专利名称：一株水稻纹枯病菌生防菌rs-bc及微生物菌剂与制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及ー种用于水稻纹枯病生物防治的菌株RS-BC的分离鉴定，含有该生防菌株的微生物菌剂，其制备方法及在防治水稻纹枯病中的应用。
背景技术：
水稻是世界上种植面积最大的作物，其种植面积达I. 54亿公顷，占世界耕地面积的11%，稻米也是全球至少半数人口的基本食物。在我国水稻的播种面积占全部农作物播种面积的20%，是我国最主要的粮食作物，也是第一大农作物，40%以上人口的主食是稻米，稻米消费量占全国粮食消费量的40%左右。但病虫害的严重降低水稻的产量和品质， 其中水稻纹枯病是水稻上的ー种重要病害，在水稻种植国家如中国、印度、日本等亚洲国家(Roy, 1993)以及美国(Lee and Rush, 1983)和非洲国家(Premalatha, 1990)普遍发生。由于水稻种植密度大、生长周期短，氮肥施用量大(Groth and Lee, 2002 ；Savary, 1995)为水稻纹枯病的发生创造了良好的小生态环境。此病在我国最早由魏景超于1934年报道，1975年被列为全国的防治对象，成为水稻三大病害之一(廖皓年等，1997)。目前发病面积以及危害损失居水稻病害首位。水稻纹枯病一般可使水稻减产10-30%,严重时可达50%以上，给我国的农业经济造成了重大的损失，而且为害逐年加重。引起水稻纹枯病的病原菌无性阶段为立枯丝核菌(Rhizoctonia solaniKUhn)，在分类上属于半知菌亚门、丝孢纲、无孢目、丝核菌属。有性阶段为瓜亡革菌(Thanatephorus cucumerisDonk),属于担子菌亚门。根据菌丝融合现象立枯丝核菌分为14个融合群(Sneh et al. , 1991),水稻纹枯病菌属于AG1-IA,它是ー类重要的病原真菌，寄主范围非常广泛，可以侵染水稻、玉米、小麦等重要农作物以及几乎所有的蔬菜(George，1997)。此外，由立枯丝核菌引起的纹枯病是世界性分布的病害。水稻纹枯病菌不产生无性孢子，以菌丝或菌核形态存在并作为侵染水稻的初侵染源，是ー种较顽固的土壤习居菌，所产生的休眠体菌核可以在土壌中越冬并且长期存活，在室温下保存11年仍然有12%的萌发率，而且菌核无休眠期和后熟期，当年在适宜的条件下即可萌发侵染致病，不同发育阶段的菌核均能萌发致病且形成新的菌核，另外菌核有多次萌发和地下侵染的能力(檀根甲等，2000)，菌核的这些特性都为防治带来了非常复杂的问题。目前应用化学杀菌剂仍然是防治水稻纹枯病的有效手段，然而其具有不可弥补的缺陷使用广谱性的杀菌剂致使土壤环境污染，病原菌产生抗药性，危害非靶标生物，并导致农药残留等一系列的问题，不利于推行緑色环保无公害作物种植和农业的可持续发展，因此寻找ー种安全、有效的替代措施防治纹枯病十分必要。利用有益微生物和农业栽培措施防治纹枯病菌是替代化学农药的两种安全有效的途径(Jacobsen and Backman, 1993)。传统的农业栽培措施防治纹枯病菌，需要大量的人力物力，而且为了追求水稻的高产，采用了高产、多蘖良种以及推广抛秧、高密度、施用高氮肥的栽培技术，为病原菌创造了适宜的生长环境，致使农业栽培措施防治困难重重。利用有益微生物防治纹枯病菌是ー种安全有效的防治措施，可以维持生态环境的平衡，逐渐受到人们的重视。虽然目前已经发现了ー些对纹枯病菌有寄生或拮抗作用的真菌(Jayaprakashvel et al. ,2010)、细菌(Sevdalinaet al. ,2010)和放线菌(Wanet al.，2008)，但不同的拮抗微生物作用机理及使用方法不同，针对不同的生产应用需求难免出现一定的局限性，因此筛选更多更有效生防菌尤为重要。迄今为止未见有涉及本发明主题的相关文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，其发明的第一个目的是分离筛选ー株对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)具有显著生物防治效果的生防菌株RS-BC(细菌)。