专利名称：一种用于寒区嗜菌异小杆昆虫病原线虫冷冻储存方法
技术领域：
本发明涉及生物冷冻储存技术领域，具体地说是一种用于寒区嗜菌异小杆 (Heterorhabditis bacteriophora)昆虫病原线虫的变温冷冻储存方法。
背景技术：
众所周知，昆虫病原线虫(Entomopathogenic nematodes)是20世纪初发展起来 的一种很有潜能的生物防治因子，是指体内携带具有病原性的共生细菌，能引起昆虫致病 的一类寄生性线虫。已经成功用于防治蛴螬、蘑菇蝇、小木蠹蛾、荔枝拟木蠹蛾、光肩星天牛 和柑橘象鼻虫等250余种害虫。正是因为昆虫病原线虫具有广谱、高效且对人畜和环境安 全等特点，美国、澳大利亚、德国、新西兰、加拿大、日本、俄罗斯和荷兰等40多个国家投入 了大量的人力和财力，进行了大量的线虫基础理论、田间应用以及产品开发等方面研究，使 得昆虫病原线虫的应用和繁殖技术得到了飞速发展。昆虫病原线虫的储存是目前昆虫病原 线虫领域研究的热点。通常昆虫病原线虫采取低温储存方式保存，一般在8-14°C下可以存 放2-4个月，储存期短、长途运输困难、存活率低和致病力弱，从而限制了昆虫病原线虫的 生产规模和应用面积；液氮可用于保存昆虫病原线虫，但批量储存产品成本高又不方便。目 前多数商品化的线虫不耐低温，如果把新鲜的线虫直接放到0°C以下，线虫会因体细胞内形 成冰核使细胞破裂致死。
发明内容
本发明的目的是为了解决传统的0°C以上的低温储存昆虫病原线虫存在储存期 短、长途运输困难、存活率低和致病力弱的问题，提供一种用于寒区嗜菌异小杆属昆虫病原 线虫冷冻储存方法。一种用于寒区嗜菌异小杆昆虫病原线虫冷冻储存方法具体操作步骤如下步骤一、准备储存介质和储存袋储存介质为蛭石，将蛭石过40-60目筛，去掉碎 末，保持通气性，然后121°C湿热灭菌25-30min，加水至蛭石含水量为45-60% ；储存袋为 80-100目的尼龙网袋，大小为10 X 20cm，将储存介质放入储存袋中；步骤二、接种将10°C保存的新繁殖出来的昆虫病原线虫(侵染期幼虫IJs)接种 到储存介质蛭石中；按104_5IJs/g蛭石的剂量接种侵染期幼虫；步骤三、变温冷冻储存接种后的蛭石放入冰箱，置于4_5°C环境中24h，之后 以1°C /lOmin的速度降温到_11，并在-11恒温311，然后再以1 °C /lOmin的速度降温 到-4-5°C，并在-4-5°C保存；即完成昆虫病原线虫的冷冻储存；步骤四、解冻以1°C /7min的速度升温至4°C，4°C停留lh后，再置于室温解冻 24h，备用；步骤五、线虫的分离将装有蛭石的尼龙网袋置于15_25°C水中浸泡，取出尼龙网 袋后，浸泡液即为线虫悬浮液，可用于防治应用。所述昆虫病原线虫为高寒地区土壤中分离、筛选出的嗜菌异小杆昆虫病原线虫。
所述冰箱为具有变温区可调温的冰箱，可以实现变温冷冻。技术效果本发明方法打破了当前昆虫病原线虫生产规模和应用面积的局限性， 储存期达到5-6个月，解冻后线虫存活率达80%以上，储存介质中线虫回收率达90%，对目 标害虫致病力高于低温储存前，防治地下害虫效果达到80%以上。解决了不利长途运输和 0°C以上的长期储存使线虫致病力明显下降的难题，实现了农业生产实践中害虫生物防治 的良好效果。
