专利名称：一种大白菜细胞质雄性不育系的选育方法
技术领域：
本发明属于十字花科蔬菜育种技术领域，具体涉及新的大白菜细胞质雄性不育系的选育、繁殖和利用方法。
背景技术：
细胞质雄性不育是油菜杂种优势最重要的途径。目前国内外已报道的细胞质雄性不育类型很多，根据其来源不同可分为异源细胞质雄性不育和同源细胞质雄性不育两大类在异源CMS中，最有利用价值并已开始商业化育种的有ogu CMS、kosena CMS和touCMS；在同源CMS中，具有商业利用价值的主要是波里马细胞质雄性不育系(英文简称Pol CMS，下同)。Pol CMS是华中农业大学傅廷栋教授1972年发现并公认的国际上第一个有实用价值的油菜细胞质雄性不育系，根据有关资料报道1985-1994年期间国际上70％以上的油菜杂交中均由pol CMS育成，它仍为当前国内甘蓝型油菜杂种生产使用的主要不育细胞质源。但Pol CMS的主要不足是不育系因核背景而异存在不同程度的生态敏感性，通常在低温或高温条件下出现可育花粉，影响制种纯度。nap CMS更易受环境和温度的影响，在杂种生产上的利用价值受到了限制。
大白菜的杂种一代利用工作已在世界范围内广泛地开展，特别是亚洲国家，如中国、日本和韩国等，但采用自交不亲和系或自交亲和系的方法进行杂种一代生产居多。该方法存在着自交多代易发生双亲生活力衰退和容易出现假杂种等问题，最主要的是育种者的权利和利益无法保护。利用大白菜雄性不育系生产一代杂种，特别是大白菜细胞质雄性不育系材料的选育和利用是白菜育种及杂种优势利用的有效途径之一。利用胞质雄性不育系制种，不仅可以获得高质量的杂交后代，而且可以保护育种者的利益。大白菜的细胞质雄性不育系波里马细胞质雄性不育系和萝卜细胞质雄性不育系。但Ogu-CMS和Pol-CMS细胞质雄性不育系存在一些缺点，因此能够克服Ogu和Pol白菜胞质不育系缺点，寻找新型大白菜不育系材料是非常必要的。1968年萝卜胞质不育系被发现，并在世界范围内广泛利用，但其存在低温黄化及蜜腺退化等致命弱点。近20年来，国内外研究最多和利用最广泛的是萝卜细胞质雄性不育和波里马细胞质雄性不育。
Pol CMS不育源不仅在油菜雄性不育系的选育中被广泛利用，而且还被广泛地应用到其它十字花科蔬菜作物雄性不育系的选育中。柯桂兰等(柯桂兰等.大白菜异源胞质雄性不育系CMS3411-7的选育及应用[J]，园艺学报，1992，19(4)333-340)以油菜波里马细胞质雄性不育系材料为母本，用大白菜3411-7为父本，进行杂交，得到F1，再用该F1为母本，以甘蓝为父本进行杂交，得到三交种F1(aacc×aa×cc)，然后选取三交种F1中的优良单株作母本，用白菜3411-7为轮回父本，通过连续回交，定向选择，育成了大白菜异源胞质雄性不育系CMS3411-7。该不育系克服了萝卜不育源苗期黄化、蜜腺退化等生理缺陷。其不育性稳定，不育株率大于95％，且无异源胞质的不良影响。近年来，已经报道陆续育成了Pol一不结球白菜不雄性育系，Pol一青花菜雄性不育系，Pol一菜心雄性不育系利POl一红菜薹雄性不育系。
有关萝卜细胞质雄性不育系的研究进展，最早的不育源是Ogura是在日本某萝卜品种留种田中发现的，并经试验证明该不育性由细胞质基因和2对隐性细胞核基因共同控制，该不育源称为Ogura不育源(或称Ogura不育系)。自Ogura1968年发现Ogu CMS以来，国内外学者对该不育材料进行了大量的回交转育。目前已转育到油菜、甘蓝、白菜、青花菜等十字花科作物中。但由于最初的Ogu CMS存在低温苗期黄化、蜜腺不发达等问题，至今这些细胞质雄性不育系都未再在生产中推广利用。
发明内容
本发明的目的就是克服现有大白菜细胞质雄性不育系的不足之处，选育一种新的育性稳定的大白菜细胞质雄性不育系，为蔬菜杂种优势利用提供新的种质资源。利用本发明选育的大白菜细胞质雄性不育系的不育性稳定、彻底和不受环境影响等突出优点，培育新型的大白菜细胞质雄性不育材料和蔬菜杂交种。
本发明通过以下技术方案得以实现一种大白菜细胞质雄性不育系的选育方法，其特征在于，选择天然芥菜型细胞质雄性不育系6-102A作母本，保持系大白菜DH系63-5作父本，通过分子标记辅助选择、远缘杂交、胚挽救和连续回交，得到遗传稳定的大白菜细胞质雄性不育系和保持系，繁殖该大白菜细胞质雄性不育系，得到大白菜细胞质雄性不育系CMS63-5。