该菌株经过发酵后可产生具有強烈抑菌作用、有耐酸碱性、对温度不敏感等活性代谢产物，该活性代谢产物可用于制备广谱行防治植物真菌病害的生物制剂，可用于植物真菌病害的生物防治，尤其是制备成生防菌剂用于水稻纹枯病的防治。以此采用生物防治策略防治纹枯病菌，可以大大减少化学药剂的使用。 本发明的第二个目的是包含所述的生防菌株的微生物菌剂的开发。本发明的第三个目的是制备所述生防菌微生物菌剂的方法。本发明的第四个目的是上述菌株和菌剂的应用。本发明通过以下技术方案实现本发明从田间水稻纹枯病病斑上产生的菌核表面分离筛选获得ー株适用于水稻纹枯病防治的生防细菌伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)菌株RS-BC,其在PDA培养基上的菌落形态如图I所示，该菌株于2011年2月24日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(英文简称CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NOM2011049。申请人:利用发酵方法制备了ー种对水稻纹枯病具有防治作用的微生物菌剂，其步骤包括申请人:提供了ー种防治水稻纹枯病的微生物菌剂的制备方法，其包括以下步骤I)生防菌发酵液制剂制备将保藏编号为CCTCC NO M2011049的生防菌株RS-BC在PDA培养基上划线培养，挑取单菌落接于含有2ml液体PDB培养基的试管中，于28で，220rpm摇床上培养，至OD6tltl值达到O. 5-0. 8，取上述菌液按体积比为I : 100的比例接种到新鲜PDB培养基上继续于28°C摇床上培养，振荡培养48h后用于制备菌剂，使菌液浓度为101QCfu/ml，该菌液称为生防菌RS-BC的发酵菌液A ；2)生防菌无菌发酵液制备将步骤I)的生防菌菌液于4°C，IOOOOrpm离心lOmin，收集上清液于60°C处理20min或用孔径为O. 22 μ m的细菌过滤器过滤后，制得无菌发酵液B ；3)将步骤2)中离心获得的菌体沉淀，用无菌水洗涤3次后，再用与发酵液等体积的PDB培养基重新悬浮沉淀，形成菌体悬浮液C，该菌体悬浮液C浓度与菌液A相当，约为1010cuf/ml ο4)向所述发酵菌液A或无菌发酵液B或菌体悬浮液C，分别加入吐温-20，使发酵菌液A或无菌发酵液B或菌体悬浮液C中的吐温-20的终浓度至O. 025%，即得到菌体浓度为101(lCfu/ml的伯克霍尔德氏菌菌株RS-BC发酵菌液A ;不含伯克霍尔德氏菌菌株RS-BC的发酵液B ;菌体浓度为101(lCfu/ml的伯克霍尔德氏菌菌株RS-BC的菌体悬浮液C ；其中步骤I)的PDA和PDB培养基以及步骤3)的PDB培养基的组分及配比如下PDA培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至7. O,在121°C高压蒸汽灭菌30min ； PDB培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，补充蒸馏水至IOOOml，调pH至7. 0，在121 °C高压蒸汽灭菌30min。
申请人应用上述微生物菌剂对离体、盆栽和田间栽培条件下的水稻纹枯病进行了生物防治试验，均达到了预期的效果。更详细的技术方案见《具体实施方式
》的内容。
序列表SEQ ID NO 1是伯克霍尔德氏菌菌株RS-BC的16S rDNA基因序列。图I.是本发明分离筛选的生防菌菌株RS-BC对水稻纹枯病菌菌株WH-I的拮抗作用和对照。图IA显示了 RS-BC菌株在PDA培养基上对水稻纹枯病菌菌株WH-I的拮抗作用；图IB是对照(未接种RS-BC菌株)。图2.