专利名称：：一种防治植物土传真菌病害的微生物制剂及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种放线菌在植物土传真菌病害防治中的应用，具体是一种对镰刀菌属、疫霉属等病原真菌有强烈拮抗作用的放线菌在植物土传真菌病害防治中的应用，同时可剌激植物根系生长及促进植物幼苗生长。属于利用微生物对农作物病害进行生物防治领域。
背景技术：
：植物土传真菌病害是一类较难防治的重要植物病害,其病原真菌种类繁多，分别属于疫霉属、镰刀菌属、核盘菌属、丝核菌属、腐霉属等，它们生活在土壤中，条件适宜时从植物根部或茎部侵染植物，并以土壤等为媒介进行传播,进而引发枯萎病、黄萎病、根腐病、灰霉病、立枯病、疫病及苗期猝倒病等植物病害。这些土传真菌病害一直困扰着人们，特别是枯蒌病、黄萎病、根腐病等病害，经常引起大面积幼苗死亡，给农业生产造成了重大损失。目前植物土传真菌病害的防治措施主要是土壤熏蒸、抗性品种的培育和化学农药。但这些方法存在不足。土壤熏蒸在杀灭病原菌的同时也杀灭了土壤中的有益微生物进而破坏了微生态平衡；而培育抗性品种因存在抗性基因单一和种质资源材料匮乏等问题而进展缓慢；长期使用化学农药容易引起抗药性，影响生态环境，对农作物的品质、生产、出口等方面也不利。因此，在农业防治、化学防治和抗病品种方面尚未取得理想效果的情况下，生物防治因无公害、无环境污染和防治作用专化性等优点而成为防治植物土传真菌病害的一种有效方法。在植物病害的生物防治中研究和使用较多的微生物主要有细菌类，如芽孢杆菌、假单胞菌、欧氏杆菌和无致病力土壤杆菌等；真菌类有腐霉菌、厚孢轮枝菌、丝核菌、无致病力的镰刀菌以及木霉属的哈茨木霉、康宁木霉等。与其他微生物在植物病害防治的应用上相比，关于放线菌在植物病害特别是土传真菌病害生物防治的研究和应用相对较少。因此，本发明填补了放线菌在土传真菌病害生物防治中应用方面的空白。
发明内容本发明的目的是针对植物的土传真菌病害防治难度较大，目前使用的化学农药在田间试验效果不理想，长期使用易引起抗药性，影响生态环境。提出将一种抗菌谱较广，易于培养，根际定植能力强的放线菌应用于植物的土传真菌病害防治中。本发明的目的是这样实现的一种放线菌在植物土传真菌病害防治上的应用，其特征在于将放线菌Da07210以液体菌剂或固体菌剂形式防治植物土传真菌病害。本发明中的生防菌Da07210是从海南岛鹦哥岭原始森林土壤中筛选分离到一株放线菌，该菌株对土传病害的病原真菌有强烈的抑制作用。2008年6月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);保藏单位地址北京市朝阳区大屯路；保藏号为CGMCCNo.2561;分类命名为诺尔斯链霉菌(&w/^owyceswoi^eO。菌株Da07210系本发明人于2005年在海南岛鹦哥岭原始森林土壤中发现的可用于植物土传真菌病害的放线菌。经形态学、培养特征、生理生化特性以及16SrDNA序列分析表明该菌株为诺尔斯链霉菌(5V"Wow少cm"ow/^e/)，将其命名为诺尔斯链霉菌Da07210(iS^re/^o附^yceswow^y"'Da07210)。菌株Da07210的16SrDNA序列部分基因序列(1439bp)已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Genbank基因序列数据库提交，登录号为EU341330。该菌具有下列特征有丰富的气生菌丝和基内菌丝，气丝白色至灰色，基丝浅黄至深褐色，无可溶性色素生成，能利用D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-肌醇、L-鼠李糖、蔗糖和L-阿拉伯糖，不利用D-木糖和棉子糖，明胶液化，牛奶凝固、胨化，淀粉水解，硝酸盐还原都呈阳性，不产生类黑色素、H2S，可在纤维素上生长。该菌株抑菌能力和根际定殖能力强，可在植物(如香蕉、西瓜、辣椒等)的根际定殖。对古巴尖孢镰刀菌Fwww/wmoxyspon^wf.sp.cw6e"se、辣椒疫霉/^_yfop/ifAorarca/w'dLeonian、立枯丝核菌/^/zo"ow/aw/am'Kuhn、瓜果腐霉/yWwnap/awWerwatow等重要作物的病原菌有显著抑制作用，抑菌圈直径平均为16.0-19.0mm。