通过发酵来制备虾青素的方法

专利名称：通过发酵来制备虾青素的方法
技术领域：
本发明涉及通过微生物发酵来制备包含虾青素的类胡萝卜素的方法。
背景技术：
类胡萝卜素是可以用作饲料添加剂、食品添加剂、药品等的天然色素。类胡萝卜素包括例如奸青素(astaxanthin)、角黄素(canthaxanthin)、玉米黄素(zeaxanthin)、卢-隐黄素(卢-cryptoxanthin)、番爺红素(Iycopene)、-胡萝卜素(/ -carotene)、绿蚬黄质(phoenicoxanthin)、金盖花黄质(adonixanthin)、海胆酮(echinenone)、asteroidenone 和 3_ 轻基海胆酮(3_hydroxyechinenone)等。
在类胡萝卜素中，虾青素还可用作养殖鱼即鲑鱼、鳟鱼、海鲷等的体色改善剂或家禽类的蛋黄色改善剂等饲料添加剂。另外，虾青素作为安全的天然食品添加剂或健康食品原料，其产业上的价值高。金盏花黄质和绿蝇黄质的工业制备方法已确立，由此被期待与虾青素一样用作饲料添加剂、食品添加剂、药品等。而且，P-胡萝卜素被用作饲料添加剂、食品添加剂、药品等，角黄素被用作饲料添加剂、食品添加剂、化妆品等，而玉米黄素则被用作食品添加剂、饲料添加剂等。另外，番爺红素、海胆酮、^ -隐黄素、3-轻基海胆酮、asteroidenone等也被期待用作饲料添加剂、食品原料等。作为上述类胡萝卜素的制备方法，已知有化学合成法、从天然物质中提取的方法、利用微生物进行生产的方法等。另一方面，作为奸青素的化学合成法，例如已知有利用β_胡萝卜素进行转换的方法(非专利文献I)和由C15磷盐合成的方法(非专利文献2)。通过该化学合成法制备的虾青素作为饲料添加剂出售。另外，由于虾青素存在于海鲷、鲑鱼等鱼类和虾、蟹、磷虾等甲壳类中，因此还可以从上述鱼类和甲壳类中提取。作为利用微生物来生产虾青素的方法，有人报道了以下方法例如利用绿藻类雨生红球藻iibenmtococcus pluvialis)的培养法(专利文献I)、利用红色酵母红发夫酵母iPhaffia rhodozyma)的发酵法(专利文献2)和利用属于副球菌属(Paracoccus)的细菌(以下，有时称作“副球菌属细菌”)的发酵法。生产虾青素的属于副球菌属的细菌的例子有E-396株和A-581-1株(专利文献3和非专利文献3)。作为其他的虾青素生产性的属于副球菌属的细菌，可以列举马氏副球菌(Paxacoccus marcusii) MHl 株(专利文献 4)、Zkracoccw1S haeundaensis BC74171株(非专利文献4)、副球菌属细菌N-81106株(专利文献5)和副球菌iParacoccus sp.)PC-I株(专利文献6)等。然而，上述类胡萝卜素的制备方法存在几个问题。例如，从安全性的角度考虑，化学合成法带给消费者不好的印象。另外，从虾、蟹等天然物质中提取的制备成本高。而且，通过绿藻类或酵母进行生产时，除生产率低以外，还由于具有坚固的细胞壁，因此类胡萝卜素的提取困难。另一方面，属于副球菌属的细菌具有增殖速度快、生产率高、提取容易等优点，有人报道了该细菌的几种培养方法。例如，专利文献7公开了在培养中途添加铁盐的方法。专利文献8公开了限制碳源浓度的方法。但是，上述培养方法存在着以下问题在生产虾青素的同时，蓄积大量的角黄素。角黄素可以用作鲑鱼肉或鸡蛋蛋黄的颜色改善用饲料添加剂，另一方面，在欧州规定ADI (每天允许摄取的量)为0.03mg/kg体重，规定饲料中可以添加角黄素的上限如下在鲑鱼类中为25mg/kg、在产蛋鸡中为8mg/kg (非专利文献5)。因此，通过微生物生产虾青素时，必须抑制角黄素的含量在低水平。专利文献9公开了通过控制溶氧浓度来减少角黄素的生产的方法。但是，在该方法中，虾青素的生产浓度也显著减少，因此从制备成本的角度考虑并不实用。现有技术文献 专利文献
专利文献I :日本特开2007-97584号公报；
专利文献2 :日本特开平11-69969号公报；
专利文献3 :日本特开平7-79796号公报；
专利文献4 :日本特表2001-512030号公报；
专利文献5 :日本特开2007-244205号公报；
专利文献6 :国际公开第2005/118812号小册子；
专利文献7 :日本特开2007-143492号公报；
专利文献8 :日本特开2008-167665号公报；
