专利名称：：亚麻游离花粉培养基及亚麻游离花粉培养方法
技术领域：
：本发明涉及亚麻生物
技术领域：
，主要涉及亚麻游离花粉培养技术。
背景技术：
：我国亚麻花药培养研究始于二十世纪70年代，并由我国首次从亚麻花药培养中获得花粉植林，但亚麻花药愈伤组织的诱导率和绿苗分化率很低，且存在大量的从体细胞发育而来的二倍体植林，给单倍体鉴定带来很大困难，严重制约了亚麻单倍体育种进程。游离花粉的培养具有其独特的优越性，首先，游离花粉是单倍的性细胞，游离花粉的培养不仅可减少倍性鉴定的工作量，而且它还可作为高效的细胞筛选系统，使农艺性状迅速稳定，避免后代的分离。其次，它可作为转基因的受体，通过染色体加倍，使外源基因快速纯和。在亚麻游离花粉培养过程中，培养方法及培养基是影响花粉产生愈伤组织诱导率和花粉绿苗的分化率主要外因条件。因此，本领域迫切需要建立亚麻游离花粉培养方法及培养基。
发明内容本发明的目的就是提供一种新型的亚麻游离花粉培养基及亚麻游离花粉培养方法，以达到建立亚麻游离花粉培养系统、进一步提高亚麻花粉愈伤组织的诱导率和花粉绿苗分化率、加快亚麻花培育种进程的目的。本发明的目的是这样实现的一种亚麻游离花粉培养基，包括亚麻游离花粉愈伤组织诱导培养基HF,、亚麻游离花粉愈伤组织分化培养基HF2和亚麻花粉绿苗生根培养基HF"其特征在于①、亚麻游离花粉愈伤组织诱导培养基HFi含有1/2N6,1.5mg/12.4—D,0.5mg/L6—BA;1/2^的成分为:硝酸钾1415mg/L,石克酸4妄231mg/L,辟^酸4美92mg/L,氯化《丐83mg/L，磷酸二氢钾200mg/L,硼酸0.8mg/L,石克酸锰2.2mg/L,石典化钾0.4mg/L,石克酸锌0.75mg/L，甘氨酸1.Omg/L，盐酸石克胺素1.Omg/L,盐酸吡。多素0.5mg/L,烟酸0.5mg/L,石克酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L,蔗糖30g/L,琼脂8g/L;PH值为5.5;②、亚麻游离花粉愈伤组织分化培养基肝2含有1/2N6，2.0mg/L6一BA,0.5mg/LIAA;1/2仏的成分为硝酸钾1415mg/L,;琉酸铵231mg/L，硫酸镁92mg/L，氯化钙83mg/L,磷酸二氢钾200mg/L,硼酸0.8mg/L,石克S臾4孟2.2mg/L,不典化钟0.4mg/L,碌^酸辞0.75mg/L,甘氨酸1.0mg/L,盐酸辟u胺素1.0mg/L,盐酸吡口多素0.5mg/L,烟酸0.5rag/L,石克酸亚寺失27.8mg/L,乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L,蔗糖30g/L,琼脂8g/L;PH值为5.5;③、亚麻花粉绿苗生根培养基HF3含有1/2N6,0.2mg/LNAA，0.2mg/LIAA;1/2&的成分为:硝酸钾1415mg/L,硫酸铵231mg/L,;琉酸4美92mg/L,氯化钙83mg/L,磷酸二氪钾200mg/L,硼酸0.8mg/L,石克酸锰2.2mg/L,石典化钾0.4mg/L,碌u酸锌0.75mg/L,甘氨酸1.0mg/L,盐g吏碌u胺素1.0mg/L,盐酸吡喷素0.5mg/L,烟酸0.5mg/L,碌u酸亚4失27.8mg/L,乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L,蔗糖30g/L,琼脂8g/L;PH值为5.5;一种使用上述亚麻游离花粉培养基的亚麻游离花粉培养方法，其特征在于该方法包括步骤是①、取花粉小孢子处于单核中后期的亚麻花蕾，放入2°/。的次氯酸钠溶液中消毒15分钟，再用无菌水沖洗3次，取出花药放入盛有无菌水的培养皿中，用针刺释放法将花粉粒释放到无菌水中，再通过过滤离心收集花粉；②、调整花粉密度5.0x1()2个/ml，制备成花粉悬浮液，接种到亚麻花粉愈伤组织诱导培养基HF,中，诱导花粉愈伤组织，在18—25°C、光照强度为2000LX、光照时间8小时/天的条件下培养；③、当亚麻花粉愈伤组织长到3—5mm左右，转入亚麻花粉愈伤组织分化培养基HF2中，诱导花粉绿苗的分化，在18—25°C、光照强度为2000LX、光照时间12小时/天的条件下培养；④、将步骤③得到的植抹转入亚麻花粉绿苗生根培养基HF3中，在18—25。