本发明中的菌株Da07210液体菌剂是通过以下工艺流程获得的一级种子一~^二级种子~~^发酵罐(无菌空气，培养液)~~^发酵液。发酵罐培养基为葡萄糖1.0%，甘油1.0%,黄豆饼粉1.5%,硫酸铵0.5%，K2HPO40.05%，消泡剂0.01%。培养条件没有特别严格的限制，只要该条件适合菌株Da07210的生长即可。本发明中的菌株DaO721O固体菌剂是这样获得的:将菌株Da07210进行液体发酵生产(与液体菌剂工艺相同)，发酵液与吸附载体按以下公式混合填充剂硅藻土(轻质碳酸钙)的加入量(公斤)呵发酵液菌数(亿/毫升)x放罐体积(升)x收率]/成品菌数一发酵液中的残存物(公斤)，然后适当干燥，制成可湿性粉剂。本发明中的固体菌剂防治植物土传真菌病害是将可湿性粉剂用100-300倍清水稀释浇灌于农作物根部或将固体菌剂与育苗土重量配比为1:200-400混合育苗；所述的液体菌剂防治植物土传真菌病害是将发酵液稀释100-300倍后用于根部浇灌或喷洒于植株，或播种时浸种，移栽前浸根。土传真菌病害指通过土壤传播的镰刀菌属、疫霉属、丝核菌属、腐霉属病原真菌引起的香蕉枯萎病、疫病、立枯病、猝倒病等。此外，本发明的微生物制剂还可刺激植物根系生长并促进植物幼苗生长。该微生物制剂具备了工业化生产的基本性状。.具体实施例方式实例1液体发酵制剂生产1、菌种活化将菌株Da07210接种到固体培养基上，培养基配方为可溶性淀粉20.0g，KN03l.Og，K2HPO40.5g,MgS04'7H200.5g,FeS04.7H20O.Olg，琼脂20.0g，(补足1000ml),pH7.2，在25'C28'C下培养4-5天。2、一级种子培养将活化菌种接种到液体培养基，配方为葡萄糖10.0g，大豆粉10.0g，酵母膏10.0g，可溶性淀粉5.0g，KH2P040.5g，蒸馏水(补足lOOOml)，pH7.2,在25。C28。C下摇瓶培养48小时，获得一级种子液。3、二级种子培养将一级种子液接种到培养基中，培养基配方与前述的一级种子培养(2)相同。在26°C28'C下培养48小时，获得二级种子液，供发酵生产用。'4、发酵罐生产将二级种子液通过接种口接入发酵罐，发酵罐培养基为葡萄糖1.0%，甘油1.0%，黄豆饼粉1.5%,硫酸铵0.5%,K2HP040.05%，消泡剂0.01%,pH7.2，罐温28土1'C，罐压0.07Mpa，拌样速度200rpm，送风量1018m3/h，每2小时取样1次，测定pH值，检查有无杂菌的污染，培养约144-156小时，获得液体发酵制剂，供田间防治病害用。实例2固体生物制剂的生产首先菌株Da07210进行液体发酵生产(与实例1相同)。然后加入填充剂，板框过滤、打浆、干燥、粉碎，制成可溶性粉剂，具体过程如下具体加入填充物将发酵液压入贮罐，根据以下计算公式加入硅藻土(轻质碳酸钙)作为填充剂，加入后搅拌30分钟，填充剂硅藻土(轻质碳酸钙)的加入量(公斤)-[发酵液菌数(^V毫升)x放罐体积(升)x收率]/成品菌数一发酵液中的残存物(公斤)。板框过滤用2公斤/平方厘米的压力，将物料由贮罐压入板框，通过7号滤布过滤。打裝将滤饼卸入打浆灌，按加入碳酸钙量的8%加入浓乳100号，加入适量的滤液均匀搅拌30分钟。干燥在50'C下通风干燥至含水量710%。粉碎粉碎时出料温度不能超过6ox:，以防止菌体失活。成品质量指标测定含菌量、含水量、悬浮率、细度的测定均参照国家企业标准(Q/KWL02-2003)进行，含菌量23亿个/克，其余各项指标均符合标准。实例3固体制剂对香蕉枯萎病大田防治作用1、试验用药剂生防菌Da07210，可湿性粉剂(固体制剂)，对照杀菌剂为30%恶霉灵水剂。2、香蕉枯萎病病原菌制备将F0C4接种于PDA固体培养基中，培养7天后，用灭菌水配制孢子悬浮液，浓度为106个/1111。3、试验地点海南省金江香蕉基地。4、施药方法将固体制剂用清水稀释300倍，进行灌根处理，3天后再用香蕉枯萎病病原菌孢子悬浮液灌根，并设清水处理和病原菌处理。在病原菌灌根后3个月后进行调查，记载各个处理的病情指数、发病率，并计算防效。