是本发明分离筛选的生防菌菌株RS-BC对稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、链格抱菌(Alternaria alternata)、灰霉菌(Botrytis cinerea)、炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioiaes)、棉枯 _ 病菌(Fusarium oxysporum ノ、玉米大斑炳菌(Helminthosporium turcicum)、核盘 (Sclerotinia sclerotiorumノ ネロ 赤霉 Isi(Gibberella zeae) 8种重要植物病原菌的拮抗效果。图中A1-H1分别是菌株RS-BC对植物病原菌稻瘟病菌、链格孢菌、灰霉菌、炭疽病菌、棉枯萎病菌、玉米大斑病菌、核盘菌、赤霉菌的拮抗作用；A2-H2为相应病原菌的对照。图3.是本发明分离筛选的生防菌菌株RS-BC不同浓度无菌发酵液B对纹枯病菌菌株WH-I生长的抑制作用(28°C，36h)。图中A为清水对照；B*PDA中含有O. 1%无菌发酵液B ;C为PDA中含有I %无菌发酵液B ;D为PDA中含有6%无菌发酵液B。图4.是本发明分离筛选的生防菌株RS-BC所产抗生物质对水稻纹枯病菌菌丝的抑制作用。图中图4A为在PDA上生长纹枯病菌菌株WH-I的菌丝顶端；图4B为在含有I %RS-Bl菌株发酵液的PDA上纹枯病菌菌株WH-I的菌丝顶端；图4C为在含有50 μ g/ml井冈霉素的PDA上生长纹枯病菌菌株WH-I的菌丝顶端。图5.是本发明分离筛选的生防菌株RS-BC所产抗生物质对蛋白酶K敏感性測定。图中图5A为纹枯病菌菌株WH-I在PDA上生长情况；图5B为纹枯病菌菌株WH-I在含有
I%用蛋白酶K处理发酵液的PDA上生长情况；图5C为纹枯病菌菌株WH-I在含有1%发酵液的PDA上生长情況。图6.是生防菌菌株RS-BC无菌发酵液B及菌体悬浮液C对水稻纹枯病的离体试验防治效果。图中图6A为清水对照；图6B为无菌发酵液B防治效果；图6C为菌体悬浮液C防治效果。图7.是本发明分离筛选的生防细菌菌株RS-BC不同菌剂对水稻纹枯病的活体盆栽试验防治效果。图中图7A为无菌发酵菌液B防治效果；图7B为菌体菌体悬浮液C防治效果；图7C为清水对照；
具体实施方案实施例I :菌株的分离及鉴定I、菌株的分离地点及分离方法从湖北省武汉市洪山区獅子山地区华中农业大学水稻试验田水稻茎杆上采集水 稻纹枯菌菌核，将菌核在无菌水中浸泡lmin，然后将水梯度稀释涂在PDA平板上，置于28°C培养。当单菌落长出后，挑取单菌落在PDA平板上进行划线培养，并观察单菌落形态。获得一株细菌菌株将其编号为RS-BC，该菌株在PDA培养基上单菌落为白色，表面光滑，革兰氏染色结果分离的RS-BC菌株为革兰氏阴性菌株。2、菌株的16S rDNA鉴定取上述菌株RS-BC单在菌落在PDB培养基中振荡培养24h(转速200rpm，28°C )，12000rpm离心lmin,弃上清液，收集菌体。加入400 μ I裂解液(40mmo I /LTr i s-HC I,lmmol/LEDTA,l% (w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)，pH7. 8)混匀，置于37°C水浴lh。然后カロ入200 μ 15mol/L的氯化钠溶液,混勻后于13000rpm离心15min。取上清液,用等体积的苯酚/氯仿抽提I次，再用等体积的氯仿抽提I次。加两倍体积无水こ醇，_20°C沉淀过夜后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%こ醇洗2次；室温干燥后，溶于50 μ ITE溶液中，溶解后，利用核酸蛋白測定仪检测其浓度及质量。根据原核微生物16SrRNA通用引物16sRNAF(正向引物)5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和 16sRNAR(反向引物)5' -ACGGTTACC TTG TTA CGA CTT-3'，以菌株RS-BC的基因组DNA为模板进行PCR扩增。50 μ I 0 反应体系10父？0 缓冲液5 4 1，2511111101/1 MgCl23 μ 1，2. 