例4
[0102] 按照实施例1和2的方法检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量及其回收率，区 别在于，提取液含有1毫升的亚铁氰化钾、2毫升的乙酸锌及22毫升甲醇。
[0103] 实施例1和2以及对比例3~5的检测结果如表2所示。利用含有乙腈和乙腈+ 甲醇的提取液对黄曲霉毒素Ml检测回收率均能符合国标GB/T27404-2008要求，但是针对 黄曲霉毒素B1的回收率乙腈提取方法偏低。亚铁氰化钾+乙酸锌+甲醇提取对黄曲霉毒 素Ml和B1结果均不符合要求。此外，利用乙腈提取，经过离心后提取液与样品杂质没有完 全分离，经乙腈+甲醇和亚铁氰化钾+乙酸锌+甲醇提取的沉淀效果非常好，能够达到提取 液与样品杂质完全分离。综上，采用乙腈和甲醇作为提取液进行提取。
[0104] 表2不同提取液对黄曲霉毒素Ml和B1含量及回收率的影响
[0105]
[0106] 对比例5
[0107] 按照实施例1和2的方法检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量及其回收率，区 别在于，提取液含有乙腈和甲醇的体积比2:8混合而成。
[0108] 结果发现，利用对比例5的方法进行检测，实施例1的步骤（1)中，离心处理得到 的混合液较浑浊，沉淀不完全现象，进而无法进行后续试验。
[0109] 实施例3
[0110] 按照实施例1和2的方法检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量及其回收率，区 别在于，（1)待测液中含有10克发酵乳、〇. 〇2ng/mL黄曲霉毒素Ml标准品及0. 05ng/mL黄 曲霉毒素B1标准品；（2)磷酸二氢钠缓冲液的pH值分别为表3所记载的数值。
[0111] 由于免疫亲和柱是中性，样品的过酸性会导致pH低，影响免疫亲和柱亲和能力， 进而影响样品的回收率。由于黄曲霉毒素遇碱会分解，因此较高的pH值会破坏黄曲霉毒 素，同时也影响免疫亲和柱的亲和能力，进而影响样品的回收率。当缓冲液pH值在7. 4~ 8. 5时，检测效果最好。
[0112] 表3不同磷酸二氢钠缓冲液的pH值对黄曲霉毒素B1和Ml含量及其回收率的影 响
[0115] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技 术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结 合和组合。
[0116] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例 性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述 实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1. 一种检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的方法，其特征在于，包括： (1) 称取调制乳样品l〇g于50mL离心管中，加入25毫升提取液（乙腈和甲醇按体积比 8:2)，得到混合液，将所述混合液高速振荡2min，并将得到的液体在5000转/分钟下离心5 分钟，收集上清液； (2) 将所述上清液在45-48摄氏度下旋转蒸发到体积5升，再用磷酸二氢钠缓冲液（pH 值为7. 4~8. 5)定容到50毫升并混匀，得到待净化溶液，然后将所述待净化溶液以2mL/ min~3mL/min的流速通过黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，弃流出液，然后用10毫升水以 2mL/min~3mL/min的速度淋洗黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，弃流出液，再用6毫升乙腈以 2mL/min~3mL/min的速度洗脱黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，得到洗脱液； (3) 将所述洗脱液在氮吹仪下吹干，用乙腈-水溶液（乙腈和水的体积比1:9)定容到 lmL，涡旋混匀，过0. 22μm的有机滤膜，用液相色谱-质谱测定，其中 (3-1)质谱条件： 电离方式为电喷雾电离，正离子； 毛细管电压为3. 5kV; 锥孔电压为40V; 离子源温度为120°C; 锥孔反吹气流量为50L/h; 脱溶剂气温度为350°C; 脱溶剂气流量为500L/h; 电子倍增电压为650V; 扫描方式为多离子反应监测； 针对黄曲霉毒素M1，离子选择参数包括：母离子312. 