具体选育步骤如下(1)利用RFLP分子标记方法对天然芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A进行遗传分类，获得新型油菜细胞质雄性不育材料6-102A；(2)用步骤(1)得到的6-102A作母本，保持系大白菜DH系63-5作父本远缘杂交，得到F1；(3)对步骤(2)得到的F1植株的胚进行胚挽救，对获得的植株进行育性鉴定，得到中间型细胞质雄性不育株；(4)用步骤(3)得到的F1不育株作母本与保持系大白菜DH系63-5远缘杂交和胚挽救，得到BC1F1细胞质雄性不育系；(5)用步骤(4)得到的BC1F1细胞质雄性不育系的胚进行胚挽救和和育性鉴定，再与保持系大白菜DH系63-5回交和胚挽救，得到BC2F1细胞质雄性不育系；(6)用步骤(5)得到的BC2F1细胞质雄性不育系作母本，以保持系大白菜DH系63-5作轮回亲本连续回交六代，得到BC8大白菜细胞质雄性不育系CMS63-5。
在秋播或夏播隔离条件下繁殖所述的大白菜细胞质雄性不育系CMS63-5，从而完成了本发明。
本发明的积极效果1、本发明的大白菜细胞质雄性不育系的不育性十分稳定彻底，且不受环境(如低温或高温)和遗传背景的影响，在甘肃兰州和湖北武昌连续五年10代种植并进行育性鉴定，该不育系的不育性和不育株率均为100％。
2、没有现有技术存在的苗期黄化和蜜腺不发达的问题。
3、本发明选育的大白菜细胞质雄性不育系可用于蔬菜杂种优势育种。
图1是本发明的技术路线2是原始芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A的花器官图和本发明选育的大白菜细胞质雄性不育系CMS63-5和保持系花期和胚挽救得到的组织培养苗；图中A、B是原始芥菜型细胞质雄性不育系6-102A花器官图，C、D是本发明选育的大白菜细胞质雄性不育系CMS63-5的花期图；E是保持系大白菜DH系63-5，F是经过胚挽救后获得的组织培养苗。
图3是本发明选育的大白菜细胞质雄性不育系CMS63-5开花期间表型中A是大白菜细胞质雄性不育系CMS63-5花器官图；B、D是大白菜细胞质雄性不育系CMS63-5花期田间表型；C是大白菜DH系63-5的花期表型。
图4芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A和6-102B的花药发育细胞学观察及F1(6-102A X大白菜63-5，2n＝28)杂种的染色体鉴定图中A是芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A和6-102B的花药发育细胞学观察；B是F1杂种的染色体鉴定图5RFLP对几种油菜不育胞质材料的多态性分析图中A利用探针atp6，B利用探针atp9，图中A利B的第2个泳道是本发明的芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A。
具体实施例方式
实施例1大白菜细胞质雄性不育系的选育一、对芥菜型油菜细胞质雄性不育系进行遗传分类，其步骤如下1、恢保关系的测定(1)通过恢保关系的测定，对芥菜型细胞质雄性不育系进行了正确的遗传分类，确定编号为6-102A的材料为新的细胞质雄性不育胞质类型。
(2)通过恢保关系的测定(见傅延栋，《杂交油菜的育种与利用》，湖北科学技术出版社，2000年版所介绍的方法)，分别选取39个甘蓝型和芥菜型油菜品种或品系分别与pol CMS；ogu CMS，tour CMS，nap CMS，6-102A进行测交，其恢保关系测定结果如表1所示。
表1几种油菜细胞质雄性不育系之间的恢保关系测定
说明1、CMS为细胞质雄性不育系的英文缩写，表1中英文字母含义S表示细胞质雄性不育，F表示细胞质雄性可育)；2、上述测定材料5900至棚71-1均分别来自华中农业大学油菜育种研究室。
(3)对获得的F1进行育性调查，结果表明，6-102A与其它几类不育系的恢保关系不同。
