石墨烯/酶电化学生物传感器的制备及对有机磷农药残留的检测的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种石墨烯/酶电化学生物传感器及其制备方法，该电化学生物传感 器可应用于有机磷农药的检测，具有灵敏度高，制备简单，操作方便等优点。
【背景技术】
[0002] 有机磷农药（organophosphorus pesticide, OPs)是一类高效、广谱的杀虫剂、除 草剂，因其高的杀虫活性，在农业领域中被广泛使用。然而，有机磷农药的不当使用导致其 大量残留，对环境和人类健康造成巨大威胁。有机磷农药中毒主要是OPs能抑制乙酰胆碱 酯酶（AChE)的活性，使乙酰胆碱（acetycholine，ATCl)过量积聚，引起中枢神经调节功能 紊乱，导致呼吸系统破坏及死亡。因此，发展快速、灵敏、高效的超微农药检测的检测方法是 具有重要意义的。
[0003] 检测有机磷农药的传统分析方法，如分光光度法、滴定法、气相色谱法、液相色谱 法、化学发光等已被广泛应用，虽然这些方法对农药残留的检测较为灵敏、可靠，但是存在 仪器价格昂贵、检测耗时长、不适合现场检测、需要复杂的预处理步骤等缺点，为有机磷农 药的检测带来了不便之处。而石墨烯/酶电化学生物传感器则是通过改变酶的活性，对有 机磷农药进行检测的。由于石墨烯/酶电化学生物传感器具有检测快速、操作简单、成本 低、灵敏度高等优点，所以，石墨烯/酶电化学生物传感器应用于有机磷农药的检测，可为 有机磷农药的检测带来方便。
[0004] 电极的表面修饰是构建电化学生物传感器至关重要的环节。目前修饰电极的材料 主要有碳纳米管、C60、纳米金、纳米二氧化钛等，其中石墨烯由于具有独特的电学性质和催 化性能，受到了广泛应用。氧化石墨稀（Graphite oxide)是石墨稀重要的派生物，它的结 构与石墨烯大体相同，但是氧化石墨表面含有大量功能性基团，如羟基、羧基、环氧基和羰 基等，这些含氧官能团的存在使得氧化石墨烯的片层与片层之间摆脱了强大的JT-JT范德 华吸引力，彼此分开。另外，由于大量亲水基团的存在，氧化石墨具有较好的亲水性，这也使 得氧化石墨能以单片的形式分散在水溶液中，形成稳定的胶体溶液。因此，制备的氧化石墨 烯既有功能基团的性质，又保有一定的导电能力。所以在制备检测有机磷农药的电化学生 物传感器的过程中，氧化石墨稀是一个首选纳米材料。然而，在适合固定AChE的中性和碱 性溶液中，氧化石墨烯并不稳定。因此需要寻找一种载体，使氧化石墨烯在中性和碱性溶液 中，变得稳定。壳聚糖是天然产物，且具有良好的生物相容性、无毒性及高机械强度并且价 格便宜等优点，所以被广泛选择作为固定载体。最近的研究表明，氧化石墨与壳聚糖同时在 电极表面存放形成的复合膜在中性溶液和碱性溶液中具有良好的生物相容性和稳定性。
[0005] 在本发明中，申请人通过改进hu_ers法制备氧化石墨稀，然后将氧化石墨稀 (GO)-壳聚糖（CS)混合溶液修饰在玻碳电极（GCE)表面，再将乙酰胆碱酯酶（AChE)修 饰到有GO-CS混合膜的GCE表面，形成氧化石墨烯-壳聚糖-乙酰胆碱酯酶/玻碳电极 (G〇-CS-AChE/GCE)，构建了检测有机磷农药的石墨烯/酶电化学生物传感器，同时还检测 了该石墨烯/酶电化学生物传感器对有机磷农药检测的灵敏度。
【发明内容】
[0006] 本发明是鉴于现有技术中存在的上述问题而做出的，本发明的目的在于提供一种 制备简单、成本低、稳定性高、能快速灵敏检测有机磷农药的石墨稀/酶电化学生物传感 器。本发明还提供了该石墨烯/酶电化学生物传感器的制备方法及其用途。
[0007] 具体地，本发明以玻碳电极作为基底电极，在其表面修饰了氧化石墨烯（GO)-壳 聚糖（CS)混合膜，然后将AChE固定在GO-CS混合膜修饰的玻碳电极表面，构建了用于检测 有机磷农药的电化学生物传感器。GO-CS复合膜具有氧化石墨特殊的电子传输性质和大的 比表面积，同时，其能保持壳聚糖良好的生物相容性和AChE的活性，当GO-CS复合膜作为载 体对有机磷农药进行检测时，既能保持生物传感器的稳定性，又能提高检测的灵敏度。进一 步地，所述有机磷农药选自西维因和敌百虫，也可用于其他有机磷农药的检测
[0008] 更具体地，通过改进的Hmnmers法制备氧化石墨稀（GO)，随后将氧化石墨稀与壳 聚糖溶液混合制成氧化石墨烯（GO)-壳聚糖（CS)混合溶液，在玻碳电极表面上依次滴加 GO-CS混合溶液和乙酰胆碱酯酶，从而获得乙酰胆碱酯酶-氧化石墨烯-壳聚糖修饰的玻碳 电极（G〇-CS-AChE/GCE)生物传感器。进一步地，所述壳聚糖溶液的浓度为0. 05% -0. 4%， 优选为〇. 2%。所述乙酰胆碱酯酶的浓度为0. 2-2. Ommol/1，优选为1.0 mmol/1。
