红细胞、B型磁化红细胞、0型磁化红细胞50ul;
[0215] (4)混匀，室温反应lmin;
[0216] (5)磁铁吸附，振荡试管并判定结果，若磁化红细胞发生凝集，则为阳性反应;反 之，若磁化红细胞不发生凝集，则为阴性反应。反应格局判定标准如下：
[0217]
[0218] 2.红细胞不规则抗体检测
[0219] 用已知血型的覆盖我国临床有意义红细胞抗原的多人份0型红细胞按上述具体实 施方式制备成磁化红细胞，以替代新鲜红细胞进行红细胞不规则抗体检测。
[0220] 检测步骤如下：
[0221] (1)取洁净试管，做好标记；
[0222] (2)加入待检样本(血清或血浆)50ul;
[0223] (3)加入上述磁化红细胞50ul;
[0224] (4)混匀，室温反应lmin;
[0225] (5)磁铁吸附，振荡试管并判定结果，若磁化红细胞发生凝集（阳性反应），表明待 检样本中含有与该红细胞抗原相对应的抗体，反之，若磁化红细胞不发生凝集(阴性反应）， 表明待检样本中不含与红细胞抗原对应的抗体。
[0226] 3.交叉配血
[0227] 用鲜血员红细胞按上述【具体实施方式】制备成磁化红细胞，以替代新鲜红细胞进行 交叉配血。
[0228] 检测步骤如下：
[0229] (1)取洁净试管，做好标记；
[0230] (2)加入受血者(血清或血浆)50ul;
[0231] (3)加入鲜血员磁化红细胞50ul;
[0232] (4)混匀，室温反应lmin;
[0233] (5)磁铁吸附，振荡试管并判定结果，若磁化红细胞发生凝集（阳性反应），表明待 检样本中含有与该红细胞抗原相对应的抗体，配型不合;反之，若磁化红细胞不发生凝集 (阴性反应），表明待检样本中不含与红细胞抗原对应的抗体配型相合。
[0234] 试验例2细菌磁颗粒负载抗红细胞糖蛋白GPA单克隆抗体效果试验
[0235] 选择不同的偶联剂，其余的方法按照实施例13的方法制备超顺磁性功能颗粒，细 菌磁颗粒对抗红细胞糖蛋白GPA单克隆抗体的负载效果见表1;
[0236] 表1不同偶联剂对负载效果的影响r>[0237]
[0238] 选择不同的孵育剂，其余的方法按照实施例14的方法制备超顺磁性功能颗粒，细 菌磁颗粒对抗红细胞糖蛋白GPA单克隆抗体的负载效果见表2;
[0239] 表2不同孵育剂对负载效果的影响
[0240]
[0241] 从表1中可看出，通过选择4中不同的偶联剂进行偶联，抗红细胞糖蛋白GPA单克隆 抗体的负载量可达到783yg/mg，当采用2或3种偶联剂进行混合，或者采用本发明之外的偶 联剂进行偶联，细菌磁颗粒负载的抗红细胞糖蛋白GPA单克隆抗体的量均显著降低;从表2 中可以看出，当选择不同壳聚糖和海藻酸钠混合孵育剂时，可提高细菌磁颗粒对抗红细胞 糖蛋白GPA单克隆抗体的负载量。
[0242] 选择不同的处理条件，偶联剂选自质量比为1:1.2:1:2.5的EDC、NHS、琼脂和无水 硫酸钙的混合物，孵育剂选自质量比为2:7.2的壳聚糖和海藻酸钠的混合物，其余的步骤按 照实施例14的方法制备超顺磁性功能颗粒，细菌磁颗粒对抗红细胞糖蛋白GPA单克隆抗体 的负载效果见表3;
[0243] 表3不同处理步骤对负载效果的影响
[0244]
[0245] 从表3中可知，细菌磁颗粒的处理步骤对细菌磁颗粒对抗红细胞糖蛋白GPA单克隆 抗体的负载效果具有很大的影响。
[0246] 试验例3趋磁细菌MSR-1菌株扩大培养情况
[0247] 1)分组
[0248] 试验1组:本发明实施例20所述的制备方法；
[0249] 对照1组:对照例1的制备方法；
[0250]对照2组:对照例2的制备方法；