具体实施例方式一种用于寒区嗜菌异小杆昆虫病原线虫冷冻储存方法，对储存介质接种侵染期线 虫后，将储存袋置于冰箱中，通过变温冷冻，得到昆虫病原线虫最佳冷冻储存条件。本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式用于寒区嗜菌异小杆昆虫病原线虫冷冻储存方法的 具体操作步骤如下步骤一、准备储存介质和储存袋储存介质为蛭石，将蛭石过40-60目筛，去掉碎 末，保持通气性，然后121°C湿热灭菌25-30min，加水至蛭石含水量为45-60% ；储存袋为 80-100目的尼龙网袋，大小为10 X 20cm，将储存介质放入储存袋中；步骤二、接种将10°C保存的新繁殖出来的昆虫病原线虫(侵染期幼虫IJs)接种 到储存介质蛭石中；按104_5IJs/g蛭石的剂量接种侵染期幼虫；步骤三、变温冷冻储存接种后的蛭石放入冰箱，置于4_5°C环境中24h，之后 以1°C /lOmin的速度降温到_11，并在-11恒温311，然后再以1 °C /lOmin的速度降温 到-4-5°C，并在-4-5°C保存；即完成昆虫病原线虫的冷冻储存；步骤四、解冻以1°C /7min的速度升温至4°C，4°C停留lh后，再置于室温解冻 24h，备用；步骤五、线虫的分离将装有蛭石的尼龙网袋置于15_25°C水中浸泡，取出尼龙网 袋后，浸泡液即为线虫悬浮液，可用于防治应用。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中蛭石过50目 筛。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式的具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中尼龙网袋为 80目。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中蛭石含水量为 50%。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中121°C湿热灭 菌30min。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中昆虫病原线虫 按104IJs/g蛭石的剂量接种侵染期幼虫。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤五中浸泡装有蛭石 的尼龙网袋的水温为20°C。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
八本实施方式用于寒区嗜菌异小杆昆虫病原线虫冷冻储存方法的 具体操作步骤如下步骤一、准备储存介质和储存袋储存介质为蛭石，将蛭石过50目筛，去掉碎末， 保持通气性，然后121°C湿热灭菌30min，加水至蛭石含水量为50% ；储存袋为80目的尼龙 网袋，大小为10 X 20cm，将储存介质放入储存袋中；步骤二、接种将10°C保存的新繁殖出来的昆虫病原线虫(侵染期幼虫IJs)接种 到储存介质蛭石中；按104IJs/g蛭石的剂量接种侵染期幼虫；步骤三、变温冷冻储存接种后的蛭石放入冰箱，置于4_5°C环境中24h，之后 以1°C /lOmin的速度降温到_11，并在-11恒温311，然后再以1 °C /lOmin的速度降温 到-4-5°C，并在-4-5°C保存；即完成昆虫病原线虫的冷冻储存；步骤四、解冻以1°C /7min的速度升温至4°C，4°C停留lh后，再置于室温解冻 24h，备用；步骤五、线虫的分离将装有蛭石的尼龙网袋置于20°C水中浸泡，取出尼龙网袋 后，浸泡液即为线虫悬浮液，可用于防治应用。2006年1月-2007年12月，发明人从高寒地区——黑龙江省哈尔滨市林下土壤中 分离、筛选的高致病力嗜菌异小杆(Heterorhabditis bacteriophora)昆虫病原线虫，2007 年1月至2008年12月按以上实施方式进行了冷冻储存探索性试验研究，获取了我国寒区 高致病力寒区异小杆属昆虫病原线虫变温冷冻储存的成功。