专利名称：一种脱除马铃薯病毒的方法
技术领域：
本发明涉及一种脱除植物病毒的方法，尤其涉及一种脱除马铃薯病毒的方法。
背景技术：
马铃薯是一种重要的经济作物，我国已成为世界马铃薯生产第一大国，
种植面积和产量分别占世界的近四分之一，马铃薯产业吸纳了近5000万农村劳动力和200万城镇人员就业，养育着西部30%的人口。调查显示，我国年人均消费马铃薯约30公斤，远低于发达国家人均75公斤的水平，马铃薯全粉及淀粉需求缺口很大，国内生产仅能满足需求的50%，马铃薯可用于加工食品、全粉、淀粉和变性淀粉等2000多种产品，产业链条长，可实现多次增值。因此，加快推进马铃薯产业发展，对保障国家粮食安全，促进农民增收有很重要的意义。在生产中，病害是影响马铃薯生长和产量的最大因素，而在病害中，马铃薯病毒病是马铃薯的一种最严重的病害，其主要是因为种植了带毒种薯而引起，而栽培管理粗放，缺肥、缺水，会加重病情。马铃薯病毒病发病后，会导致植株畸形、矮小，产量降低；由于病毒病危害，还会引起马铃薯种薯性能退化。防治此种病的方法主要有(1)加大行距，縮小株距，高垄深沟栽培，施足基肥，增施磷、钾肥，合理灌水，及时拔除病株，减轻发病；(2)马铃薯出苗后，立即喷药，防止蚜虫传毒；上述方法只是起到减轻病症的作用，而不能从根本上达到根治的目的。
解决病毒病危害的可行途径是进行病毒的脱除，由于生产的需要，我国对脱毒马铃薯种苗的需求缺口比较大。
目前马铃薯脱毒方法主要是采用茎尖培养的方法进行，茎尖脱毒是利用病毒在植物组织中分布不均匀性，即病毒愈靠近根、茎的端愈少的原理，通过切取很小的茎尖经组织培养来实现的。马铃薯茎尖脱毒切取的茎尖或块茎上芽尖(生长点)长度一般为0.2—0.3毫米，只带1—2个叶原基。但茎尖培养时需在解剖镜下切取0. 1-0. 5 mm的茎尖分生组织，操作和培养相对困难，需要较高的技术经验，而且植株存活率和脱毒率均较低，采用此种方法存在有茎尖培养成活率低，技术操作难度大，且对于一些危害马铃薯生产的病毒脱除率低等问题。茎尖脱毒操作对病毒的脱除率低主要在于操作上难以把握切取的茎尖的大小上，由于病毒的传递是通过维管束来实现的，茎尖的分生组织部分细胞分化不成熟，没有形成完整的维管束，所以病毒很难到达茎尖部位，因此茎尖脱毒的操作上要求比较高，切取的茎尖要足够小，然而过小的茎尖又不利于成活和再生分化成完整的植株，这些是目前茎尖脱毒方法所存在的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能有效脱除马铃薯病毒的方法，以生产无毒种薯。
为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种脱除马铃薯病毒的方
法，包括以下步骤取材料(材料是有可能带病毒的组培苗)，先进行病毒检测，对确定带病毒的材料进行组织培养，然后建立单芽系材料，单芽系是指由同一植株进行组织培养继代所得的一系列材料，可以认为材料的所有生理
和遗传指标是一致的；对所建立的单芽系材料进行扩繁继代培养，随后对单
芽系材料进行超低温保存处理，对超低温保存后成活的材料进行扩繁，然后
再进行病毒检测；选择经检测不带病毒的材料进行繁殖，用于生产无毒种薯。选用继代培养基MS+0. 2 mol L—'6-BA (6苄基嘌呤)+0. 03 mol L_1 IAA(吲哚乙酸)进行增殖培养，培养基pH5.8，培养室温度21-23。C，光照强度(35-45) fimol m—2 s—1，光照时间(10-14) h d—、
所述的超低温保存方法采取的是玻璃化法，在4i:低温锻炼6d，然后放入添加有二甲基亚砜(固SO)和乙酰胺的培养基中预培养3d， 60% PVS2室温装载30min， PVS2 (TC脱水40 min，然后投入液氮进行低温处理，随后对材料进行后期的解冻和恢复培养。
