专利名称：农杆菌真空渗透法转化植物花粉的转基因方法
技术领域：
本发明涉及植物遗传育种，尤其涉及一种农杆菌真空渗透法转化植物花粉的转基因方法。
背景技术：
任何一种基因转化方法都应选择处于感受态的细胞作为受体，这样才使基因转化的效率有所提高。已有研究认为，正在萌发的花粉管顶部有一个无细胞壁的小孔，外源物质可以由此被吸收，具有感受态细胞的特点。因此，当成熟花粉萌发起始阶段与外源遗传物质DNA相混合时，外源DNA易被花粉粒吸收，从而成为被外源基因转化的雄配子。当转化后的雄配子与雌配子融合后，受精卵细胞通过分化和发育过程，形成转基因胚。
由于在植物花粉粒上有许多花粉管萌发孔，采用适当细胞渗透压的花粉萌发培养液，使刚起始萌发的花粉易被农杆菌感染。又由于多数花粉粒有很多密集的刺状突起，加Tween-20表面活性剂和抽真空处理，可突破培养液中的水分子在刺状突起间的表面张力，促进农杆菌与花粉萌发孔处花粉管接触，提高转化效率农杆菌介导的植物基因转化是目前在转化机理上比较清楚和在技术上较为成熟的方法。因此，利用农杆菌介导的以刚起始萌发的花粉为受体细胞的基因转化方法，可获得转化花粉，将其授粉于雌蕊柱头上，利用花粉自然受精过程，获得转化种子。依此技术路线，一方面可省略传统基因转化方法所要求的组织培养过程，另一方面具有单细胞特性的花粉作为转化的受体细胞可避免农杆菌感染多细胞组织时存在的转化与非转化细胞间的嵌合现象问题。而且该方法所具有的操作简捷，费用较低，以及直接得到转化种子等的优点，使以花粉作为转化受体细胞的应用前景十分诱人。
发明内容
本发明的目的是提供一种农杆菌真空渗透法转化植物花粉的转基因方法。方法的步骤如下1)、采用花粉人工萌发的方法，将采集的花粉在花粉萌发液体培养基中培养，以蔗糖作为调节花粉渗透压的调节剂，调节渗透压使花粉萌发；2)、将采集的花粉培养在含有农杆菌的花粉萌发培养液中，加Tween-20的表面活性剂，并抽真空；3)、将经农杆菌感染处理的花粉及培养液授于已去雄的雌蕊柱头上，套袋隔离防止其它花粉的污染，获得转化种子及其植株。
本发明用根癌农杆菌在花粉萌发培养基中感染植物花粉的方法，可获得具有活力的转化花粉，将其授于雌蕊柱头，完成受精，结出正常种子，再经抗性筛选、分子检测和基因表达验证，获得转基因植株。本方法的受体是具有单细胞特性的花粉，不存在多细胞(组织)受体在转化时出现的转化与非转化细胞间的嵌合现象，省略了传统基因转化方法所要求的组织培养过程，也避免了诸如花粉管通道法在转化机理上的认识问题，转化方法较简单和有效。
具体实施例方式
含有潮霉素抗性基因、GUS基因和外源目的基因的根癌农杆菌在花粉培养液中感染植物花粉，附加抽真空处理，获得的转化花粉授于雌蕊柱头上，通过受精自然结种子，转化体再经抗潮霉素筛选，以及GUS表达、PCR扩增、Sothern和Northern杂交检测和验证，最后获得含有外源目的基因的植株转基因方法。
农杆菌真空渗透法转化植物花粉的转基因方法的具体步骤如下1、根癌农杆菌的制备从新鲜平板上挑取带有双元质粒载体(含潮霉素抗性基因、GUS基因和外源目的基因)的农杆菌菌株的单菌落，接入含庆大霉素50mg/L和卡那霉素50mg/L的LB细菌培养基中，在恒温箱中震荡培养过夜(28℃、200r/min、约17～18h)，次日以1∶10的比例接入新鲜配制的LB液体培养基中继续培养5-6h，备用于转化。
2、花粉培养基的配制采用花粉萌发液体培养基，内含有0.1％H3BO3、0.3％Ca(NO3)2-4H2O、0.2％MgSO4-7H2O、0.1％KNO3和蔗糖，其中蔗糖作为调节花粉渗透压的调节剂，花粉萌发最适蔗糖浓度为45％-50％。
3、农杆菌感染花粉将培养好的农杆菌于3000rpm离心10min，收集菌体，重悬于上述所配制的花粉萌发培养液中，并加一滴表面活性剂(Tween-20，浓度约为1‰)；收集的新鲜花粉与农杆菌共培养，并抽真空(压力-80Pa，时间20min-30min)，然后授粉于前一天傍晚去雄套袋隔离的柱头上。
