一种固相萃取剂富集人血浆中前白蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物蛋白分析检测技术领域，特别涉及一种固相萃取剂富集人血浆中 前白蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 石墨烯(Graphene)，一种由单层碳原子致密堆积成的二维蜂窝晶格结构，最近引 发了大量的研究兴趣。它独特结合了电化学性能和量子效应，具有优异的热学性能和机械 性能。值得注意的是，石墨烯是一个双面多环芳烃，超高的比表面积使其具有成为高吸附材 料的潜能。而皱褶石墨烯球仍然具有η共辄结构，因此仍然与多环芳烃具有较强的亲和力， 重要的是，皱褶的球状石墨烯与片层石墨烯相比，具有抗压抗团聚的性能，因此，皱褶的球 状石墨烯与片层石墨烯相比，更适合作为SPE填料，具有更好的萃取性能。
[0003] 前白蛋白0^&113111^11，？六），分子量为5.4万，由肝细胞合成，在电泳分离时，常显 示在白蛋白的前方，故称为前白蛋白。肝脏疾病时前白蛋白更敏感，有30%白蛋白正常的肝 病患者的前白蛋白减少，坏死后肝硬化几乎是零。肝硬化肝细胞坏死较轻，前白蛋白变化不 大，当病情改善时，前白蛋白亦迅速升高。因此，测定前白蛋白在血浆中的浓度对于了解蛋 白质的营养不良、肝功能不全、比之白蛋白和转铁蛋白具有更高的敏感性。传统的蛋白质提 纯方法主要包括电泳、离子交换层析分离、亲和层析和有机溶剂沉淀法，这些方法要么成本 很高，要么过程复杂且灵敏度低，难以达到满意效果。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种固相萃取剂富集人血浆中前白蛋白的方 法，该方法基于石墨烯球作为SPE填料，并结合超高效液相色谱，耗时较少，能够方便、快捷、 高剂量的从反应体系中吸附分离出前白蛋白；本发明所使用的原材料廉价易得，所制得的 石墨烯微球具有抗压性、抗团聚性，有较大比表面积和丰富的活性基团，具有后续相关实验 分析的潜力。
[0005] 本发明的一种固相萃取剂富集人血浆中前白蛋白的方法，包括：
[0006] (1)将氧化石墨烯分散液超声雾化，在N2驱动下通过400 °C~450 °C的石英管，收 集，干燥，得到石墨稀微球固相萃取剂;其中，石墨稀微球的粒径为lwn~3μηι;
[0007] (2)将固体氯化钠加入到含有前白蛋白的纯血浆中，然后加入苯酚溶液，搅拌，静 置，离心，得上清液;其中，加入氯化钠后血浆中氯化钠的质量分数为20%~30% ;
[0008] (3)将步骤（1)中的石墨烯微球加入到固相萃取柱，然后活化固相萃取柱，然后将 步骤(2)中的上清液进行稀释后通过固相萃取柱，经过淋洗，真空栗抽至进干，洗脱，氮吹浓 缩，进入HPLC分析检测。
[0009] 所述步骤（1)中氧化石墨烯分散液的制备方法:将超纯水加入到氧化石墨中，搅 拌，超声，即得;氧化石墨稀分散液的浓度为4wt%~6wt%。
[0010] 所述步骤(1)中超声雾化过程中超声波频率为1.5MHz~2.0MHz。
[0011] 所述步骤（1)中收集为末端滤膜收集;滤膜为PTFE膜，其中，孔径为0.22μπι~0.45μ m〇
[0012] 所述步骤(1)中干燥为:室温下干燥4h，然后放入真空干燥器中70 °C干燥24h。
[0013] 所述步骤(2)中苯酚溶液的体积与氯化钠加入到血浆后得到的溶液的体积比为1: 1;苯酚溶液的体积分数为5.0%-6.0%。
[0014] 所述步骤(2)中离心转速为8000rpm-10000rpm，离心时间为10min_15min;静置为4 。(:静置 20h-25h。
[0015] 所述步骤(3)中活化固相萃取柱为：用体积百分比为40%-60%的甲醇溶液对柱体 进行活化处理，控制流速为〇. 8ml/min;固相萃取柱体积为3ml。
[0016] 所述步骤(3)中淋洗为甲醇淋洗液；甲醇淋洗液的体积百分比为5%~10%，洗脱 液体积3ml_5ml，洗脱流速为0. lml/min~0.3ml/min;氮吹时间5min~lOmin，氮吹温度50°C ~55。。。
[0017] 所述步骤(3)中HPLC的柱温30°C_35°C，流速1.0ml/min-1.5ml/min，有机相梯度变 化0min-20min: 5 % -30 %，20min-22min: 30 % -5 %，22min-30min: 5 % -5 %，进样量 15μ1-20μ 1，检测波长为280nm;选择Agilent C18色谱柱，有机相为含0.08%-0.1%三氟乙酸的乙腈 作，水相为含〇. 1 %-〇. 15 %三氟乙酸的超纯水，滤膜孔径0.2μηι-0.4μηι，流动相超声时间 20min-30min〇
[0018] 本发明提供了一种固相萃取剂富集人血浆中前白蛋白的方法，利用石墨烯微球本 发明制得的石墨烯微球抗压，抗团聚，拥有较大比表面积和丰富的活性基团，能够方便、快 捷、高剂量的从反应体系中吸附分离出前白蛋白；并利用固相萃取易于结合高效液相色谱 联用，建立了一种分析浓缩富集前白蛋白的方法，为前白蛋白的快速提取提供了可能。为达 到最佳萃取效果，本发明考察了柱长、上样速度、样品溶液的离子强度和pH值、洗脱剂用量 和时间等因素对萃取效率的影响，优选出最佳固相萃取条件，然后，对在最佳固相萃取条件 下得到的浓缩液，进行高效液相色谱分析，建立SPE-HPLC浓缩富集、检测血浆中前白蛋白的 方法，满足实际要求。
[0019] 有益效果
[0020] (1)本发明的石墨烯微球粒径可控，具有抗压，抗团聚，拥有较大比表面积和丰富 的活性基团，能够方便、快捷、高剂量的从反应体系中吸附分离出前白蛋白；
[0021] (2)本发明基于石墨烯球作为SPE填料并结合超高效液相色谱，建立一种适用于血 浆中前白蛋白高效快速的浓缩富集、检测方法，优于其它蛋白提纯方法，满足实际需求； [0022] (3)本发明所建立的SPE-HPLC串联检测系统，操作简单，成本较低，吸附率高于其 它吸附剂，显著提高仪器的检测限。
【附图说明】
[0023] 图1为实施例1中石墨烯微球固相萃取剂的SEM图；
[0024] 图2为本发明中石墨烯微球作固相萃取剂萃取流程图；
[0025] 图3为实施例3中应用固相萃取-高效液相色谱联用浓缩富集、测定血浆中前白蛋 白色谱图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
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