对于经超低温保存成活的材料进行的病毒检测采用的方法是RT-PCR检测
的方法。该方法对于病毒的检测具有反应快、灵敏度高的特点。
本发明的方法是采用超低温保存的方法对材料进行处理，再对成活的材料进行病毒检测，选择对确定不带病毒的材料进行扩繁。采用本发明的方法能够免除传统的茎尖脱毒方法的繁琐工作，而且本发明工艺要求比较低，所用设备也比较简单，相对于传统的脱毒方法具有处理后材料的成活率高及脱毒率高的优点，可以节省大量的人力和财力，如用于产业化生产能够提高经济效益。本发明所建立的脱除马铃薯病毒的方法是基于超低温保存对细胞的选择性破坏作用的原理，结合组织培养和病毒检测技术达到脱毒的目的。分化的、含有病毒的植物细胞液泡较大，液胞中含有的水分也较多，在用液氮进行超低温处理过程中易被形成的冰晶破坏致死，而增殖速度较快的分生组织中液泡较小或不含液泡，因而含水量相对较少，胞质浓，抗冻性强，在用液氮进行超低温处理过程中不宜被冻死，从而得以存活，存活的无毒细胞再生植株，即为脱毒植株。在具体操作方面，不需要如传统的茎尖培养脱毒一
样需在显微镜下剥取微茎尖的方法，而是切取l一2毫米大小的茎尖进行超低温处理，操作难度相对小，且脱毒率较传统茎尖培养要高。
本发明采用液氮超低温处理的方法，使已分化的带有病毒的细胞因低温处理而冻死，而未分化的未带病毒的分生组织细胞得以存活，从而达到脱除马铃薯病毒的目的。本发明的方法操作难度比传统的茎尖脱毒小，而病毒脱除率却高于茎尖培养脱毒，对于茎尖培养难以脱除的一些病毒，该方法也可脱除。具有很好的社会价值和经济价值，有广阔的应用前景。本发明的方法是适用于任何品种的马铃薯。
具体实施例方式
实施例1
本实施例是对"早大白"马铃薯品种进行试验，具体的操作方法为选
5择马铃薯材料，进行扩繁，然后对材料进行病毒检测，检测所采用的方法为RT-PCR法；然后建立单芽系材料，对所建立的单芽系材料进行扩繁继代培养对确定带病毒的材料进行扩繁，以备超低温保存所用，选用继代培养基MS
基本培养基+0. 2 mol L—'6-BA+0. 03 mol L—'IAA进行增殖培养，培养基pH为5. 8，培养室温度为22。C，光照强度为40 jimol m—2 s—\光照时间为12h d—1;当材料扩繁一定数量后进行超低温保存，即采取玻璃化法，在4'C低温条件下锻炼6d ，然后放入添加有二甲基亚砜(DMS0)和乙酰胺的培养基中预培养3d ，预培养基为MS + 50g L—i二甲基亚砜(DMSO)和10g L—i乙酰胺+0. 4 mol L—'蔗糖+0. 7 %琼脂。60% PVS2室温装载30min ， PVS2 (TC脱水40 min ，然后投入液氮在-196'C的温度下进行低温处理，随后对成活的材料进行进一步的病毒检测。对病毒进行检测后，选择经检测不带病毒的材料进行繁殖，用于生产无毒种薯。
实施例2
本实施例是对"郑蔬5号"马铃薯品种进行试验，具体的操作方法为选择马铃薯材料，进行扩繁，然后对材料进行病毒检测，检测所采用的方法为RT-PCR法；然后建立单芽系材料，对所建立的单芽系材料进行扩繁继代培养对确定带病毒的材料进行扩繁，以备超低温保存所用，选用继代培养基MS基本培养基+O. 2mo1 L—16-BA+0. 03 mol L—^AA进行增殖培养，培养基pH为5. 8，培养室温度为23'C，光照强度为38 nmol m—2 s—\光照时间为13h d—、当材料扩繁一定数量后进行超低温保存，即采取玻璃化法，在3。C低温条件下锻炼7d ，然后放入添加有二甲基亚砜(DMS0)和乙酰胺的培养基中预培养4d ，预培养基为MS + 50g L—i二甲基亚砜(DMSO)和10g !^乙酰胺+0. 4 mol L，糖+0.7 %琼脂。60% PVS2室温装载35min， PVS2 (TC脱水45 min，然后投入液氮在-19(TC的温度下进行低温处理，随后对成活的材料进行进一步的病毒检测。