5mmol/L dNTP 2 μ I, IOumol/L16sRNAF 2 μ 1,10umol/L 16sRNAR 2 μ 1，2 μ I 模板DNA(IOOng)，2U Taq聚合酶(宝生物エ程(大连)有限公司)，32 μ I ddH20混匀后，在PCR仪上进行扩增95°C变性3min后，进入PCR循环，每个循环为94°C 30s, 54°C 30s，72°C 2min，共35个循环；然后72°C延伸lOmin。经I %琼脂糖凝胶电泳检测分析PCR扩增結果，扩增片段大小为I. 5kb。应用回收试剂盒将PCR产物回收并连接到pMD18-T上进行序列測定。测序后的序列见序列表SEQ ID NO :1。将测序结果与GenBank(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov)中已知的16S rDNA序列进行同源性比较，发现与伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)(序列登录号AB568313)同源性达到99%，结合菌株单菌落形态及革兰氏染色等，将菌株RS-BC鉴定为伯克霍尔德氏国。上述菌株RS-BC的16S rDNA序列见序列表SEQ ID NO 1所述。专利程序的保藏将已经鉴定为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)的菌株RS-BC于2011年2月24日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(英文简称CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO M2011049o 实施例2 :本发明分离的菌株RS-BC拮抗性分析
釆用对峙培养法测定生防菌RS-BC对纹枯病菌菌株WH-I (Jiaotao Xie, YanpingFu, Daohong Jiang, Guoqing Li， Junbin Huang, Bo Li， Tom Hsiang and YouliangPeng.Intergenic transfer ofribosomal genes between fungi. BMC EvolutionaryBiology. 2008,8 87)的拮抗效果。用接种环蘸取供试菌株RS-BC菌液，然后在PDA平板中央轻轻划线，用无菌水替代菌株RS-BC菌液作对照，每个处理设置三个重复，置37°C培养箱恒温培养12h后，用打孔器在PDA上已活化的水稻纹枯病菌菌株WH-I的菌落边缘取直径为5mm的菌丝块，分别接种于菌株RS-BC的两侧(如图I所示)，在37°C培养箱恒温培养，待对照两侧菌丝充分接触后，測量其抑菌带大小。结果表明菌株RS-BC对纹枯菌菌株WH-I的菌丝生长有显著的抑制作用，抑菌带平均宽度为3. 9cm(如图I所示)。实施例3 :本发明分离的菌株RS-BC拮抗谱测定本实施例的方法同实施例2，由图2可以得出，本发明的菌株RS-BC对稻瘟病菌、链格孢菌、灰霉菌等8种植物重要病原真菌均具有強烈的拮抗作用，其中对棉枯萎病菌抑菌带宽度最小，但仍可达2cm，对稻瘟病菌抑菌带宽度最大，为3. 2cm，表明RS-BC菌株所产生的抗生物质抗菌谱广，在植物病害的防治中有广泛应用的潜能。 实施例4 :本发明分离的菌株RS-BC拮抗机理的初步分析在20ml PDA培养基中分别加入100 μ I 10mg/ml的井冈霉素(购自浙江省桐庐正中生化贸易有限公司，20%可溶性粉剂)和100 μ I的菌株RS-BC发酵液B，用打孔器(直径为5mm)打取纹枯病菌菌丝块接种于PDA平板中央，28°C培养箱培养，24h后挑取纹枯病菌丝体置于显微镜下观察。结果如图4所示，正常菌丝分支近直角，分支处稍有缢缩；而发酵液B和井R霉素拮抗机理相似，经处理的WH-I菌株菌丝体顶端均过度分支，成鸟巢状。说明拮抗细菌对纹枯病菌菌丝有致畸作用，可以有效抑制菌丝扩展。