专利名称：一种水溶性o－壳聚糖衍生物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水溶性O-壳聚糖衍生物及其应用。属于壳聚糖衍生物的应用技术。
背景技术：
壳聚糖，这种自然界中迄今发现的唯一碱性多糖，已被证明对于脂肪具有明显的吸附作用，并开始被应用于最新的减肥药物中。在日本壳聚糖减肥药品发展迅猛，已有成为减肥药主流的趋势。日本厚生省1985年拨款60亿日元给一些医科大学，作为甲壳素基础研究和应用开发的费用。日本的几丁聚糖保健品“救多善”，1996年进入中国市场，一年就从中国拿回10亿人民币，折合143亿日元，是厚生省当年拨款的2.3倍。1999年，《健康产业新闻》对全日本70家食品店铺和药品店铺调查了主要畅销的减肥食品材料，在药店系统中位居第一的就是壳聚糖减肥药。
但是壳聚糖作为聚阳离子化合物，一般不能与中性油发生吸附反应，对脂肪物质在胃中会分解的胆固醇、甾醇、甘油三酸酯等中性油吸附能力不强；而且由于壳聚糖与脂肪不能互溶，极大的限制了壳聚糖与脂肪及脂肪酸的相互作用；再者由于壳聚糖在肠道环境中为不溶解状态，降低了对脂肪酸的吸附效率；最后单纯使用壳聚糖会引起便秘等副作用。因此人们开始通过对壳聚糖进行改性，提高其溶解性，使用其衍生物来提高吸附油脂的效率，考察其可能潜在的分子水平的减肥机理。本发明专利涉及的一种水溶性壳聚糖衍生物作为减肥药物的方法尚未见任何报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水溶性O-壳聚糖衍生物及其应用，该壳聚糖衍生物易于制取，用于大鼠减肥具有明显效果。
本发明是通过下述技术方案加以实现的所述的水溶性O-壳聚糖衍生物是以壳聚糖为原材料，合成出的壳聚糖环碳6位-OH上取代的衍生物，包括O-羧甲基壳聚糖和O-羟乙基壳聚糖，其结构特征是 其中R＝-CH2COOH，或-CH2OH
该壳聚糖衍生物粘均分子量是5万-100万，脱乙酰化度大于80％，碳6位O取代度为0.5-0.9，热分解温度为220～250℃，溶解度≥10g/100ml水。
上述水溶性O-壳聚糖衍生物的应用，其特征在于将该水溶性O-壳聚糖衍生物添加到饲料中喂养大鼠，对大鼠的肥胖具有明显治疗和预防作用1.将这种水溶性O-壳聚糖衍生物，添加到动物基础饲料(合成饲料)中，其添加质量百分比为2.5-7.5％，用来喂养营养性肥胖大鼠(在基础饲料的基础上增加全蛋粉、猪油、胆固醇、奶粉及白糖配制出高脂饲料，以此连续喂养6周形成营养性肥胖大鼠模型；将70只肥胖动物按照体重随机分为7组，每组10只。)。
实验结果表明自第四周开始治疗组(壳聚糖衍生物各剂量添加组)大鼠体重的下降趋势逐渐突出，至实验结束时治疗组大鼠体重明显降低，高剂量组大鼠分别比对照组下降18～35％，体脂含量下降40～80％，差异具有显著性(P＜0.01)；动物的肝/体比同时明显下降，各剂量组肝脏胆固醇和脂肪含量均明显低于喂饲基础饲料的对照组(P＜0.05)，肝脏胆固醇含量下将40～60％，肝脏脂肪含量下降30～40％；营养性肥胖大鼠粪便中脂肪含量明显增加，高剂量组大鼠粪脂含量与对照相比增加20～40％(P＜0.01)。
2.将这种水溶性O-壳聚糖衍生物，添加到高脂饲料中，添加质量百分比为5％，用来喂养清洁级SD雄性大鼠(体重60～70g，按体重将动物随机分为4组，每组10只)。