2、花药发育的显微镜观察取6-102A的花蕾制作石腊切片(参照余风群等，甘蓝型油菜几个品种花药发育的细胞学研究，中国油料，1988，(4)23-25)，显微结构观察表明本发明的芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A的花药发育的败育时期为雄蕊原基分化时期，其主要特点是雄蕊原基偏离正常的分化轨道，形成花瓣原基，不形成花药，着生雄蕊的位置长出小花瓣，败育时期和方式与现有报道的油菜细胞质雄性不育不同。
3、RFLP分子标记分析(1)从天然芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A(芥菜型油菜)、保持系6-102B(芥菜型油菜)、pol CMS(甘蓝型油菜)、ogu CMS(甘蓝型油菜)、tour CMS(甘蓝型油菜)、nap CMS(甘蓝型油菜)共六种油菜材料中分别提取基因组DNA，参照CTAB法(murray and thompson，1980)提取基因组总DNA，
具体步骤如下A、加2％CTAB提取液(Cetyltriethylammonium bromide)到25ml，65℃加热1hr，轻摇，冷却至室温；B、加等体积的氯仿/异戊醇＝(24∶1)，轻轻混合，混匀，至下层为深绿色，静置10分钟；C、将B步骤的混合液离心，3000rpm，13～20分钟；D、取上清，尽可能倒出上清；E、加入1/10体积的10％CTAB提取液，65℃加热10分钟；F、加入25ml氯仿/异戊醇(24∶1)，纯化，3000rpm，12分钟；G、加1倍体积的异丙醇沉淀DNA，在-20℃条件下放置20min；H、用76％的乙醇洗洗涤DNA 2～3次(3200rpm，离心8分钟)；I、加TE 200μl溶解，4℃过夜，待DNA溶解后，用RNase酶处理所得的DNA溶液(37℃加热1小时)，检测DNA浓度及质量。
(2)制备七种线粒体探针(详见表2)表2几种用于Southern杂交分析的线粒体探针
(3)用限制性内切酶EcoRI EcoRV、HindIII、BamHI、PstI对上述六种作物材料的基因组DNA进行酶切；(4)进行Southern杂交(操作步骤参考sambrook，J，等著；《分子克隆实验指南》，北京，科学出版社，2002年)。
a.预杂交将尼龙膜放入杂交袋或杂交管中，加入杂交液(具体配制方法如下所述)，赶气泡，封口，放入65℃的杂交箱中，＞3hrs，杂交液浸没膜。一般地，12hrs。
b.标记探针反应体系1-2blots(19.5×9.5cm2)DNA 100ngDNTP 2.0μlRandom primer5.0μlKlenow(1u/μl) 1μlα-dCTP* 3.0μl加水至17.0μl具体步骤是将探针DNA变性(100℃，10min)-变性探针置于冰浴-按反应体系加入反应混合液于变性DNA中-再在同位素操作台上，加入32P标记的dNTP(α-32P dCTP*，α-32P-dCTP)(放射性比活＞3000Ci/mmol)-30℃温育2小时以上。
c.杂交将标记好的探针，补加300μl杂交液100℃变性(或者0.4N NaOH变性)，加入杂交袋(盒)中(忌直接加于膜上)，杂交前作标记效率测定。＞25％以上可以往下做杂交。过夜杂交。杂交效率受杂交速率及杂交稳定性影响。
d.洗膜按照从低严谨度到高严谨度洗膜。
1×SSC/0.1％SDS洗膜两次(冷5min，热65℃，15min)→0.5×SSC/0.1％SDS热洗65℃，15min。
e.包膜膜从洗膜液中捞出，在滤纸上凉干，膜表面无可见水膜为止(忌太干，以防探针难以洗脱，影响再次使用)用保鲜膜包膜，压片，置-20℃或-70℃，依据信号强弱进行曝光(3-7天)f.冲洗X-光片在暗室红灯下取出X-光片，置入显影液中至杂交带显现出来(显影时间依据信号强弱及曝光时间长短可由几秒钟到2分钟)，转入清水中漂洗，然后放入定影液中定影至清亮(约10分钟)。自来水冲洗干净后，晾干，读片。
杂交缓冲液Southern Blot Hybridization Buffer(Saghai’s Lab)终浓度.原液 体积.