实施例5 :本发明分离的菌株RS-BC拮抗物质理化特性分析本实施例中无菌发酵液B生物活性測定的方法为PDA平板抑菌法，即将无菌发酵液B按不同浓度稀释加入到PDA培养基中，制备PDA平板，在该平板上接种纹枯菌菌株WH-1，作为处理组；不加无菌发酵液B的PDA平板为空白対照，当对照组纹枯菌WH-I菌丝蔓延全皿时(48h)，测量处理组纹枯病菌菌落直径，以抑菌率表示菌株RS-BC产生拮抗物质的活性。所有处理均设置三个重复。抑菌率计算公式如下抑菌率(％ )=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌丝直径X 100。I.不同发酵时间对发酵液生物活性的影响从试管中取500 μ I新鲜培养的菌液接种到50ml液体PDA培养基中于28°C摇床分别振荡培养12h、24h、36h、48h、60h、72h和84h后，不同处理的发酵液B按1% (V/V)加入PDA中，进行生物活性測定。结果如表I所示，当菌株RS-BC培养48h-72h，其发酵液中拮抗物质活性最強，抑菌率为91%以上。因此发酵产物拮抗活性的測定、生防測定等均用培养48h的菌液或发酵液进行。表I不同发酵时间对发酵液中拮抗物质活性的影响[0053」
权利要求
1.ー种防治水稻纹枯病的生防菌株，其特征在于所述的菌株为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)RS-BC,该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO M2011049o
2.包含权利要求I所述的生防菌株的微生物菌剂。
3.ー种防治水稻纹枯病的微生物菌剂的制备方法，其特征包括以下步骤 1)生防菌发酵液制剂制备将保藏编号为CCTCCNO :M2011049的生防菌株RS-BC在PDA培养基上划线培养，挑取单菌落接于含有2ml液体PDB培养基的试管中，于28で，220rpm摇床上培养，至OD6tltl值达到O. 5-0. 8，取上述菌液按体积比为I : 100的比例接种到新鲜PDB培养基上继续于28°C摇床上培养，振荡培养48h后用于制备菌剂，使菌液浓度为1010cfu/ml ； 2)生防菌无菌发酵液制备将步骤I)的生防菌菌液于4°C，IOOOOrpm离心lOmin，收集上清液于60°C处理20min或用孔径为O. 22 μ m的细菌过滤器过滤后，制得无菌发酵液； 3)菌体悬浮液制剂制备将步骤2)中离心获得的菌体沉淀，用与无菌发酵液等体积的PDB培养基重新悬浮沉淀，得到菌体悬浮液制剂； 其中 步骤I)的PDA和PDB培养基以及步骤3)的PDB培养基的组分及配比如下 PDA培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，补充蒸馏水至IOOOml，调pH至7. 0，在121で高压蒸汽灭菌30min ； PDB培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至7.0，在121°C高压蒸汽灭菌30min。
4.权利要求I所述的生防菌株在制备防治水稻纹枯病微生物菌剂中的应用。
5.权利要求2所述菌剂在防治水稻纹枯病中的应用。
全文摘要
本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一种用于水稻纹枯病生物防治的菌株RS-BC的分离鉴定，含有该生防菌株的微生物菌剂，其制备方法及在防治水稻纹枯病中的应用。本发明分离的菌株为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)RS-BC，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM2011049。本发明还包括利用所述的生防菌株RS-BC制备的微生物菌剂，该微生物菌剂的制备方法及在防治水稻纹枯病微生物菌剂中的应用方法。
文档编号A01N63/02GK102676416SQ201110056038
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月9日 优先权日2011年3月9日
发明者付艳苹, 姜道宏, 程家森, 翟秋红, 谢甲涛 申请人:华中农业大学