[0251]对照3组:CN1952112公开的一种兼性厌氧趋磁细菌及其分离、纯培养方法和细菌 磁颗粒的提取、纯化方法中公开的培养方法；
[0252] 2)采用台盼蓝经典染色法对细胞进行计数，接种时细胞为IX 104个/ml，分别统计 原代细胞和扩大培养后的数量，结果见表4。
[0253]表4各组趋磁细菌MSR-1菌株体外培养扩增试验结果
[0254]
[0255] 由表中可以看出，本发明提供的趋磁细菌培养方法可以有效的体外培养趋磁细菌 MSR_1菌株。
[0256] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发 明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领 域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种超顺磁性功能颗粒，其特征在于，所述颗粒是由表面基团通过偶联剂活化后的 细菌磁颗粒和抗红细胞糖蛋白GPA单克隆抗体孵育而成。2. 如权利要求1所述的超顺磁性功能颗粒，其特征在于，所述偶联剂为质量比为1:1-1.2的EDC和NHS的混合物。3. 如权利要求1所述的超顺磁性功能颗粒，其特征在于，所述孵育中加入重量份数比为 2:5.5-7.2的壳聚糖和海藻酸钠的混合物作为孵育剂。4. 一种磁化红细胞，其特征在于，所述磁化红细胞是由权利要求1-3任意所述的超顺磁 性功能颗粒与红细胞孵育而成。5. 权利要求4所述的磁化红细胞在临床ABO血型抗体检测、血型不规则抗体检测筛查、 交叉配血或吸收放散实验中的应用。6. -种权利要求1所述的超顺磁性功能颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包 括如下步骤： a. 活化:加入偶联剂对细菌磁颗粒进行活化，制得活化后的细菌磁颗粒； b. 孵育:将活化后的细菌磁颗粒与抗红细胞糖蛋白GPA单克隆抗体，室温孵育； c. 分离:磁铁吸附，洗涤，即得超顺磁性功能颗粒； 优选地，所述细菌磁颗粒先经过处理步骤再进行活化； 优选地，所述细菌磁颗粒的处理步骤具体方法如下： (1) 取细菌磁颗粒，加入处理剂搅拌条件下反应，反应完成后将产物洗涤至中性;所述 处理剂为体积比是40-60:1-3:0.3-1的无水乙醇、氨水和正硅酸乙酯的混合液； (2) 将步骤（1)反应后得到的细菌磁颗粒配成浓度为0.1%~0.3%的溶液，调节溶液pH 值至3.0-5.0，向上述溶液中加入浓度为5-15%的3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中，搅拌 条件下反应，反应完成后将产物洗涤至中性，制得经过处理的细菌磁颗粒； 优选地，所述活化步骤具体方法如下： (a)取经过处理的细菌磁颗粒，加入偶联剂，搅拌反应，过滤，制得活化后的细菌磁颗 粒，所述偶联剂为质量比为1:1-1.2的EDC和NHS的混合物； 优选地，孵育的条件为：140-160rpm涡旋振荡，室温，反应过夜； 优选地，步骤b的孵育过程还加入孵育剂，所述孵育剂为重量份数比为2: 5.5-7.2的壳 聚糖和海藻酸钠的混合物。7. 如权利要求6所述的超顺磁性功能颗粒的制备方法，其特征在于，所述细菌磁颗粒的 制备方法包括如下步骤： 1) 将趋磁细菌MSR-1菌株进行扩大培养； 2) 离心并收集趋磁细菌MSR-1菌株，用Tris-HCl缓冲液悬浮，得悬浮液； 3) 超声波破碎悬浮液中的细胞； 4) 磁铁吸附破碎后的细胞，静置过夜，弃去上清，用磷酸盐缓冲液重新悬浮吸附到的沉 淀，超声波清洗，磁铁再次吸附，弃上清，将吸附到的沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮，洗涤3次，即 得细菌磁颗粒； 优选地， 离心条件为:转速8000-10000rpm，离心时间5-lOmin; 超声波破碎条件为：超声功率250-350?