C、光照强度为2000LX、光照时间为15小时/天的条件下培养，一般7—15天可陆续生根。本发明的关键是找到了适宜的培养方法，筛选出高效培养基，该发明是在多年的亚麻花粉培养及对多种培养基应用研究的基础上，从调整大量元素、微量元素、植物激素入手，筛选出亚麻游离花粉培养基HFhHFs和HF3，并首次建立了亚麻游离花粉培养方法，简化了亚麻倍性鉴定的复杂过程，且以HFi培养基的花粉愈伤组织诱导率、HF2培养基的花粉绿苗分化率和HF3培养基的花粉绿苗生根率均明显高于已有技术。具体实施例方式下面举实例对本发明及实施效果进行详细描迷。(1)以1/2Ns培养基成分为基础，通过调整植物激素2.4—D(0.1一3.Omg/L)、6—BA(0.1—3.Omg/L)的浓度并进行配比实验，筛选出亚麻游离花粉最佳诱导培养基HF!，其激素配比浓度为1.5mg/L2.4一D,0.5mg/L6—BA;通过调整才直物激素6—BA(0.1一3.Omg/L)、(0.1一2.Omg/L)IAA的浓度并进行配比实验，筛选出亚麻游离花粉愈伤组织分化培养基HF2,其激素配比浓度为1.5mg/L6—BA,0.5mg/LIAA;通过调整才直物激素NAA(O—O.5mg/L)、(O—O.5mg/L)IAA的浓度进行配比实验，筛选出亚麻花粉植林生根培养基HF3，其激素配比浓度为0.2mg/LNAA，0.2mg/LIAA;(2)诱导培养基肌中亚麻游离花粉愈伤组织诱导率。我们接种5个杂交组合的亚麻花粉。5个杂交组合各2ml花粉悬浮液(花粉密度为5.Gx1(^个/ml)分别接种在HFj咅养基上，进行花粉愈伤组织的诱导，在18—25。C，光照强度为2000LX,光照时间8小时，培养15—30天，实验结果表明培养基HFi花粉愈伤组织的i秀导率为20.6—30.8%。表2培养基肌中不同杂交组合对花粉愈伤组织诱导率的影响杂交组合代号接种花粉数(个)愈伤组织(块)愈伤组织诱导率(%)9601100030830.89605100028628.69712100025125.19715100020620.69718100021921.9(3)HFi与MS、B5、Ns培养基对比实验。取同一杂交组合的花粉接种在MS、B5、IHFi培养基上，每种培养基均接种4ml花粉悬浮花粉悬浮液(花粉密度为5.0x1()2个/ml),四种培养基中激素配比均为1.5mg/L2.4—D,0.5mg/L6—BA。在18一25。C,光照强度为2000LX,光照时间8小时，培养15—30天，实验结果表明HFi、MS、B5、N6四种培养基花粉愈伤组织的诱导率分别为29.7%、6.2°/。、8.6%、18.5%。以HF^咅养基花粉愈伤组织诱导率最高。表3不同培养基对花粉愈伤组织诱导率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(4)亚麻花粉绿苗分化。当花粉愈伤组织长到3—5mm左右，转入亚麻花粉愈伤组织分化培养基HF2中，诱导花粉绿苗的分化。实验了5个杂交组合的亚麻花粉愈伤组织在培养基HF2中花粉绿苗的分化情况。培养条件为温度18—25。C,光照强度为2000LX,光照时间12小时，培养20—30天，并统计花粉绿苗的分化率。表4实验结果表明，2培养基的花粉绿苗分化率为4.5—11.5%。表4不同杂交组合的愈伤组织在HF2培养基中花粉绿苗分化率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(5)亚麻花粉植林生根培养基HF3,当花粉绿苗长到5cm左右时，将其转到HF3培养基中，在18—25°C，光照强度为2000LX,光照时间15小时条件下培养。