实验结果表明第3周时肥胖模型组大鼠体重明显高于正常对照组(P＜0.01)，从第5周开始预防组(壳聚糖衍生物添加组)大鼠体重均明显低于模型组(P＜0.01)，实验结束时体重增量比模型组低30～40％；肝胆固醇含量与高脂饲料组大鼠相比下降幅度超过50％，其水平与基础饲料组相当；壳聚糖衍生物具有降低血糖、升高血清胰岛素水平的作用，与高脂饲料组相比较，壳聚糖能够降低体内瘦素的水平；壳聚糖衍生物均能促进脂肪由粪便的排出，与高脂饲料组相比增加35～50％(P＜0.01)。
本发明制备的壳聚糖衍生物通过对壳聚糖进行改性，增强其在水中的溶解能力和对脂肪、胆固醇等的吸附能力；加之壳聚糖的刺激性、急性毒牲、亚急性毒性、慢性毒性和过敏性通过实验证明是合格的，使其更适宜作为健康、绿色、源于自然的减肥药物。而且，水溶性壳聚糖衍生物更容易和胆汁酸结合并全部排出体外，为了保持胆汁酸正常含量就必须在肝脏中将胆固醇转化胆汁酸，其结果是血液中的胆固醇含量必然下降，从而使其具有显著地减肥功能。本发明壳聚糖减肥产品与市场化的减肥药物相比，具有天然、无毒、减肥效果明显而又对人体无副作用等优点。本发明壳聚糖减肥产品可用于肥胖病症的治疗；还可以用于肥胖的预防。
具体实施例方式
实施例一、O-羟乙基壳聚糖的制备
1.壳聚糖的辐射降解分子量108万、脱乙酰化度85％的壳聚糖由Co60辐射源，经60kGy辐射剂量的照射，获得分子量10万～20万、脱乙酰化度86％的壳聚糖低聚物A。
2.O-羟乙基壳聚糖的制备①N-邻苯二甲酰壳聚糖的制备0.83g邻苯二甲酸溶液溶于含有6ml 5％(v/v)水的N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.3g壳聚糖，在氮气下搅拌并加热至120℃。反应8小时后，淡棕色混合物冷却至室温，然后倒入冰水。过滤后，将沉淀用150ml甲醇洗涤1小时，干燥得到0.444g淡棕色粉末物质B。
②O-羟乙基壳聚糖的制备称取5gB，加入25ml质量百分数为50％的NaOH溶液搅拌均匀，然后置于冰柜中在-18℃放置48小时。解冻后，挤压出多余的NaOH，然后加入10ml异丙醇，搅拌均匀后，缓慢加入50ml的氯乙醇，在80℃反应24h后，用乙醇洗涤，过滤，使用氢氧化钠水溶液和一水合肼(N2H4.H2O)脱除氨基保护，干燥得到白色固体粉末。
实施例二、O-羟乙基壳聚糖对肥胖大鼠的治疗作用1.饲料配制及营养性肥胖模型的建立选用合成饲料作为动物基础饲料，在基础饲料的基础上增加了全蛋粉、猪油、胆固醇、奶粉及白糖等来调整饲料中能量、但固醇及脂肪的含量，配制出了高脂饲料，连续喂养6周形成营养性肥胖大鼠模型。
2.动物分组及研究方法待模型构建成功之后，将70只肥拌动物按照体重随机分为7组，每组10只。各组喂饲的饲料如下①肥胖鼠对照组(C组)喂基础饲料；②O-羟乙基壳聚糖(HECS)减肥实验组(TA1-3)TA1组基础饲料+2.5％HECS，TA2基础饲料+5％HECS，TA3基础饲料+7.5％HECS；动物采用不锈钢鼠笼单笼饲养，自由饮水、统一食量，以便控制能量摄入。每周称一次体重，试验结束前一周用代谢笼收集实验动物72h的粪便，用于测定粪便中的脂肪含量。6周末隔夜禁食，解剖大鼠在相同部位切取部分肝脏用于检测肝脏脂肪及胆固醇含量；取肾周及睾周脂肪垫，称重用于计算体脂含量；将心、主动脉弓及部分肝叶置于中性福尔马林固定液中待做病理检查。
3.对营养性肥胖大鼠体重及体脂含量的降低作用本次试验正常对照组与肥胖模型组分别给予基础饲料和高脂饲料6周后，试验结果显示肥胖模型组的体重增量达到了正常对照组的1.96倍，证明肥胖大鼠模型的建立比较成功。
