将活化时间到的样品进行10000r/min离心，时间5min，然后再加入0.01M的PBS进行洗涤离心，重复3次。将尚心完的样品各加入适量的抗大?总蛋白抗体，在混勾仪上偶联lh。偶联完成后加入的10%BSA封闭液45min。封闭结束后，转速8000r/min离心分离5min，用0.01M的PBS清洗离心，重复3次，则将多余的抗体、BSA洗去，最后加入PBS进行重悬。制备的抗性修饰的CoFe204纳米粒子即为免疫探针，保存在4 °C待用。
[0024]2、单克隆抗体固定:可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5X5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2-4 nm)用以帮助固定金。再用在表面派射喷上一层纳米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥?自酰亚胺-丙酸酯(DSP)对纳米金进行修饰(DMS0，二甲基亚砜稀释DSP)。加入抗大豆蛋白单抗，即将100 μ? 100 μδ/mL单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37 °C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，1小时，将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。
[0025]3、将食品样品进行预处理，得到待检样品。待检样品加到第2步制得的固定了特异性单抗的酶标板上孵育20mins，若样品中存在过敏原，则会与酶标板上的单抗结合，通过洗涤，则过敏原被固定在酶标板上。
[0026]4、将第1步所制的抗体修饰的CoFe204纳米探针加入第3步所得到的酶标板上，此时，如果酶标板上有目标过敏原，通过免疫探针的特异性反应，则探针会与酶标板上的过敏原发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合过敏原的探针洗去。在酶标板上剩下的就只有结合了过敏原的探针。
[0027]5、加入定量的洗脱液(30%甲醇)将第4步的酶标板上的结合了过敏原的探针洗脱下来。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20，纽迈公司)测定溶液的自旋-晶格弛豫时间。以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有探针存在，从而说明样品中有过敏原，探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明探针越多，从而间接说明过敏原越多，通过加标验证定量检测样品中过敏原的数目。
[0028]实施例2。
[0029]测定食品样品是否含有特定过敏原一一啤酒泡沫活性蛋白Z4过敏原检测。
[0030]l、CoFe204纳米粒子制备:CoFe 204纳米粒子可以从市场购买，也可以参考文献用化学方法合成。CoFe204纳米粒子羧基修饰:将得到的CoFe 204与PEG-1500按质量比1:10在无水乙醇的溶解下，加入反应釜中，密封完毕后放入烘箱中，将温度调至90°C，反应12小时；当反应釜降至室温时，一般是在关闭烘箱后的3-4h即可。打开反应釜，将上清液倒去，用无水乙醇洗涤并搅拌；洗涤完一次就进行一次离心，直到上清液澄清为止。转速8000r/min，时间3min ;将洗涤好的最终产品放在烘箱中自然晾干，得到PEG修饰的CoFe204纳米粒子。
[0031]抗体修饰:称取一定量的羧基修饰的CoFe204纳米粒子，加入2倍质量的EDC和NHS，加入0.01M的PBS各lmL。放在混匀仪上，转速15转，反应45min。)将活化时间到的样品进行10000r/min离心，时间5min，然后再加入0.01M的PBS进行洗涤离心，重复3次。将离心完的样品各加入过量啤酒泡沫活性蛋白Z4抗体，在混匀仪上偶联lh。偶联完成后加入的10%BSA封闭液45min。封闭结束后，转速8000r/min离心分离5min，用0.01M的PBS清洗离心，重复3次，则将多余的抗体、BSA洗去，最后加入PBS进行重悬。制备的抗性修饰的CoFe204纳米粒子即为免疫探针，保存在4 °C待用。
[0032]2、单克隆抗体固定:可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5X5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2-4 nm)用以帮助固定金。再用在表面派射喷上一层纳米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥?自酰亚胺-丙酸酯(DSP)对纳米金进行修饰(DMS0，二甲基亚砜稀释DSP)。加入啤酒泡沫活性蛋白Z4单克隆单抗，即将100 μ? 100 Pg/mL啤酒泡沫活性蛋白Ζ4单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37°C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，1小时，将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。
[0033]3、将食品样品进行预处理，得到待检样品。待检样品加到第2步制得的固定了啤酒泡沫活性蛋白Z4特异性单抗的酶标板上孵育20mins，若样品中存在过敏原，则会与酶标板上的单抗结合，通过洗涤，则过敏原被固定在酶标板上。
[0034]4、将第1步所制的抗体修饰的CoFe204纳米探针加入第3步所得到的酶标板上，此时，如果酶标板上有目标啤酒泡沫活性蛋白Z4过敏原，通过免疫探针的特异性反应，则探针会与酶标板上的过敏原发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合啤酒泡沫活性蛋白Z4的探针洗去。在酶标板上剩下的就只有结合了啤酒泡沫活性蛋白Z4的探针。
[0035]加入定量的洗脱液(30%甲醇)将酶标板上的结合了啤酒泡沫活性蛋白Z4的探针洗脱下来。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20，纽迈公司)测定溶液的自旋-晶格弛豫时间。以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有探针存在，从而说明样品中有啤酒泡沫活性蛋白Z4过敏原，探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明探针越多，从而间接说明啤酒泡沫活性蛋白Z4过敏原越多，通过加标验证可以定量检测样品中过敏原的量。
【主权项】
1.一种基于CoFe 204纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法，其特征是步骤如下: (1)检测过敏原的CoFe204纳米探针的制备； (2)将过敏原特异性单抗在酶标板上的固定备用，并将多余的活性位点用牛血清蛋白封闭；(3)将待检样品加到第(2)步所制得的酶标板上，孵育一段时间，若待检样品中含有过敏原，则会与酶标板上的单抗结合，用无菌的去离子水清洗后，过敏原被固定在酶标板上； (4)将第(1)步制得的CoFe204纳米探针悬池液加到第(3)步固定了过敏原的酶标板上，若存在过敏原则形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗，则没有结合的探针就被洗掉，若不存在过敏原，则所有探针都被洗掉； (5)用洗脱剂将酶标板上的双抗夹心的探针洗下来，如果还存在探针就是抓到过敏原的探针； (6)第(5)步所得的探针的悬浊液，进行核磁共振的弛豫时间测定；以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，测得的悬浊液的弛豫时间自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间相比无菌的去离子水有显著降低，则说明含有探针，从而间接证明样品中有过敏原；探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降呈正比，通过加标定量探针而间接定量出过敏原的量。2.根据权利要求1所述的基于CoFe204纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法，其特征是所述探针为纳米级CoFe204材料，其纳米粒径小于500纳米。3.根据权利要求1所述的基于CoFe204纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法，其特征是所述核磁共振弛豫时间是自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间。
【专利摘要】一种基于CoFe2O4纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法，属于食品安全过敏原快速检测技术领域。本发明依赖于建立的可以用于食品样品中过敏原的核磁共振检测方法，利用CoFe2O4纳米探针的顺磁特性对核磁共振弛豫时间的影响，检测出样品中是否含有过敏原。不同的具体的对应关系为：纳米CoFe2O4纳米探针，在一定条件下显示出线性关系，即CoFe2O4纳米探针含量大，样品的自旋-晶格弛豫时间值越小，在一定范围能够定量检测过敏原。该方法可以用于食品样品中特定过敏原的快速检测，从而可以作为大批待检样品的快速筛选。
【IPC分类】G01N33/577, G01N24/08
【公开号】CN105372278
【申请号】CN201510839527
【发明人】张锦胜, 万益琴, 彭红, 刘玉环, 王允圃, 巫小丹, 阮榕生
【申请人】南昌大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年11月27日