共转移568棵花粉绿苗进行生根实验，有541棵苗生根，生根率达95.2%。权利要求1、一种亚麻游离花粉培养基，包括亚麻游离花粉愈伤组织诱导培养基HF1、亚麻游离花粉愈伤组织分化培养基HF2和亚麻花粉绿苗生根培养基HF3，其特征在于①、亚麻游离花粉愈伤组织诱导培养基HF1含有1/2N6，1.5mg/L2.4-D，0.5mg/L6-BA；1/2N6的成分为硝酸钾1415mg/L，硫酸铵231mg/L，硫酸镁92mg/L，氯化钙83mg/L，磷酸二氢钾200mg/L，硼酸0.8mg/L，硫酸锰2.2mg/L，碘化钾0.4mg/L，硫酸锌0.75mg/L，甘氨酸1.0mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L；②、亚麻游离花粉愈伤组织分化培养基HF2含有1/2N6，2.0mg/L6-BA，0.5mg/LIAA；1/2N6的成分为硝酸钾1415mg/L，硫酸铵231mg/L，硫酸镁92mg/L，氯化钙83mg/L，磷酸二氢钾200mg/L，硼酸0.8mg/L，硫酸锰2.2mg/L，碘化钾0.4mg/L，硫酸锌0.75mg/L，甘氨酸1.0mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L；③、亚麻花粉绿苗生根培养基HF3含有1/2N6，0.2mg/LNAA，0.2mg/LIAA；1/2N6的成分为硝酸钾1415mg/L，硫酸铵231mg/L，硫酸镁92mg/L，氯化钙83mg/L，磷酸二氢钾200mg/L，硼酸0.8mg/L，硫酸锰2.2mg/L，碘化钾0.4mg/L，硫酸锌0.75mg/L，甘氨酸1.0mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L。2、一种使用如权利要求1所述亚麻游离花粉培养基的亚麻游离花粉培养方法，其特征在于该方法包括步骤是①、取花粉小孢子处于单核中后期的亚麻花蕾，放入2°/。的次氯酸钠溶液中消毒15分钟，再用无菌水冲洗3次，取出花药放入盛有无菌水的培养亚中，用针刺释放法将花粉粒释放到无菌水中，再通过过滤离心收集花粉；②、调整花粉密度5.0x1()2个/ml,制备成花粉悬浮液，接种到亚麻花粉愈伤组织诱导培养基HF,中，诱导花粉愈伤组织，在18_25°C、光照强度为2000LX、光照时间8小时/天的条件下培养；③、当亚麻花粉愈伤组织长到3—5mm左右，转入亚麻花粉愈伤组织分化培养基HF2中，诱导花粉绿苗的分化，在18—25°C、光照强度为2000LX、光照时间12小时/天的条件下培养；④、将步骤③得到的植抹转入亚麻花粉绿苗生根培养基HF3中，在18—25°C、光照强度为2000LX、光照时间为15小时/天的条件下培养。全文摘要亚麻游离花粉培养基及亚麻游离花粉培养方法属于生物
技术领域：
；其亚麻游离花粉愈伤组织诱导培养基HF<sub>1</sub>含有1/2N<sub>6</sub>，1.5mg/L2.4D，0.5mg/L6-BA；亚麻游离花粉愈伤组织分化培养基HF<sub>2</sub>含有1/2N<sub>6</sub>，2.0mg/L6-BA，0.5mg/LIAA；亚麻花粉绿苗生根培养基HF<sub>3</sub>含有1/2N<sub>6</sub>，0.2mg/LNAA，0.2mg/LIAA；采用过滤离心收集花粉制备成花粉悬浮液、诱导花粉愈伤组织、诱导花粉绿苗分化和花粉绿苗生根培养四个步骤完成亚麻游离花粉培养；本发明筛选出亚麻游离花粉培养基HF<sub>1</sub>、HF<sub>2</sub>和HF<sub>3</sub>，并首次建立了亚麻游离花粉培养方法，简化了亚麻倍性鉴定的复杂过程，花粉愈伤组织诱导率、花粉绿苗分化率和花粉绿苗生根率均明显高于已有技术。文档编号A01H4/00GK101292629SQ20081006475公开日2008年10月29日申请日期2008年6月18日优先权日2008年6月18日发明者宋淑敏申请人:黑龙江省科学院亚麻综合利用研究所