结果显示，经过超低温保存后的材料的成活率可以到达71% ，对于PVY病毒的脱出率在83%左右；而对于传统茎尖脱毒比较难以脱除的PVS病毒的脱除效果比较明显，脱除率在47%左右。而传统的茎尖培养脱毒材料的成活率在
52%左右，且对马铃薯PVY病毒的脱除只有60。/。左右，对于马铃薯PVS病毒的脱 除仅有17%左右。
实验证明对"早大白"和"郑蔬5号"马铃薯品种进行的试验，在对 材料进行前期的病毒检测后，再对确定带病毒的材料进行超低温的脱毒处理， 本发明采用的玻璃化超低温保存的方法有利于马铃薯的病毒脱除，在处理材 料的成活率和病毒的脱出率上都高于传统的茎尖脱毒方法，而且操作简单， 省时、省力，说明了超低温对于病毒的脱除具有很大的影响。
最后所应说明的是以上实施例仅用以说明，而非限制本发明的技术方
案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员 应当理解，依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精 神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1、一种脱除马铃薯病毒的方法，其特征在于包括以下步骤取材料，先进行病毒检测，对确定带病毒的材料进行组织培养，然后建立单芽系材料；对所建立的单芽系材料进行扩繁继代培养，随后对单芽系材料进行超低温保存处理，对超低温保存后成活的材料进行扩繁，然后再进行病毒检测。
2、 根据权利要求1所述的脱除马铃薯病毒的方法，其特征在于选用继代培养基MS+0.2 mol丄"6-BA+0.03 mol'L" IAA进行增殖培养，培养基pH 5.8，培养室温度21—23'C，光照强度(35—45) pmol'm—2^ ,光照时间(10-—14) h/d。
3、 根据权利要求1所述的脱除马铃薯病毒的方法，其特征在于所述的超低温保存方法采取的是玻璃化法，材料在2—5'C低温锻炼4一8 d，在添加 二甲基亚砜(DMSO)和乙酰胺的培养基中预培养2—4 d ， 60%PVS2室温装载 25_35 min , PVS2 (TC脱水35—45 min ,然后投入液氮进行低温(-200°C— -190°C)处理，随后对材料进行后期的解冻和恢复培养。
4、 根据权利要求1所述的脱除马铃薯病毒的方法，其特征在于对于经 超低温保存成活的材料进行的病毒检测采用的方法是RT-PCR检测的方法。
5、 根据权利要求l一4中任一条所述的脱除马铃薯病毒的方法，其特征 在于对病毒进行检测后，选择经检测不带病毒的材料进行繁殖，用于生产 无毒种薯。
全文摘要
本发明公开了一种脱除马铃薯病毒的方法，包括以下步骤取材料，先进行病毒检测，对确定带病毒的材料进行组织培养，然后建立单芽系材料；对所建立的单芽系材料进行扩繁继代培养，随后对单芽系材料进行超低温保存处理，对超低温保存后成活的材料进行扩繁，然后再进行病毒检测；选择经检测不带病毒的材料进行繁殖，用于生产无毒种薯。本发明的方法操作难度比传统的茎尖脱毒小，而病毒脱除率却高于茎尖培养脱毒，对于茎尖培养难以脱除的一些病毒，该方法也可脱除。具有很好的社会价值和经济价值，有广阔的应用前景。
文档编号A01N3/00GK101518203SQ200910064628
公开日2009年9月2日 申请日期2009年4月13日 优先权日2009年4月13日
发明者何艳霞, 先 曲, 李忠爱, 王子成 申请人:河南大学