专利名称：一种药用植物北五味子体细胞胚发生和植株再生方法
技术领域：
本发明涉及一种药用植物的体细胞胚胎发生和植株再生方法，具体说是关于北五 味子的体细胞胚胎发生和植株再生的方法。
背景技术：
天然药用植物资源是自然界留给人类的宝贵财富，是人类赖以生存的物质基础。 随着人口的增长和人类对药用植物需求的增加，人类对野生植物资源进行了掠夺性开发， 造成许多植物资源面临枯竭的局面。因此，深入研究天然药用植物并通过对细胞、组织或器 官进行培养以满足人类对天然产物的巨大需求，已经成为植物生物技术领域的研究热点之 一，其中体细胞胚胎发生作为成熟的生物技术手段广泛用于植物快速繁殖。体细胞胚胎快速繁殖的优势在于具有形成完整植株速度快、数量大、结构完整且 同步性易于控制等特点，利用体细胞胚胎发生进行树种的人工种子育苗，可成为未来人工 林苗木来源的一个重要途径。胚性培养物是原生质体的重要来源，可用于树种的遗传转化 及体细胞杂交等研究，达到改良森林树种的目的。在基因工程，种质保存，苗木快速繁殖，人工种子，杂种合子胚的挽救，体细胞杂种 和单倍体，三倍体等植株的诱导培养，细胞诱发突变个体的选择和育种等诸多方面均有广 阔的应用前景，不仅在科研上有着重要的意义，而且在生产实践中有着巨大的经济价值。北五味子(Schisandra chinensis Baill)为五味子科五味子属多年生落叶木质 藤本，主要分布在东亚，我国为本属植物的现代分布中心，野生资源主要分布在吉林、辽宁 和黑龙江等地区。以辽宁、吉林所产的质量较佳，有“辽五味”之称。五味子的果实及种子 均可入药，始载于《神农本草经》。茎皮可作调料、香料，果实可制作饮料等，开发前景广阔。 近年来，国内外市场对五味子的需求量一直呈上升趋势。大量无计划掠夺式采收，造成野生 资源下降和枯竭，现已经被列入《国家重点保护野生药材物种名录》中，五味子被列为三级 保护种。为了可持续发展，五味子人工栽培技术已经成为研究热点，主要采用无性繁殖和有 性繁殖进行生产。有性繁殖主要采用种子进行繁殖，北五味子种子有长达5 6个月的休 眠期，在休眠期内必须对种子进行处理方可发芽。用砂藏层积的方法打破种子的休眠大约 需要3 4个月时间，为生产带来了不便。无性繁殖多用扦插，但扦插生根困难，无法大量 繁殖种源。目前采用组织培养的方法进行五味子快速繁殖，已有一些报道。例如用五味子的 茎段、叶片等作为外植体诱导愈伤组织并分化芽，但增殖倍数低，只有3. 2倍。Kim等用五 味子种子的成熟胚诱导胚状体进行植株再生，在添加2，4-D(9. 04umol/L)+ZT(0. 09umol/L) 的MS培养基中形成的胚性愈伤组织最多(32% )，体细胞胚数也最多在Ig胚性愈伤组织 产生61. 7个体细胞胚，无法满足大规模生产的需要。smiskova等用五味子种子的未成熟 胚诱导胚状体，认为30umol/L ABA中球形胚发生频率是最高的，但是每IOOmg胚性愈伤组 织产生的体细胞胚数不足10个，因而不能应用于生产。李成浩等用北五味子的子叶、下胚 轴等诱导胚状体，在附加4mg/L 2，4-D的MS培养基上，下胚轴诱导的胚性愈伤组织率最高(18. 3% )，每Img胚性愈伤组织产生的体细胞胚数最多才为116个，这也很难应用于生产。 可见五味子的体细胞胚胎发生非常困难，外植体的胚性反应低，且受基因型、季节、培养条 件等多因素的影响而具有不稳定性；诱导获得的胚性愈伤组织只有较少能建立理想的具有 再生能力的ESC;虽然可诱导获得大量的体细胞胚，但萌发率和植株再生率低等问题制约 了其应用。因此，进一步改善外植体的胚性反应、提高体细胞胚的质量和植株转换率成为研 究的重点。TDZ是一种人工合成的苯基脲类化合物，它能替代生长素和细胞分裂素促进许多 植物的体胚发生，并且比这些植物激素诱导体胚发生的速度更快，许多难于再生植株的植 物采用TDZ可成功地获得体细胞胚及再生植株。TDZ既可以在愈伤组织诱导阶段起作用，也 可以在体胚诱导、发育或萌发阶段起作用。在离体条件下用有点诱导体细胞胚胎的形成，这 种离体条件下能克服种子发芽率低及需要沙藏的问题，提高了胚状体诱导率，也为五味子 优良无性系繁殖提供新的技术途径，为五味子基因保存、遗传改良奠定基础。
发明内容
