一类荧光试剂，制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 发明涉及到一类荧光试剂及其制备方法，并将其应用于血清蛋白浓度及鉴别其是 否变性上，属于生物大分子含量及结构研究领域。
【背景技术】
[0002] B0P頂-NR在水中的荧光强度非常微弱，一旦进入到血清蛋白（SerumAlbumin，SA) 结构中，就会发出较为强烈的绿色荧光，且荧光强度与SA浓度之间存在很好的剂量关系， 可以作为一种灵敏的SA识别探针试剂。当SA完全变性，化合物的荧光发射谱发生明显变 化，波长蓝移达到15nm以上，峰型也会发生明显变化，可以以此鉴别SA的变性，并监测其变 性过程。此类方法属首次报道，鉴别方法较为直观，具有操作简单，灵敏度高和成本低廉等 特点，值得推广。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种荧光试剂，该试剂的结构式为：
[0004]
封己为 B0P頂-NR。
[0005] 所述的荧光试剂B0P頂-NR的结构以核磁共振（NMR)谱鉴定： 庄匪尺(4001抱，〇)(：13):5 8.35((1，了 = 5.6Hz，1H)，8.05 (t，J = 7.8Hz，1H)，8.00 (d，J = 8. 0Hz, 1H), 7. 54 (m, 4H), 7. 34 (t, J = 6. 6Hz, 1H), 6. 72 (m, 4H), 2. 98 (s, 6H), 2. 96 (s, 6H). C13NMR(100MHz, CDC13) : S 148. 91，148. 59, 144. 79, 144. 08, 143. 27, 140. 00, 133. 35, 128. 51 ，127. 88, 122. 49, 120. 76, 117. 90, 116. 28, 111. 30, 111. 10, 39. 54, 39. 29。产品纯度 95% 以 上，产率20%。
[0006] 本发明还提供一种荧光试剂的合成方法，具体为：
[0007] 1)称取取代氨基苯甲醛，2-氰基吡啶，以及醋酸铵入微波反应器的三颈瓶中，温 度设定为150~200°C，半小时后形成棕色溶液；
[0008] 2)将该棕色溶液倒入冰水，加氢氧化钠中和，用碳酸钠检测，接着用乙酸乙酯做萃 取剂，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱色谱分离，得橙色固体；
[0009] 3)在充氮气条件下，将上述橙色固体，三乙胺，加入二氯甲烷溶剂中，在冰盐浴滴 加三氟化硼乙醚后再在室温条件下搅拌过夜，母液水洗，二氯乙烷萃取，无水硫酸钠干燥， 浓缩，硅胶柱色谱分离，得到红棕色粉末状固体即为荧光试剂，标记为B0P頂-NR，具体合成 路线为：
[0010]
b
[0011] 上述的步骤1)中，对（N，N-二甲基）苯甲醛、2-氰基吡啶、醋酸铵的摩尔比为1 : 2-3 :4-7 ;步骤2)中，橙色固体与三氟化硼的摩尔比为1 :4-6。
[0012] 进一步优选为步骤1)中，对取代氨基苯甲醛、2-氰基吡啶、醋酸铵的摩尔比为1 : 2. 5 :5 ;步骤2)中，橙色固体与三氟化硼的摩尔比为1 :5. 5。
[0013] 本发明的另一目的在于提供一种操作简单，灵敏度高和成本低廉的荧光探针法测 定血清蛋白（SA)浓度及鉴别其是否变性的方法。
[0014] 所述的血清蛋白变性包括高温变性、化学变性、超声变性等一切物理及化学因素 诱导的蛋白质结构的改变。
[0015] 具体检测方法如下：
[0016] (1)测定溶液的配制
[0017] 称量B0P頂-NR，加入1，4-二氧六环助溶，再加入10mL磷酸盐缓冲液，得到 2. 0 X 10 6mol/L的溶液，用保鲜膜和锡箱纸包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存，同时，将正 常或变性的牛血清蛋白，以磷酸盐缓冲液配制成1. 0X 10 4mol/L溶液备用；
[0018] (2)荧光测定方法
[0019] 取B0P頂-NR溶液加入石英荧光比色皿中，加入血清蛋白储备液10~100 y L，在荧 光分光光度计上设置365nm为激发波长，狭缝均调为10nm，在370~700nm范围进行扫描， 得到B0PIM-NR在SA存在时的荧光光谱；
[0020] (3)定量测定血清蛋白含量
[0021] 通过B0P頂-NR在不同浓度牛血清蛋白存在时的荧光光谱，固定发射波长485nm， 读取荧光强度，应用以下方稈：
[0022]
[0023] 式中：1。、1和^分别为没有SA存在、有SA存在以及SA的浓度无限大时B0P頂的 荧光强度。以1AI-U对1/[SA]作图，建立得到标准曲线。测定B0P頂-NR在未知样品中 的荧光强度，通过标准曲线得到SA含量。