5×SSC 20×250ml50mM PB(pH 6.8)0.5M 100ml5×Denhardt’s 50× 100ml2.5mM EDTA(pH 8.0) 0.5M 5ml100μg/ml ssDNA 5mg/ml 20ml0.4％SDS 20％ 20mlDextran sulfate 50gddH2O to 1000ml20×SSCNaCl 175.3g 701.2gNa3Citrate88.2g 352.8gdH2O to 1000ml 4000ml(5)RFLP结果分析结果表明探针orf222、atp6、atp9、Orf263-atp6检测结果表现12种多态性标记。二十八种线粒体探针/酶组合中，有十二种探针/酶组合检测到多态性，证明本发明得到的芥菜型细胞质雄性不育系6-102A与Pol CMS、Nap CMS、ogu CMS、tour CMS在线粒体DNA水平是完全不同的，即为不同的细胞质类型。杂交结果如图5所示，不育系6-102A与其它五类细胞质的mtDNA杂交图谱完全不一样，表现出明显的多态性。同时，四个线粒体基因的十二种组合也检测到6-102A和6-102B的mtDNA带型存在明显的多态性，表现为杂交带的数目和位置不同，只有orf222/EcoRI存在带型有无的差异。
二、大白菜细胞质雄性不育系的选育步骤(1)用天然芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A(中国发明专利申请号200510086942.7，该种子已于2005年11月12日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NOP200504)作母本，保持系63-5(该育种材料的种子已于申请日前公开销售)作父本杂交，采用胚挽救方法(即离胚培养，离胚培养采用通用的MS基本培养基(1962)，培养基配方及制备方法见下面的具体地描述)，培养得到F1；(2)用步骤(1)得到的中间型细胞质雄性不育系F1作母本与保持系大白菜DH系63-5杂交，离胚培养得到BC1F1细胞质雄性不育系；(3)用步骤(2)所获得的BC1F1细胞质雄性不育系作母本与保持系63-5杂交，离胚培养得到BC2F1细胞质雄性不育系；(5)用步骤(4)获得的BC2F1细胞质雄性不育系作母本，以保持系63-5作轮回亲本连续回交六代，得到BC8大白菜细胞质雄性不育系CMS63-5。
MS培养基的配制在三角锥形瓶中装如下的培养基MS基本培养基(Murashige T，skoog F，1962，A revised medium forrapid growth and bioassays with tobacco tissue culture cultures physiol plant 15473-479)，附加6-BA1.5mg/L，NAA0.05mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.0g/L，加水至1L，调pH5.9-6.0。
按常规方法(121℃，高压蒸汽灭菌30分钟)灭菌，灭菌后从灭菌锅中取出三角锥形瓶，平放在实验台上使其冷却凝固，备用。