4、转化种子的获得植物柱头经上述花粉授粉后，花粉在柱头上萌发，花粉管在花柱中伸展，精卵细胞融合，子房膨大成果实，成熟后收获其中的转化种子。
5、转化体的筛选、检测和验证1)、用抗菌素筛选转化体转化种子经硫酸脱绒和升汞灭菌消毒后，置于含50mg/L潮霉素的MS固体培养基上萌发和生长，以非转化种子为对照，观察种子萌发和生长时的抗潮霉素情况，淘汰非抗性苗，保留抗性苗(阳性转化体)。为进一步淘汰假阳性苗，可再用500mg/L潮霉素溶液涂抹植物幼叶，5-8天后根据被涂抹幼叶的抗性反应，淘汰抗性差的苗，保留抗性强的苗。
2)、用组织化学反应检测转化体中GUS基因的表达经潮霉素抗性筛选后的转化体，取其组织，将它们置于Eppendorf管中，加2倍于组织体积的GUS染色液，抽真空，37℃保温过夜，染色后的组织于FAA脱色液中进行脱色至非转化体(对照)材料呈现白色为止，观察转化体组织GUS反应，或制成石蜡切片进行观察，阳性转化体组织细胞显示蓝色反应。
3)、用PCR扩增检测转化体中目的基因的整合用于PCR检测的转化体DNA用CTAB法提取；PCR扩增引物为外源目的基因的特异序列P1(上游)和P2(下游)，反应体系内含有2×GC buffer I 12.5μl，dNTP(浓度为2.5mmol)4μl，P1和P2(浓度为10mmol)各1μl，TaqaLA 0.2μl，模板DNA1μl，加ddH2O至25μl；反应程序为95℃预变性5min，94℃30s、55℃1min和72℃2min的30个循环，然后72℃10min延伸和4℃保存。以非转化体为对照，对转化体的PCR产物进行电泳分离，阳性转化体的PCR产物含有外源基因的DNA序列片段。
4)、用Southern杂交检测转化体中目的基因的整合从转化体中提取DNA，以非转化体为对照，经DNA限制性内切酶消化后，在琼脂糖凝胶中分离，分离后的DNA片段转印于尼龙膜上，以同位素标记的外源目的基因作为探针，与尼龙膜上的DNA杂交，经X光片放射自显影，阳性转化体因含有目的基因显示出杂交信号带。
5)、用Northern杂交检测转化体中目的基因的表达从外源目的基因表达的转化体细胞或组织中提取RNA，以非转化体为对照，RNA在甲醛变性琼脂糖凝胶中分离，分离后的RNA转印于尼龙膜上，以同位素标记的外源目的基因作为探针，与尼龙膜上的RNA杂交，经X光片放射自显影，阳性转化体因目的基因的表达显示出杂交信号带。
实施例下面结合棉花转基因育种的实例对本发明作详细说明1、转化所需的基本材料1)、植物棉花细胞质雄性不育的恢复系“G007”，纤维呈棕色。
2)、花粉取自棉花恢复系“G007”当天开花花朵的新鲜花药中的花粉粒。
3)、农杆菌菌株带有双元载体pCAMBIA1301的GV3101根癌农杆菌，该载体带有T-DNA左右臂，左右臂间含1个报告基因(GUS基因)、1个选择标记基因(潮霉素抗性基因，hpt)和2个外源目的基因[木质醋杆菌的纤维素合成酶(cellulose synthetase in Acetobacter xylinum)基因，acsA+acsB]序列；基因表达由CaMV35s启动子驱动，且GUS基因还含有内含子，只能在真核生物中表达。
4)、农杆菌培养基含庆大霉素50mg/L和卡那霉素50mg/L的LB细菌培养基。
5)、花粉萌发培养基含有0.1％H3BO3、0.3％Ca(NO3)2-4H2O、0.2％MgSO4-7H2O、0.1％KNO3和45％蔗糖的液体培养基。其中蔗糖作为花粉粒渗透压的调节剂，适当浓度蔗糖可使花粉粒处于完整和活性状态。
2、转化的方法1)、农杆菌感染花粉从固体平板上挑取农杆菌单菌落，在农杆菌液体培养基中培养，当菌液的OD600值为0.5-0.8时，离心(3000rpm，10min)收集菌体，重悬于的花粉萌发培养基中，加一滴表面活性剂(Tween-20，浓度约为1‰)；新鲜花粉与农杆菌共培养，并抽真空(压力-80Pa)，持续时间30min，获得转化的棉花花粉。