表1反映了各组间动物体重的动态变化，实验初始时各组间大鼠体重比较接近，自第四周开始治疗组大鼠体重的下降趋势逐渐突出，至实验结束时壳聚糖添加组大鼠体重比对照组低90.22g，差异具有显著性(P＜0.01)。
表1 Chitosan 对大鼠体重及体脂含量的影响(x±s)
分N 大鼠体重(g)体脂含量组W1 W4 W6 (％)C10 369.12±34.76 349.45±30.67366.95±24.82 1.0714±0.3520TA1 10 375.08±31.69 347.13±23.79343.07±22.07*0.7336±0.5103TA2 9 382.33±51.71 338.43±37.06323.88±26.47**0.4377±0.2171**TA3 10 371.66±30.37 307.69±27.01**276.73±31.74**0.2291±0.1184***与Control组相比P＜0.05，**与Control组相比P＜0.014.对营养性肥胖大鼠肝脏的影响HECS的加入使大鼠的肝/体比明显下降，肝脏胆固醇和脂肪含量也明显低于对照组(P＜0.05)，且随着HECS添加剂量增高，这种降低作用更为明显(表2)。
表2 大鼠肝/体比与肝脏脂肪含量情况(x±s)分组 N 肝/体比(％) 肝脏胆固醇含量(μg) 肝脏脂肪含量(％)C103.1191 ±0.2619 347.47±66.72 0.055±0.014TA1 102.8745±0.3276*289.60±48.93*0.039±0.003*TA2 9 2.7432±0.2301**236.82±32.83*0.044±0.006TA3 102.6364±0.1994**194.40±29.27**0.035±0.009**与Control组相比P＜0.05，**与Control组相比P＜0.015.对营养性肥胖大鼠粪便中脂肪含量的影响采用索氏提取的方法测定粪便中脂肪含量，结果显示HECS壳聚糖高剂量组大鼠粪脂含量与对照相比增加30～40％，P＜0.01，差异具有显著性。
实施例四、O-羟乙基壳聚糖对大鼠肥胖的预防作用1.动物分组及研究方法清洁级SD雄性大鼠40只，体重(60～70g)，按体重将动物随机分为4组，每组10只。正常对照组(C组)喂基础饲料，肥胖模型组(F组)喂高脂饲料，预防组(P组)喂高脂饲料+5％O-羟乙基壳聚糖。
动物单笼饲养，自由饮水，限制摄食，使每只大鼠平均摄食量相同，以便控制能量摄入。每周称一次体重，试验结束前一周用代谢笼收集实验动物的粪便，用于测定粪便中的脂肪含量。连续饲养6周后，解剖大鼠在相同部位切取部分肝脏用于检测肝脏脂肪及胆固醇含量；取肾周及睾周脂肪垫，称重用于计算体脂含量；将心、主动脉弓及部分肝叶置于中性福尔马林固定液中待做病理检查。
2.对大鼠体重、体脂含量的影响实验初始时各组间大鼠体重差异不具有显著性；至第3周时肥胖模型组大鼠体重明显高于正常对照组，差异具有显著性(P＜0.01)；从第5周开始可预防组大鼠体重明显低于模型组，差异具有显著性(P＜0.01)，至实验结束时这种差异更为显著(表3)。
表3 各组间大鼠体重的变化及体脂含量(x±s)