[0024] (4) SA变性鉴别方法
[0025] 根据荧光试剂B0P頂-NR的荧光发射波长和峰型进行鉴别，在正常牛血清蛋白中， BOP頂-NR的荧光发射波长在较长波长（约485nm)，峰型对称；当血清蛋白变性后，化合物在 其中的荧光发射波长蓝移20nm，至465nm，峰型不再对称。
[0026] 荧光测定时溶液配制缓冲液所用水均为二次蒸馏水或更高纯度的水。
[0027] 所述的磷酸盐缓冲液为由NaCl 8g，KCl 0.28，腿2?040 . 248，似2册041.448(如果是 Na 2HP04 ? 12H20,则3. 63g)溶于1000mL水中配制而成。
[0028] 本发明使用的荧光试剂合成路线简单，原料成本低廉，反应条件相对温和，产率较 高，产物分离方法较为简单，产物纯度可达到99 %以上，试剂存放条件温和，产品稳定，不宜 光解或分解。
[0029] 本发明使用的荧光试剂合成工艺条件易控制，易实现路线放大或工业化，设备要 求不苛刻，反应产生废弃物少，污染小，废弃物易处理。
[0030] 采用本类荧光试剂容易实现在水体系中进行SA定量测定，而现行的荧光试剂大 多水溶性较差，难于实现；测量的机制主要是基于此类化合物具有易扭转的分子内电荷转 移特性，进入到血清蛋白的疏水腔中，化合物结构和荧光性质会发生转化，从而实现对生物 大分子的特性识别。
[0031] 用于定量测量的标准曲线线性关系良好，适用于低含量SA的定量测定（10 6M以 下）。对SA变性的鉴别方法直观，简洁，直接通过荧光光谱可以得出正确结论。从文献调研 结果来看，本鉴别方法是目前最直观的SA变性鉴别方式。
【附图说明】
[0032] 图1为荧光试剂在不同介质中的荧光图，其中，图1-1为水体系中；图1-2为在BSA 体系中。
[0033] 图2为B0P頂-NR在不同浓度BSA中的荧光光谱。CBSA从1到10的浓度依次为 1 y M，2 y M，3 y M，4 y M，5 y M，6 y M，7 y M，8 y M，9 y M, 10 y M〇
[0034] 图3为BSA定量测定用标准曲线
[0035] 图4. B0P頂-NR在正常BSA与热变性BSA的荧光图谱，其中，a为正常BSA的荧光 光谱图，b为热变性的荧光光谱图。
[0036] 图5.正常BSA与超声破碎后的BSA的荧光图谱，a为正常BSA的荧光光谱图，b为 超声破碎后的BSA的荧光图谱。
[0037] 图6. B0P頂-NR在正常BSA与尿素致变性的BSA的荧光图谱，其中，a为正常BSA的 荧光光谱图，b为加尿素后的BSA的荧光图谱。
[0038] 图7荧光试剂B0P頂-NR在BSA体系中温育温育不同时间时荧光发射波长
[0039] 图8 B0P頂-NR在经不同方式处理的BSA中的荧光发射波长变化
【具体实施方式】
[0040] 下述试验和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
[0041] 实施例1
[0042] 由N，N_二甲基苯甲醛，氰基吡啶，三氟化硼等为主要原料经两步反应合成得到。 合成步骤：
[0043]称量对二甲基苯甲醛1. 5g(0.0 lmol)，2_氰基吡啶2. 6g(0. 025mol)，以及醋酸铵 3. 9g(0. 05mol)加入微波反应器的三颈瓶中，温度设定为170°C，半小时后形成棕色溶液。 母液倒入冰水，加氢氧化钠中和，用碳酸钠检测，接着用乙酸乙酯做萃取剂，无水硫酸钠干 燥，浓缩，硅胶柱色谱分离，得橙色固体。在充氮气条件下，称量橙色固体1. 53g(4mmol)，三 乙胺（6ml)，加入二氯甲烷（25ml)做溶剂，冰盐浴滴加3. 2g (2. 8ml，22mmol)三氟化硼乙醚， 在室温条件下搅拌过夜。母液水洗，二氯乙烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱色谱分 离，得到红棕色粉末状固体BOP頂-NR。
[0044] (1) B0P頂-NR定量测定BSA含量，其方法如下：
[0045] 称量B0P頂-NR0. 00862g，准确加入1，4-二氧六环0. lmL和10mL磷酸盐缓冲液 (PBS，pH7. 2~7. 4)，得到2. 0X 10 6m〇l/L的溶液，用保鲜膜和锡箱纸包裹好，密封，避光， 置于冰箱中保存。同时，将牛血清蛋白（BSA)以磷酸盐缓冲液配制成1.0X10 4m〇l/L溶液 备用。
[0046] 取B0P頂-NR溶液2mL加入石英荧光比色皿中，依次加入BSA溶液10~100 y L， 在荧光分光光度计上设置365nm为激发波长，激发和发射狭缝均调为10nm，在370~700nm 范围进行扫描，得到B0PIM-NR在不同浓度BSA存在时的荧光光谱，见图2。
[0047] 读取B0P頂-NR在不同浓度BSA存在时、发射波长485nm的荧光强度，应用以下方 程：