[0009] 根据本发明的另一实施方案，提供了使用G〇-CS-AChE/GCE检测有机磷农药如西 维因和敌百虫的方法，所述方法包括将G〇-CS-AChE/GCE浸入不同浓度西维因和敌百虫的 标准溶液5min后，采用循环伏安曲线法，进行电化学检测，通过建立不同浓度的敌百虫和 西维因标准曲线，计算出其检出限。结果表明构建的酶生物传感器应用于西维因和敌百 虫的检测时，它们的线性范围分别为10~lOOnmol/L和10~60nmol/L，相关系数分别为 0. 993和0. 994,经计算可知检出限均为3. 3nmol/L(检出限为最低检测浓度的三分之一）。 进一步地，西维因和敌百虫标准溶液的浓度为10~100nmol/L。
[0010] 本发明的有益效果
[0011] 由此可知，本发明的方法操作简单，检测快速，并且灵敏度高，弥补了传统光谱法 和色谱法的样品处理繁琐、仪器价格昂贵等不足。此外，还将本发明制备的生物传感器应用 于生菜样品的检测，并对酶的稳定性进行了检测。这些结果均表明，本发明的生物传感器具 有优异的稳定性，高的灵敏度等优点，适用于有机磷农药的快速、灵敏检测。
【附图说明】
[0012] 图1为制备本发明的乙酰胆碱酯酶-氧化石墨烯-壳聚糖修饰的玻碳电极 (G〇-CS-AChE/GCE)生物传感器的实验流程图。
[0013] 图2(a)为氧化石墨烯（GO)的扫描电子显微镜（SEM)图。
[0014] 图2 (b)为氧化石墨稀（GO)的原子力显微镜（AFM) 〇
[0015] 图2 (c)为氧化石墨烯（GO)的X射线衍射（XRD)谱图。
[0016] 图2(d)为氧化石墨烯（GO)的透射电子显微镜（TEM)图。
[0017] 图2(e)为氧化石墨烯（GO)的高分辨透视电子显微镜（HRTEM)和选区电子衍射 (SAED)图。
[0018] 图 3 为 GCE、GO_CS/GCE、AChE/GCE 和 G〇-CS-AChE/GCE 在 0· lmol/LPBS (c (ATCl)= 1.0 mmol，pH = 7. 0)中的循环伏安曲线图；扫描速率：100mV/s。
[0019] 图 4 (a)为 G〇-CS-AChE/GCE 在 0· lmol/LPBS (pH = 7. 0)随着 ATCl 浓度变化的循 环伏安图，ATCl的浓度从0. 2mmol/L到2. 0mmol/L，扫描速率：100mV/s。
[0020] 图 4 (b)为 G〇-CS-AChE/GCE 在 0· lmol/LPBS (pH = 7. 0)随着 ATCl 浓度变化的峰 电流图，ATCl的浓度变化从0. 2mmol/L到2. 0mmol/L。
[0021] 图 5 (a)为 G〇-CS-AChE/GCE 在 0· lmol/LPBS (c (ATCl) = 1.0 mmol，pH = 7. 0)中对 不同浓度西维因的循环伏安响应曲线，扫描速率：l〇〇mV/s。
[0022] 图5(b)为G〇-CS-AChE/GCE对不同浓度西维因的峰电流标准曲线，标准工作曲线 为 10nmol/L ~100nmol/L，支持电解质为 0· lmol/LPBS (c (ATCl) = 1.0 mmol，pH = 7. 0)。
[0023] 图5(c)为G〇-CS-AChE/GCE对不同浓度西维因的抑制率曲线，标准工作曲线为 10nmol/L ~100nmol/L·，支持电解质为 0· lmol/LPBS (c (ATCl) = 1.0 mmol，pH = 7. 0)。
[0024] 图 6 (a)为 G〇-CS-AChE/GCE 在 0· lmol/LPBS (c (ATCl) = 1.0 mmol，pH = 7. 0)中对 不同浓度敌百虫的循环伏安响应曲线，其中敌百虫浓度为lOnmol/L~100nmol/L，扫描速 率：100mV/s 〇
[0025] 图6(b)为G〇-CS-AChE/GCE对不同浓度西维因的峰电流标准曲线，标准工作曲线 为 10nmol/L ~60nmol/L，支持电解质为 0· lmol/LPBS (c (ATCl) = 1.0 mmol，pH = 7. 0)。
[0026] 图6(c)为G〇-CS-AChE/GCE对不同浓度西维因的抑制率曲线，标准工作曲线为 10nmol/L ~60nmol/L.，支持电解质为 0· lmol/LPBS (c (ATCl) = 1.0 mmol，pH = 7. 0)。
[0027] 图 7 为 G〇-CS-AChE/GCE 在 0· lmol/LPBS (c (ATCl) = 1.0 mmol，pH = 7. 0)中对生 菜样品的循环伏安响应曲线，扫描速率：l〇〇mV/s。
[0028] 图 8(a)为 G〇-CS-AChE/GCE，在 4°C下，保存不同时间后，在 0· lmol/LPBS(c(ATCl) =1.0 mmol，pH = 7. 0)中的循环伏安曲线图，扫描速率：100mV/s。