发病率％=发病株(叶)数"00/调査总株(叶)数病情指数％=1:(各级病株(叶)数x该病级值)xioo/调查总株(叶)数x最高级值防效％=(对照病情指数一处理病情指数)xlOO/对照病情指数香蕉枯萎病病情调查分级标准(病情分为5级)0级外观无可见症状，解剖假茎维管束组织未见变褐；l级外观无可见症状，解剖假茎维管束组织变褐；2级叶片黄化或倒垂；3级假茎基部开裂，但病株尚未枯死；4级病株枯死o5、试验结果从表l可以看出生防菌Da07210可湿性粉剂对香蕉枯萎病防治效果明显，防效可达95.2%。与稀释1000倍30%恶霉灵水剂相比，施用生防菌Da07210的发病率和病情指数分别比其低8.8%和4.95%，防治效果比其高28.1%,显示了该生防制剂具有较好的防效，具备了生产上大量推广的基本条件。表1Da07210可湿性粉剂对香蕉枯萎病防治效果处理病情指数(％)发病率(％)防效00CK17.631.3扁可湿性粉剂(300x〉0.841.595.230%恶霉灵水剂(1000x)5.7910.367.1实例4固体制剂对大豆根腐病、番茄立枯病、黄瓜枯萎病大田防治作用1、试验用药剂生防菌Da07210，可湿性粉剂(固体制剂)。2、试验地点海南省澄迈基地。3、施药方法大田定植后30天，将固体制剂用清水稀释300倍，进行灌根处理(每棵灌药液量200250毫升)。药剂处理30天后进行调査，记载发病率，并计算防效。发病率％=发病株(叶)数xlOO/调查总株(叶)数防效％=(对照发病率一处理发病率)一xlOO/对照发病率4、试验结果在海南省澄迈的大田试验发现本生物制剂可防治大豆根腐病、番茄立枯病、黄瓜枯萎病，防效达85%以上。结果如下表2所示。表2Da07210可湿性粉剂对大豆根腐病、番茄立枯病、黄瓜枯萎病防治效果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实例5液体发酵制剂刺激香蕉苗根系生长及促进香蕉生长作用1、试验时间2006年4月27日至2006年5月26日。2、试验地点海南省乐东抱罗基地苗圃。3、试验用药剂生防菌Da07210(液体制剂)；宝卡有机液肥由海南洋浦生物科技有限公司提供；高氮复合肥由万钟公司提供。4、试验方法直接对比法，二组处理，一组对照，三次重复；随机选取3株小苗调查根系和生长势。处理1:生防菌Da07210(液体制剂)1公斤，稀释300倍分两次(15天1次)喷施1000株蕉苗；处理2:宝卡有机液肥稀释500倍分两次(15天1次)喷施1000株蕉苗对照高氮复合肥稀释1000倍分两次(15天1次)喷施1000株蕉苗。5、试验结果处理1根数明显比处理2及对照多，根系发达(表3)。处理1的假假茎粗度、叶片数、原生根系数、最长原生根长度均高于处理2，表明处理1小苗长势比处理2好。表3液体发酵制剂对香蕉小苗促生长作用结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1.一种防治植物土传真菌病害的微生物制剂，其特征在于，该微生物制剂由放线菌液体发酵生产或加入吸附载体方法制备，其中所述生产菌是放线菌Da07210，其保藏号为CGMCCNo.2561。2.权利要求1所述微生物制剂的应用，其特征在于该微生物制剂用于镰刀菌属、疫霉属、丝核菌属、腐霉属病原真菌引起的香蕉枯萎病、疫病、立枯病、猝倒病等的生物防治。3.权利要求1所述微生物制剂在刺激植物根系生长及促进植物幼苗生长的用途。全文摘要本发明涉及一种防治植物土壤真菌病害的微生物制剂及其应用，属于微生物农药领域。该微生物制剂按常规方法制备。其生产菌株为放线菌Da07210，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.2561。本发明将该菌株通过液体发酵制备成液剂，或与吸附载体按一定比例混合后，经过滤、浓缩、粉碎和凉干，制备成可湿性粉剂。本发明的微生物制剂可防治镰刀菌属、疫霉属、丝核菌属、腐霉属病原真菌引起的香蕉枯萎病、疫病、立枯病、猝倒病等，同时还可刺激植物根系生长，同时促进植物幼苗生长。文档编号A01P3/00GK101518264SQ20091000979公开日2009年9月2日申请日期2009年1月22日优先权日2009年1月22日发明者吴晓鹏,孙前光,哲方,军朱,郑业辉,鲍时翔,黄惠琴申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所;海南正维尔生物科技有限公司