组 例体重(g) 体脂含量(％)别 数 W1 W3W5W6C 10 103.5±15.37 172.02±8.53d211.18±19.67d212.15±16.82d0.42±0.26dF 8 90.73±9.33193.44±15.84b311.20±23.96b349.11±32.44b0.95±0.21bP 10 104.53±15.33 207.37±13.43bc249.25±13.27bd267.74±14.03bd0.74±0.20ba与基础饲料组相比P＜0.05，b与基础饲料组相比P＜0.01c与高脂饲料组相比P＜0.05，d与高脂饲料组相比P＜0.013.对大鼠肝脏脂肪和胆固醇的影响高脂饲料组大鼠肝脏脂肪和胆固醇含量分别为(11.06±3.03)％、(136.20±33.87)g，显著高于仅喂饲基础饲料的对照组(3.11±1.44)％、(48.00±27.99)g。预防组大鼠肝脏脂肪及胆固醇含量分别为(5.94±1.26)％、(58.15±27.14)g，与高脂饲料组大鼠相比下降幅度超过50％，其水平与基础饲料组相当。
4.对大鼠粪脂水平的影响从外观看来，与基础饲料组比较，高脂饲料组和壳聚糖添加组大鼠粪便颜色发白，质地稀软。通过经典的索氏提取法测定各组大鼠粪便中总脂肪含量，发现HECS能促进脂肪由粪便的排出，与高脂饲料组相比分别增加30～40％，P＜0.01，差异具有显著性。
权利要求
1.一种水溶性O-壳聚糖衍生物，它是以壳聚糖为原材料，合成出的壳聚糖环碳6位-OH上取代的衍生物，包括O-羧甲基壳聚糖和O-羟乙基壳聚糖，其结构特征是该壳聚糖衍生物粘均分子量是5万-100万，脱乙酰化度大于80％，碳6位O取代 其中R＝-CH2COOH，或-CH2OH度为0.5-0.9，热分解温度为220～250℃，溶解度≥10g/100ml水。
2.一种按权利要求1所述的水溶性O-壳聚糖衍生物作为减肥药物的应用，其特征在于将该水溶性O-壳聚糖衍生物添加到饲料中喂养肥胖大鼠，对大鼠的肥胖具有明显治疗和预防作用；1)将这种水溶性O-壳聚糖衍生物，添加到动物基础饲料中，添加质量百分数为2.5-7.5％，用来喂养营养性肥胖大鼠实验6周后大鼠体重明显降低，高剂量组大鼠分别比对照组下降18～35％，体脂含量下降40～80％；动物的肝/体比同时明显下降，各剂量组肝脏胆固醇和脂肪含量均明显低于喂饲基础饲料的对照组，肝脏胆固醇含量下将40～60％，肝脏脂肪含量下降30～40％；营养性肥胖大鼠粪便中脂肪含量明显增加，高剂量组大鼠粪脂含量与对照相比增加20～40％；2)将这种水溶性O-壳聚糖衍生物，添加到高脂饲料中，添加质量百分数量为5％，用来喂养清洁级SD雄性大鼠实验6周后添加组大鼠体重增量比模型组低30～40％；肝胆固醇含量与高脂饲料组大鼠相比下降幅度超过50％，其水平与基础饲料组相当；壳聚糖衍生物均能促进脂肪由粪便的排出，与高脂饲料组相比增加35～50％。
全文摘要
本发明公开了一种水溶性O－壳聚糖衍生物及其应用，属于壳聚糖衍生物应用技术。所述的水溶性O－壳聚糖衍生物是以壳聚糖为原材料，合成出的壳聚糖环碳6位－OH上取代的衍生物，包括O－羧甲基壳聚糖和O－羟乙基壳聚糖。将这种水溶性O－壳聚糖衍生物，添加到动物饲料中，其添加质量百分数为2.5－7.5％喂养大鼠，对大鼠的肥胖具有明显的治疗和预防作用。本发明壳聚糖减肥产品具有天然、无毒、减肥效果明显而又对人体无副作用等优点，既可用于肥胖病症的治疗又可以用于肥胖的预防。
文档编号A23K1/16GK1594367SQ20041001996
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月12日 优先权日2004年7月12日
发明者刘晓非, 庄旭品, 管云林, 姚康德 申请人:天津大学