本发明的目的是针对目前我国北五味子通过种子的成熟胚诱导胚状体的空白以 及体细胞胚诱导率低、诱导周期长等问题，提供一种在离体条件下用植物生长调节剂诱导 北五味子的体细胞胚胎的形成和植株再生的方法。完成上述发明目的所采取的具体技术措施是A、取北五味子种子进行消毒杀菌预处理，将完整成熟胚剥离出来接种到附加生长 调节剂，质量体积比为3 %蔗糖和0. 7 %琼脂的MS培养基上，在培养温度为23 士 1 °C，相对湿 度70%，暗培养6 10周，进行愈伤组织的诱导；B、将愈伤组织转入到附加生长调节剂，质量体积比为3%蔗糖和0.7%琼脂的 1/2MS培养基上，在培养温度23士 TC，光周期为16小时光照/8小时黑暗的条件下培养 25 40天，进行胚性愈伤组织和胚状体的诱导；C、将子叶期的体细胞胚分离出来，在与第B步相同的培养基上继代培养四周，得 到再生植株；D、将再生植株进行炼苗，然后移栽，即得北五味子苗。在上述步骤A中的生长调节剂选用下述中的一种0. 5 llmg/L的2，4_D、0. 1 2. Omg/L 的 TDZ。在上述步骤B中的生长调节剂选用下述中的一种或两种0 2. Omg/L 2，4_D、 0· 1 2. Omg/L TDZ、0. 1 0. 3mg/L ZT。在上述步骤A中的北五味子种子进行消毒杀菌预处理是将北五味子种子用流水 冲洗4小时，放入浓度为70%酒精中表面消毒30s，再放入0. 升汞溶液中消毒8min，然 后用无菌水冲洗4 6遍。在上述步骤A中生长调节剂选用2. Omg/L的2，4_D。在上述步骤A中生长调节剂选用1. Omg/L的TDZ。在上述步骤B中的生长调节剂选用2. 0mg/L的2，4_D和0. 2mg/L的ZT。在上述步骤B中的生长调节剂选用1. 0mg/L的TDZ和0. 2mg/L的ZT。在上述步骤D中，在移栽时，将长有三四片叶小苗的根在流水下冲洗，去掉培养
4基；然后转移至含有灭过菌的珍珠岩和草炭的小容器中，珍珠岩和草炭的重量比1 3，浇 水保湿直至长出新叶。本发明的优点是在离体条件下用植物生长调节剂诱导体细胞胚胎的形成，克服 了种子发芽率低及需要沙藏的问题，提高了胚状体诱导率，为五味子优良无性系繁殖提供 新的技术途径，也为五味子基因保存、遗传改良奠定基础。
图1A、B、C、D、E、F是不同激素诱导的胚状体组织块照片(图IA 胚；图IB 胚性 愈伤组织；图IC 球形胚；图ID 心形胚；图IE 马蹄形胚；图1F:子叶形胚)。图2A、B、C是体细胞胚萌发、植株形成、移栽照片(图2A 体细胞胚萌发；图2B 植 株形成；图2C: 土壤移栽)。
具体实施例方式实施例1 A、将北五味子成熟种子用流水冲洗四小时，放入浓度为70%酒精中表面消毒 30s,再放入0. 1 %升汞水溶液中消毒8min，然后用无菌水冲洗4 6遍。然后将成熟胚 剥离出来分别接种到附加生长调节剂0. 5 llmg/L的2，4-D(氯化苯氧乙酸)或0. 1 2. Omg/L的TDZ (噻苯隆)，质量体积比为3%蔗糖和0. 7%琼脂的MS培养基上，在培养温度 为23 士 1 °C，相对湿度70 %，暗培养6 10周，进行愈伤组织的诱导。B、将愈伤组织转入到附加生长调节剂O 2. Omg/L 2，4_D、0. 1 2. Omg/L TDZ, 0. 1 0. 3mg/L ZT任意一种或者任意两种组合的1/2MS培养基上，其中附加质量体积比3% 蔗糖和0. 7%琼脂，在培养温度23士 1°C，光周期为16小时光照/8小时黑暗的条件下培养 25 40天，进行胚性愈伤组织和胚状体的诱导；C、将子叶期的体细胞胚分离出来，在与B步的相同培养条件下，相同的培养基上 继代四周，得到完整植株；D、将再生植株进行炼苗，然后移栽。在移栽时，将长有三四片叶小苗的根在流水下 冲洗，去掉培养基；然后转移至含有灭过菌的珍珠岩和草炭混合基质的小容器中，珍珠岩和 草炭的重量比1 3，用薄塑料布制作一个小拱棚，浇水保湿直至长出新叶，即得北五味子 苗。拿掉塑料袋，植株成活率高达90%以上。实施例2 本实施方式与实施例1的不同点是步骤A中培养基里附加生长调节剂0. 5 llmg/L2，4-D。其中，附加2，4_D的最佳浓度为2. Omg/L。其他步骤与实施例1相同。实施例3 本实施方式与实施例1的不同点是步骤A中的培养基里附加生长调节剂0. 1 2. Omg/L TDZ0其中，附加TDZ的最佳浓度为1. Omg/L。其他步骤与实施例1相同。通过测试选用每升培养基中加入2. Omg/L 2，4-D，1. Omg/L TDZ。2，4_D，TDZ浓度 对愈伤组织诱导率影响的测试结果如表1 表1 2，4-D，TDZ对愈伤组织诱导率的影响 从此表中可以看出愈伤组织诱导率最高达94. 7%。实施例4 本实施方式与实施例1的不同点是步骤B中的培养基里附加生长调节剂2. Omg/ L2，4-D和0. 1 0. 3mg/L ZT。其中，附加生长调节剂最佳组合为2. Omg/L 2，4_D和0. 2mg/ LZT。其他步骤与实施例1相同。实施例5 本实施方式与实施例1的不同点是步骤B的培养基里附加生长调节剂1. Omg/L TDZ和0. 1 0. 3mg/LZT。其中，附加生长调节剂最佳组合为1. Omg/L TDZ和0. 2mg/L ZT, 其他步骤与实施例1相同。2，4-D，TDZ, ZT浓度对胚状体影响的测试结果如表2表2 2，4-D，TDZ, ZT对胚性愈伤组织和胚状体诱导的影响