，超声时间2-7s，间隔时间2-7s，超声次数80- 100次，重复3次； 超声波清洗条件为:超声功率70-90w，超声时间2-7s，间隔时间2-7s，超声次数40-60 次。8. 如权利要求6所述的超顺磁性功能颗粒的制备方法，其特征在于，所述抗红细胞糖蛋 白GPA单克隆抗体的制备方法包括如下步骤： I用红细胞糖蛋白GPA免疫小鼠； Π 取免疫后的小鼠，通过融合剂与杂交瘤细胞进行融合，将融合后的细胞悬浮于选择 培养基中，进行培养； m抗红细胞糖蛋白GPA单克隆抗体筛选； IV抗红细胞糖蛋白GPA单克隆抗体的制备及纯化。9. 如权利要求8所述的超顺磁性功能颗粒的制备方法，其特征在于，所述融合剂为质量 比为5.6:1.2的聚乙二醇4000和聚乙二醇1500的混合物;所述选择培养基由DMEM培养液和 悬浮溶质组成，所述悬浮溶质及其在DMEM培养液中的浓度为15-25μg/ml牛血清、15-20ng/ ηι?β-胡萝卜素、l_3ng/ml丙酮酸钠、5-10ng/ml维生素 E、5_10ng/ml多聚谷氨酸、2_5μg/ml壳 聚糖和25-30ng/ml碱性成纤维细胞。10. 如权利要求7所述的超顺磁性功能颗粒的制备方法，其特征在于，所述趋磁细菌 MSR-1菌株扩大培养包括如下步骤： a. 在培养罐内加入第一培养基，105-110 °C灭菌lOmin，静置lh后，将趋磁细菌MSR-1菌 株接种到培养罐中，进行第一次培养，获得第一培养液;第一次培养的条件为:起始pH值为 5.5-6，培养温度为28-30 °C，培养时间为3-5天，摇床转速为250-300转/分钟，培养过程中通 入氧气，通入氧气的方式为：间隔20min，通入50min氧气； b. 将第一培养液加入含有第二培养基的培养罐中，无氧状态进行第二次培养;第二次 培养的条件为:起始pH值为6.5-7.0，培养温度为20-25 °C，培养时间为2-3天，摇床转速为 100-200转/分钟； 优选地， 所述第一培养基由重量份数为5-10份的谷氨酰胺、1-3份麦芽糖醇、2-5份、0.5-1份泛 酸钙、0.5-1份酪蛋白酸钠、0.2-0.5份磷酸二氢钾、0.5-1份月桂酸肌氨酸和1-2份氯化钠组 成； 所述第二培养基由重量份数为2-3份蛋白胨、2-5份生物素、1-2份甘氨酸、0.5-1份酒石 酸钠、1-2份硝酸铵、1-2份磷酯酰丝氨酸和0.2-0.5份月桂醇硫酸酯钠的组成。
【专利摘要】本发明提供一种超顺磁性功能颗粒及磁化红细胞，细菌磁颗粒表面天然带有丰富的-NH2基团，通过一定的化学方法修饰使其活化并与抗红细胞糖蛋白GP A单克隆抗体偶联连接，制备成超顺磁性功能颗粒；在临床血型抗体检测前，将其与红细胞孵育并使其快速磁化，然后进行样本检测，检测过程中，磁力分离取代离心力分离，可为临床提供一种快速、简便的试验方法，并且提供的超顺磁性功能颗粒特别有利于红细胞快速磁化及临床血型抗体检测过程中固相-液相分离。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/80
【公开号】CN105699666
【申请号】CN201610052879
【发明人】张金菊, 王红光
【申请人】北京中科圆融生物科技发展有限公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年1月26日...