胚挽救方法(1)用芥菜型细胞质雄性不育系6-102A为母本，以大白菜DH系63-5为父本进行远缘杂交，得到F1；(2).从生长15-20天后的F1植株上取角果，将隆起的子房于4℃保存；(3).在超净工作台上用70％的乙醇溶液处理角果5分钟，(4).再用0.1％的升汞溶液处理角果15分钟；(5)用灭菌的蒸馏水洗涤角果三次，每次5分钟左右；(6)用消毒好的解剖针或镊子剥离种胚；(7)将消毒好的胚放在预先配制的MS固体培养基(配方如上所述)中，置于25℃培养室内，光照强度1000-1500lx，每天光照14h，经过大约30天培养即得到组织培养苗，最后将获得的组培苗适时移栽到大田中。
大白菜细胞质雄性不育系CMS63-5的繁殖步骤在中国湖北武汉秋播(每年的9月)或中国甘肃兰州夏播(每年的5月)隔离条件下，按父本∶母本为2∶4的行比繁殖所述的大白菜细胞质雄性不育系，其他栽培管理同普通油菜细胞质不育系的繁殖。
本发明的积极效果是表3大白菜细胞质雄性不育系CMS63-5与Pol CMS、6-102A的表型比较
权利要求
1.一种大白菜细胞质雄性不育系的选育方法，其特征在于，选择天然芥菜型细胞质雄性不育系6-102A作母本，保持系大白菜DH系63-5作父本，通过分子标记辅助选择、远缘杂交、胚挽救和连续回交，得到遗传稳定的大白菜细胞质雄性不育系和保持系，繁殖该大白菜细胞质雄性不育系，得到大白菜细胞质雄性不育系CMS63-5。
2.根据权利1所述的方法，其特征包括以下步骤(1)利用RFLP分子标记方法对天然芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A进行遗传分类，获得新型油菜细胞质雄性不育材料6-102A；(2)用步骤(1)得到的6-102A作母本，保持系大白菜DH系63-5作父本远缘杂交，得到F1；(3)对步骤(2)得到的F1植株的胚进行胚挽救，对获得的植株进行育性鉴定，得到中间型细胞质雄性不育株；(4)用步骤(3)得到的F1不育株作母本与保持系大白菜DH系63-5远缘杂交和胚挽救，得到BC1F1细胞质雄性不育系；(5)用步骤(4)得到的BC1F1细胞质雄性不育系的胚进行胚挽救和和育性鉴定，再与保持系大白菜DH系63-5回交和胚挽救，得到BC2F1细胞质雄性不育系；(6)用步骤(5)得到的BC2F1细胞质雄性不育系作母本，以保持系大白菜DH系63-5作轮回亲本连续回交六代，得到BC8大白菜细胞质雄性不育系CMS63-5。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在秋播或夏播隔离条件下繁殖大白菜细胞质雄性不育系CMS63-5。
全文摘要
本发明属于十字花科蔬菜育种技术领域，具体地，本发明属于一种大白菜细胞质雄性不育系选育方法的发明。本发明的技术特征在于，选择天然芥菜型雄性不育株，用优良大白菜DH系63－5作保持系，通过远缘杂交、胚挽救以及连续回交和分子标记辅助选择，得到遗传稳定的大白菜细胞质雄性不育系，繁殖该不育系得到可供生产利用的大白菜细胞质雄性不育系CMS63－5。该大白菜不育系的不育胞质类型与6－102A相同，与波里马细胞质雄性不育(polCMS)、萝卜细胞质雄性不育(Ogu CMS)、tour CMS、nap CMS等细胞质雄性不育类型均不相同，是一种新的细胞质雄性不育类型，该不育系的不育度和不育株率均为100％，且不受环境和遗传背景的影响。本发明的大白菜细胞质雄性不育系可用于蔬菜杂种优势育种。
文档编号A01G1/00GK1849881SQ20061001210
公开日2006年10月25日 申请日期2006年6月5日 优先权日2006年6月5日
发明者傅廷栋, 万正杰, 马朝芝, 涂金星, 李兴华, 易斌, 文静 申请人:华中农业大学