6 胚性愈伤组织诱导率最高达54. 3%，每克胚性愈伤组织产生的体细胞胚最高为 81. 67 个。
权利要求
一种药用植物北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征是具体措施如下A、取北五味子种子进行消毒杀菌预处理，将完整成熟胚剥离出来接种到附加生长调节剂，质量体积比为3％蔗糖和0.7％琼脂的MS培养基上，在培养温度为23±1℃，相对湿度70％，暗培养6～10周，进行愈伤组织的诱导；B、将愈伤组织转入到附加生长调节剂，质量体积比为3％蔗糖和0.7％琼脂的1/2MS培养基上，在培养温度23±1℃，光周期为16小时光照/8小时黑暗的条件下培养25～40天，进行胚性愈伤组织和胚状体的诱导；C、将子叶期的体细胞胚分离出来，在与第B步相同的培养基上继代培养四周，得到再生植株；D、将再生植株进行炼苗，然后移栽，即得北五味子苗。
2.根据权利要求1所述的药用植物北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征 是步骤A中的生长调节剂选用下述中的一种0. 5 llmg/L的2，4_D、0. 1 2. Omg/L的 TDZ。
3.根据权利要求1所述的药用植物北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征 是步骤B中的生长调节剂选用下述中的一种或两种0 2. Omg/L 2，4-D、 0. 1 2. Omg/L TDZ、0· 1 0. 3mg/L ZT。
4.根据权利要求1所述的药用植物北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征 是步骤A中的北五味子种子进行消毒杀菌预处理是将北五味子种子用流水冲洗四小时， 放入浓度为70%酒精中表面消毒30s，再放入0. 升汞溶液中消毒8min，然后用无菌水冲 洗4 6遍。
5.根据权利要求2所述的药用植物北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征 是步骤A中生长调节剂选用2. Omg/L的2，4-D。
6.根据权利要求2所述的药用植物北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征 是步骤A中生长调节剂选用1. Omg/L的TDZ。
7.根据权利要求3所述的药用植物北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征 是步骤B中的生长调节剂选用2. 0mg/L的2,4-D和0. 2mg/L ZT。
8.根据权利要求3所述的药用植物北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征 是步骤B中的生长调节剂选用1. 0mg/L的TDZ和0. 2mg/L ZT。
9.根据权利要求1所述的药用植物北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征 是在步骤D中，在移栽时，将长有三四片叶小苗的根在流水下冲洗，去掉培养基；然后转移 至含有灭过菌的珍珠岩和草炭的小容器中，珍珠岩和草炭的重量比1 3，浇水保湿直至长 出新叶。
全文摘要
一种药用植物北五味子体细胞胚发生和植株再生方法，其特征是A、取北五味子种子进行消毒杀菌预处理，将完整成熟胚剥离出来接种到附加生长调节剂，质量体积比为3％蔗糖和0.7％琼脂的MS培养基上，在培养温度为23±1℃，相对湿度70％，暗培养6～10周，进行愈伤组织的诱导；B、将愈伤组织转入到附加生长调节剂，质量体积比为3％蔗糖和0.7％琼脂的1/2MS培养基上，在培养温度23±1℃，光周期为16小时光照/8小时黑暗的条件下培养25～40天，进行胚性愈伤组织和胚状体的诱导；C、将子叶期的体细胞胚分离出来，在与第B步相同的培养基上继代培养四周，得到再生植株；D、将再生植株进行炼苗，然后移栽，即得北五味子苗。本发明的优点是在离体条件下用植物生长调节剂诱导体细胞胚胎的形成，克服了种子发芽率低及需要沙藏的问题，提高了胚状体诱导率，为五味子优良无性系繁殖提供新的技术途径，也为五味子基因保存、遗传改良奠定基础。
文档编号A01H4/00GK101904302SQ201010224079
公开日2010年12月8日 申请日期2010年7月13日 优先权日2010年7月13日
发明者傅俊范, 朴钟云, 李宏博, 郎文香 申请人:沈阳农业大学