解冻后线虫存活率80%以上， 对大蜡螟和地下害虫的致病力明显高于刚繁殖出来的新鲜线虫，储存介质中线虫回收率达 90%，防治地下害虫效果达到80%以上，既获得了经济效益，又获得了生态效益。高寒地区土壤中的嗜菌异小杆昆虫病原线虫均可以采用此方法进行冷冻储存。本发明寒区嗜菌异小杆(Heterorhabditis bacteriophora)昆虫病原线虫广泛应 用于盆栽作物、经济作物、蔬菜、牧草、草坪等地下害虫防治和果树、观赏园林等林木上隐蔽 性害虫防治。
权利要求
一种用于寒区嗜菌异小杆昆虫病原线虫冷冻储存方法，其特征在于冷冻储存方法按以下步骤操作步骤一、准备储存介质和储存袋储存介质为蛭石，将蛭石过40-60目筛，去掉碎末，然后121℃湿热灭菌25-30min，加水至蛭石含水量为45-60％；储存袋为80-100目的尼龙网袋，将储存介质放入储存袋中；步骤二、接种将10℃保存的新繁殖出来的昆虫病原线虫接种到储存介质蛭石中；按104-5IJs/g蛭石的剂量接种侵染期幼虫；步骤三、变温冷冻储存接种后的蛭石放入冰箱，置于4-5℃环境中24h，之后以1℃/10min的速度降温到-1℃，并在-1℃恒温3h，然后再以1℃/10min的速度降温到-4--5℃，并在-4--5℃保存；即完成昆虫病原线虫的冷冻储存；步骤四、解冻以1℃/7min的速度升温至4℃，4℃停留1h后，再置于室温解冻24h；步骤五、线虫的分离将装有蛭石的尼龙网袋置于15-25℃水中浸泡，取出尼龙网袋后，浸泡液即为线虫悬浮液。
2.根据权利要求1所述的一种用于寒区嗜菌异小杆昆虫病原线虫冷冻储存方法，其特 征在于步骤一中所述蛭石过50目筛。
3.根据权利要求1所述的一种用于寒区嗜菌异小杆昆虫病原线虫冷冻储存方法，其特 征在于步骤一中所述尼龙网袋为80目。
4.根据权利要求1所述的一种用于寒区嗜菌异小杆昆虫病原线虫冷冻储存方法，其特 征在于步骤三中蛭石含水量为50%。
5.根据权利要求1所述的一种用于寒区嗜菌异小杆昆虫病原线虫冷冻储存方法，其特 征在于步骤一中所述121°C湿热灭菌30min。
6.根据权利要求1所述的一种用于寒区嗜菌异小杆昆虫病原线虫冷冻储存方法，其特 征在于步骤二中所述寒区异小杆属按104IJs/g蛭石的剂量接种侵染期幼虫。
7.根据权利要求1所述的一种用于寒区嗜菌异小杆昆虫病原线虫冷冻储存方法，其特 征在于步骤五中浸泡装有蛭石的尼龙网袋的水温为20°C。
全文摘要
一种用于寒区嗜菌异小杆昆虫病原线虫冷冻储存方法，它涉及生物冷冻储存技术领域。它解决了传统的0℃以上的低温储存昆虫病原线虫存在储存期短、长途运输困难、存活率低和致病力弱的问题。冷冻储存方法操作步骤1)准备储存介质和储存袋；2)接种；3)变温冷冻储存；4)解冻；5)、线虫的分离。本发明利用高寒地区特有的寒区嗜菌异小杆(Heterorhab ditis bacteriophora)昆虫病原线虫进行变温冷冻储存，打破了当前昆虫病原线虫生产规模和应用面积的局限性，储存期达到5-6个月，储存介质中线虫回收率达90％，解冻后线虫存活率80％以上，防治地下害虫效果达到80％以上，解决了不利长途运输和0℃以上的长期储存使线虫致病力明显下降的难题，实现了农业生产实践中害虫生物防治的良好效果。
文档编号A01N1/02GK101856015SQ20091007175
公开日2010年10月13日 申请日期2009年4月9日 优先权日2009年4月9日
发明者李春杰, 许艳丽 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所