棉花花粉粒表面有很多密集的刺状突起，加Tween-20表面活性剂和抽真空处理，可突破培养液中的水分子在刺状突起间的表面张力，促进农杆菌与花粉萌发孔处花粉管接触，提高转化效率。
转化后的花粉是否具有生活力，用三种方法鉴定。其一，用联苯胺-甲萘酚染色法，凡被联苯胺-甲萘酚染色深且形态正常的花粉为有生活力的花粉，染色浅、无色或形态异常的花粉为弱生活力和无生活力的花粉；其二，用棉蓝-乳酸-酚染色法，花粉授于柱头后萌发，长出花粉管并向胚囊伸展，取这时的花柱经棉蓝-乳酸-酚染色，有活力的花粉显示出染成蓝色花粉管(其它组织细胞为无色或淡黄色)在花柱中正常伸展；其三，有生活力的花粉授于柱头后，能促使子房膨大，结出正常种子。
2)、转化花粉的授粉将上述处理后的棉花花粉授于已去雄套袋隔离的柱头上，继续套袋隔离，以防止其它花粉的污染；为提高结铃率，可用100ppm的赤霉素涂抹授粉后的子房；同时对同一棉株上未授粉处理过的花朵进行自交，作为阴性对照；为标记和区分授粉处理和自交处理的花朵及其以后结的棉铃，在花柄上挂有记载的牌子。
3)、转化种子的收获根据牌子的记载，分别从授粉处理和自交处理的吐絮棉铃中收获种子；其中，从授粉处理的棉铃中收获的种子为转化种子，从自交处理的棉铃中收获的种子为自交种子(非转化种子，对照)；种子晒干后备用。
3、转化体的筛选1)种子萌发时对潮霉素抗性的筛选转化种子经硫酸脱绒和升汞灭菌消毒后，置于含50mg/L潮霉素的MS固体培养基上萌发和生长，以非转化种子为对照，观察种子萌发和生长时对潮霉素抗性的情况，淘汰非抗性苗，保留抗性苗；抗性苗移栽至土壤。
2)移栽后转化体的抗性筛选为进一步淘汰假阳性转化体，再用500mg/L潮霉素溶液涂抹幼叶进行第二次抗性筛选；以非转化体为对照，对转化体棉株的倒3叶用潮霉素溶液涂抹，5-8天后根据被涂抹幼叶的抗性反应，淘汰抗性差的植株，保留抗性强的植株。抗性强的植株备用于转化体的DAN分子检测和验证。
4、转化体的DAN分子检测和验证1)、用组织化学反应检测转化体中GUS基因的表达经潮霉素抗性筛选后的转化体，取其开花后5-10天的胚珠及其纤维，将它们置于Eppendorf管中，加2倍于组织体积的GUS染色液，抽真空，37℃保温过夜，染色后的组织于FAA脱色液中进行脱色至非转化体(对照)材料呈现白色为止，观察转化体组织GUS反应，或制成石蜡切片进行观察，阳性转化体组织细胞显示蓝色反应。
2)、用PCR扩增检测转化体中目的基因的整合用于PCR检测的转化体DNA用CTAB法从棉叶中提取；PCR扩增引物为外源目的基因(acsA+acsB)的特异序列P1(上游)和P2(下游)，其中acsA基因P15‘GCGCGGATCCGAACCGTGAAAATGGTTTCG3’，P25‘CCCCAAGCTTTCGTTTATGGGTCACGACTT3’；acsB基因P15‘GCGCGGATCCGAACCGTGAAAATGGTTTCG3’，P25‘CCCCAAGCTTTCGTTTATGGGTCACGACTT3’。
反应体系内含有2×GC buffer I 12.5μl，dNTP(浓度为2.5mmol)4μl，P1和P2(浓度为10mmol)各1μl，TaqaLA 0.2μl，模板DNA1μl，加ddH2O至25μl；反应程序为95℃预变性5min，94℃30s、55℃1min和72℃2min的30个循环，然后72℃10min延伸和4℃保存。以非转化体为对照，对转化体的PCR产物进行电泳分离，阳性转化体的PCR产物含有外源基因的DNA序列片段。
3)用Southern杂交检测转化体中目的基因的整合从转化体中提取DNA，以非转化体为对照，取10μg DNA分别用HindIII和BamHI于37℃酶切过夜，经酶切后的DNA在0.9％的琼脂糖凝胶中分离，并转印于尼龙膜上，以同位素32P标记的目的基因(acsA或acsB)作为探针，与尼龙膜上的DNA杂交，经X光片放射自显影，阳性转化体因含有目的基因显示出杂交信号带。
