〈GREM2〈709.58pg/ml;Quartile 4 组：GREM2>709. 58pg/ml。结果表明随着血清GREM2水平增加，该人群的BMI、腰围逐渐升高。 进一步分析不同血清GREM2水平下体脂含量的差异。我们发现，随着血清GREM2水平的增 加，体脂含量百分比的平均水平也依次增加，线性趋势检验发现有显著的统计学意义。结果 如图2显不，血清GREM2水平越高肥胖指标BMI、Waist circumference、Fat mass也越高。
[0034] 3.血清GREM2水平与BMI、腰围呈正相关。
[0035] 为了探讨血清GREM2水平与肥胖的相关性是否独立于其他影响因素，我们进一步 采用多元线性回归分析的方法，对血清GREM2水平与全身性肥胖指标BMI和腹型肥胖指标 腰围进行多因素分析。该模型以BMI或腰围为多元回归模型因变量，以对数转换后的血清 GREM2水平为自变量。多元线性回归分析显示（表2)，在校正了年龄、性别后，血清GREM2 水平与BMI及腰围呈显著正相关。在以上模型的基础上，进一步校正了血肌酐水平、甘油三 酯、高密度脂蛋白、高敏C反应蛋白、糖化血红蛋白、收缩压、谷丙转氨酶水平、谷草转氨酶 水平、空腹胰岛素水平后，该相关性依然显著独立存在。
[0036] 表2.多元线性回归分析lgGREM2与BMI和腰围之间的关系
[0037]
[0038] Model 1:校正了年龄、性别
[0039] Model 2:校正了年龄、性别、血肌酐水平、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、高敏C 反应蛋白、糖化血红蛋白、收缩压、谷丙转氨酶水平、谷草转氨酶水平、空腹胰岛素水平。
[0040] 结果表明，血清GREM2水平与BMI及腰围呈显著正相关，且该相关性独立于一系列 已知或潜在的混杂因素。
[0041] 4. GREM2主要表达于成熟的内脏脂肪细胞
[0042] 利用小鼠模型来研究升高的GREM2的来源及与肥胖发生的关系。我们首先检测了 Grem2的小鼠组织表达谱，共选取小鼠全身16个组织，包括主要代谢相关组织腹股沟皮下、 附睾旁内脏脂肪、肩胛间棕色脂肪、肝脏、肌肉以及重要脏器心、肾、肺等。结果（图3A)表 明Grem2在内脏脂肪中表达最高，其次是肝脏，提示GREM2可能在代谢过程中发挥重要作 用。脂肪组织包括成熟脂肪细胞和前体脂肪细胞（SVF)，GREM2究竟在那种细胞中表达最高 呢？我们进一步分离了正常饮食情况下腹股沟皮下（IWAT)、附睾旁内脏（EWAT)和棕色脂 肪（BAT)组织的前体脂肪细胞SVF及对应的成熟脂肪细胞（M)。
[0043] 如图3B所不，GREM2在内脏脂肪的成熟脂肪细胞中表达最尚，且明显尚于相应的 SVF，皮下脂肪GREM2表达则相对较低。
[0044] 5.小鼠冷冻模型和促进棕色化的药物模型。
[0045] 研究表明BMPs家族在白色脂肪棕色化中发挥重要作用。那么，我们推测作为BMPs 的拮抗剂，GREM2也可能在白色脂肪棕色化过程中发挥重要作用。我们建立了两个常用的 白色脂肪棕色化模型即冷冻模型和给予促进白色脂肪棕色化药物模型（T3，R 〇SiglitaZ〇ne 和CL316243)，检测GREM2变化情况。冷冻情况下能量消耗增加，脂肪组织棕色化增强，甲状 腺素、罗格列酮、CL316243 ( β 3肾上腺素受体激动剂），这三种药物都明显促进白色脂肪棕 色化促进能量消耗。结果显示（图4Α)，小鼠冷冻10天后，血清GREM2水平明显下降。在给 予促进白色脂肪棕色化药物后，小鼠皮下、内脏脂肪GREM2表达水平明显下降（图4Β，4C)。 这些结果提示GREM2可能参与白色脂肪细胞棕色化、参与能量代谢过程。
[0046] 6. GREM2抑制白色脂肪棕色化。
[0047] 为了研究GREM2在白色脂肪棕色化中的参与作用，我们分离小鼠腹股沟皮下脂肪 SVFdnguinal SVF，ISVF)和附睾旁内脏脂肪SVF(印ididymal SVF，ESVF)，体外向棕色脂肪 诱导分化。检测ISVF诱导不同阶段的脂肪细胞Grem2的变化。如图5A所示，与前体细胞 相比，在诱导两天后，GREM2水平急剧下降，随着脂肪细胞的分化成熟，GREM2的表达持续低 水平，提示GREM2可能抑制皮下白色脂肪细胞棕色化。
[0048] 研究表明，皮下白色脂肪棕色化的能力远远高于内脏脂肪。为了进一步阐明GREM2 对白色脂肪棕色化的影响，我们分别给予ISVF和ESVF不同剂量的GREM2蛋白作用3天，继 而向棕色脂肪细胞诱导分化，诱导成熟后检测标志基因表达。结果如图5B、5C所示，GREM2 明显抑制棕色脂肪特异性基因UCPl的表达。尤其在皮下脂肪前体细胞中，随着GREM2剂量 的增大，对UCPl的抑制作用也更强。GREM2在内脏脂肪前体细胞中也发挥着抑制棕色化的 作用，但其抑制作用只在高剂量时明显。
[0049] 之后，我们用慢病毒下调皮下脂肪前体细胞中GREM2基因表达，再用棕脂诱导方 案进行诱导分化。如图f5D所示，GREM2基因表达下调后，皮下脂肪细胞棕色化能力明显增 强。
[0050] 以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的 内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范 围。
【主权项】
1. 分泌因子GREM2在制备肥胖疾病筛选试剂中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述疾病为肥胖症或肥胖症相关慢性并 发症。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述分泌因子GREM2与肥胖症呈显 著正相关。
【专利摘要】本发明涉及一种疾病筛选的试剂的制备，特别涉及分泌因子GREM2在制备肥胖疾病筛选试剂中的应用。本发明首先从正常人和肥胖患者血清检测中发现随着BMI水平上升、胰岛素抵抗指数增加、代谢综合征组分的增加，血清GREM2水平也越高。进一步多元线性回归结果显示，血清GREM2水平与体重指数、腰围呈正相关，校正了一系列混杂因数后，该相关性仍然显著独立存在。体外研究结果显示，GREM2可以明显抑制白色脂肪棕色化过程。所以，脂肪分泌因子GREM2可以作为肥胖的血清学标志物，应用于预测肥胖及其相关慢性并发症，为临床上评估肥胖及代谢综合征风险提供了理论依据。
【IPC分类】G01N33/66, G01N21/76, G01N30/02
【公开号】CN105136780
【申请号】CN201510494739
【发明人】宁光, 洪洁, 王计秋, 刘瑞欣, 杨明兰
【申请人】上海交通大学医学院附属瑞金医院
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月13日