9,子离子240. 7和284. 6,碰撞能 量是38和22,驻留时间是0. 05min; 针对黄曲霉毒素B1，离子选择参数包括：母离子329. 1，子离子259和273,碰撞能量是 25和25,驻留时间是0.lmin; (3-2)液相色谱条件： 流动相流动速度：〇. 3mL/min; 色谱柱柱温：40°C; 试液温度：20°C; 进样体积：1〇yL; 流动相：A相，0. 1 %甲酸溶液；B相，乙腈溶液。2. -种检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的预处理方法，其特征在于，包括： (1) 将所述发酵乳与提取液进行混合， 其中，所述提取液包括乙腈和甲醇，所述乙腈体积不小于甲醇体积； (2) 将步骤（1)所得到的混合物进行离心处理，并收集上清液； (3) 将所述上清液进行浓缩处理，并利用缓冲液将所述浓缩处理的产物进行定容，以便 得到待净化溶液； (4) 利用免疫亲和柱对所述待净化溶液进行净化处理，得到洗脱液；以及 (5) 将所述洗脱液进行浓缩处理，并用乙腈-水溶液进行定容，以便得到待测液。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于， 所述乙腈和甲醇的体积比为8:2， 基于1克所述发酵乳，所述提取液的添加量为2~3毫升。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的pH值为7. 4~8. 5。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述净化处理包括： 将所述待净化溶液通过免疫亲和柱，弃流出液，然后用水淋洗免疫亲和柱，弃流出液， 再用乙腈洗脱免疫亲和柱，得到洗脱液。6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述乙腈水溶液中，乙腈和水的体积比 为 1:9〇7. -种检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml含量的方法，其特征在于，包括： (1) 利用权利要求2~6任一项所述的预处理方法对所述发酵乳进行预处理；以及 (2) 采用液相色谱-质谱联用法对步骤（1)所得到的混合物进行检测，并基于检测结果 确定所述发酵乳中黄曲霉毒素B1和Ml的含量。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述质谱的检测条件包括： 电离方式为电喷雾电离，正离子； 毛细管电压为3. 5kV; 锥孔电压为40V; 离子源温度为120°C; 锥孔反吹气流量为50L/h; 脱溶剂气温度为350°C; 脱溶剂气流量为500L/h; 电子倍增电压为650V; 扫描方式为多离子反应监测； 针对黄曲霉毒素M1，离子选择参数包括：母离子312. 9,子离子240. 7和284. 6,碰撞能 量是38和22,驻留时间是0. 05min; 针对黄曲霉毒素B1，离子选择参数包括：母离子329. 1，子离子259和273,碰撞能量是 25和25,驻留时间是0.lmin。9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述液相色谱的检测条件包括： 流动相流动速度：〇. 3mL/min; 色谱柱柱温：40°C; 试液温度：20°C; 进样体积：1〇yL; 流动相：A相，0. 1 %甲酸溶液；B相，乙腈溶液。
【专利摘要】本发明提出检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和M1含量的预处理方法及检测发酵乳中黄曲霉毒素B1和M1含量的方法。所述预处理方法包括：(1)将所述发酵乳与提取液进行混合；(2)将步骤(1)所得到的混合物进行离心处理，并收集上清液；(3)将所述上清液进行浓缩处理，并利用缓冲液将所述浓缩处理的产物进行定容，以便得到待净化溶液；(4)利用免疫亲和柱对所述待净化溶液进行净化处理，得到洗脱液；以及(5)将所述洗脱液进行浓缩处理，并用乙腈水溶液进行定容，以便得到待测液。本发明的方法具有下列优点的至少之一：操作简便、快速、回收率高和灵敏度高。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/02
【公开号】CN105353054
【申请号】CN201510978126
【发明人】李照, 张雪峰, 崔向云, 徐向峰, 袁凤琴, 常建军, 宋晓东
【申请人】内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月22日