4)用Northern杂交检测转化体中目的基因的表达从转化体开花后10天的胚珠中提取总RNA，以非转化体为对照，RNA在1.2％甲醛变性的琼脂糖凝胶中分离，分离后的RNA转印于尼龙膜上，以同位素32P标记的目的基因(acsA或acsB)作为探针，与尼龙膜上的RNA杂交，经X光片放射自显影后，阳性转化体因目的基因的表达显示出杂交信号带。
表1转基因棉花株系的纤维品质指标纤维品质指标基因型 年分(世代) 长度比强度 马克隆值 纤维素含(mm) (gf/tex)(μg/in)量(％)2001(T1) 28.3±1.1 24.29±0.5 3.5±0.2 87.6±2.1转基因株系2002(T2) 29.4±1.4 24.05±0.8 4.0±0.2 89.2±3.0平均 28.85 24.173.75 88.402001 24.6±0.8 21.04±0.4 4.4±0.2 80.02±1.2非转基因株系(对照)2002 25.5±1.1 20.14±0.5 4.1±0.3 85.12±1.3平均 25.05 20.594.25 82.57差值3.80*3.58*-0.50 5.83*比对照增减(％) 15.17 17.38-11.76 7.06*表示在0.05概率水平上的差异显著经上述对本发明的实施，将木质醋杆菌的纤维素合成酶基因acsA和acsB，通过农杆菌真空渗透法感染棕色棉花恢复系的花粉，感染后的花粉授粉于棉花柱头上，获得转化种子，经抗生素的筛选，以及GUS表达、PCR扩增和Southern杂交等的检测和验证，最终获得了纤维品质有所改良的转基因棉花(表1)，这表明这一方法是可行性。
权利要求
1.一种农杆菌真空渗透法转化植物花粉的转基因方法，方法的步骤如下1)花粉离体培养将采集的花粉在花粉萌发培养液中培养，以蔗糖作为调节花粉渗透压的调节剂，调节渗透压使花粉萌发；2)农杆菌感染花粉处理将经离体培养的花粉与农杆菌在花粉萌发培养液中共培养，加Tween-20的表面活性剂，并抽真空；3)授粉将经农杆菌感染处理的花粉授于已去雄的雌蕊柱头上，套袋隔离，获得转化种子及其植株。
2.根据权利要求1所述的一种农杆菌真空渗透法转化植物花粉的转基因方法，其特征在于所说的花粉萌发培养液的重量百分比为0.1％～0.12％H3BO3、0.3％～0.4％Ca(NO3)2-4H2O、0.2％～0.23％MgSO4-7H2O、0.1％～0.12％KNO3、45％～50％蔗糖、其余为水。
3.根据权利要求1所述的一种农杆菌真空渗透法转化植物花粉的转基因方法，其特征在于所说的农杆菌为带有Ti质粒载体的工程根癌农杆菌，载体带有GUS基因(β-glucuronidase gene)、潮霉素抗性基因(Hygromycin phosphotransferase(HPT)gene)和外源目的基因；基因表达由CaMV35s启动子驱动；GUS基因含有内含子，能在真核生物细胞中表达。
4.根据权利要求1所述的一种农杆菌真空渗透法转化植物花粉的转基因方法，其特征在于所说Tween-20的浓度约为1～2‰，所抽真空的压力为-70～-80Pa，时间为20min～30min。
全文摘要
本发明公开了一种农杆菌真空渗透法转化植物花粉的转基因方法。它是利用根癌农杆菌在花粉培养基中感染植物花粉，附加抽真空处理提高感染效果，将转化后的花粉授于待改良品种的雌蕊柱头上，获得转化种子及其植株；转化体经抗生素筛选，以及GUS表达、PCR扩增、Southern和Northern杂交等的检测和验证，获得含有外源目的基因的转基因植株。本方法省略了传统基因转化方法所要求的组织培养过程，避免了农杆菌感染植物组织时存在的转化与非转化细胞间的嵌合现象问题，使整个转化过程较为经济、简单和有效。
文档编号A01H1/02GK1640241SQ20041008469
公开日2005年7月20日 申请日期2004年11月23日 优先权日2004年11月23日
发明者王学德, 李晓, 朱伟 申请人:浙江大学