专利文献9 :日本特开2001-352995号公报；
非专利文献
非专利文献 I Erich Widmer 等人,“Pure Appl. Chem. ”, 1985 年,第 57 卷,第 741-752
页；
非专利文献 2 Erich Widmer 等人，“Helv. Chim. Acta”, 1981 年，第 64 卷，第2436-2446 页；
非专利文献 3 Akira Tsubokura 等人，“International Journal of SystematicBacteriology”，1999 年，第 49 卷，第 277-282 页；
非专利文献 4 : Jae Hyung Lee 等人，“ International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology”, 2004 年，第 54 卷，第 1699-1702 页；
非专利文献 5 :0fficial Journal of the European Communities L 22/28-30, 25. I.2003。

发明内容
发明所要解决的课题
本发明鉴于上述实际情况而设，其目的在于提供在抑制角黄素的生产的同时高浓度且廉价地以微生物学的方式制备虾青素的方法。解决课题的方法
本发明人为了解决上述课题进行了各种研究，结果发现在同时产生虾青素和角黄素的细菌的培养中，通过在培养基中添加生物素，可以使角黄素的生产浓度维持在低水平的同时生产高浓度的虾青素，从而完成了本发明。本发明包含以下内容。(I)制备包含虾青素的类胡萝卜素的方法，其特征在于包括在含有生物素的培养基中培养同时生产虾青素和角黄素的细菌的步骤，其中，与不含生物素的培养基中的培养结束后的培养物相比，上述培养结束后的培养物中角黄素与虾青素的生产浓度之比低。(2) (I)所述的方法，其特征在于培养基中生物素的浓度为O. 001mg/L 50mg/L0(3) (I)所述的方法，其特征在于培养结束后的培养物中角黄素与虾青素的生产浓度之比为25质量％以下。(4) (I)所述的方法，其特征在于培养结束后的培养物中葡萄糖酸的生成浓度为 30g/L以下。(5) (I)所述的方法，其特征在于在培养中，将培养物中的溶氧浓度控制在Ippm以上。(6) (I)所述的方法，其特征在于培养结束后的培养物中基于干燥细胞(乾燥細胞当& D )的聚-卢-羟基丁酸(以下称作“PHB”)含量为30质量％以下。(7) (I)所述的方法，其特征在于在培养中，将培养物中的溶氧浓度控制在Ippm以上，使培养结束后的培养物中角黄素与虾青素的生产浓度之比为25质量％以下。(8) (I)所述的方法，其特征在于在培养中，将培养物中的溶氧浓度控制在2ppm以上，使培养结束后的培养物中角黄素与虾青素的生产浓度之比为8质量％以下。(9) (I)所述的方法，其特征在于在培养中，控制培养物中的溶氧浓度使之阶段性地或连续地升高。(10) (I)所述的方法，其特征在于将培养中期的培养物中的初期溶氧浓度控制在I 2. 5ppm、且阶段性地或连续地提高溶氧浓度，使培养结束后的培养物中角黄素与虾青素的生产浓度之比为25质量％以下。(11) (I)所述的方法，其特征在于将培养中期的培养物中的初期溶氧浓度控制在2 3. 5ppm、且阶段性地或连续地提高溶氧浓度，使培养结束后的培养物中角黄素与虾青素的生产浓度之比为8质量％以下。(12) (I)所述的方法，其特征在于细菌为属于副球菌属的细菌。(13) (I)所述的方法，其特征在于细菌为使PHB生产能力降低的突变株。(14) (I)所述的方法，其特征在于细菌为使葡萄糖酸生产能力降低的突变株。(15) (I)所述的方法，其特征在于细菌为16S核糖体RNA所对应的DNA的核苷酸序列与SEQ ID NO: I记载的核苷酸序列实质上同源的细菌。(16) (15)所述的方法，其特征在于细菌为E-396株(FERM BP-4283)或A-581-1株(FERM BP-4671)或它们的突变株。(17)饲料用类胡萝卜素组合物，其特征在于是含有利用(I)所述的方法制备的包含虾青素的类胡萝卜素的组合物，其中，所制备的类胡萝卜素中角黄素与虾青素之比为25质量％以下。(18) (17)所述的饲料用类胡萝卜素组合物，其特征在于所制备的包含虾青素的类胡萝卜素中PHB含量为30质量％以下。
(19)食品用类胡萝卜素组合物，其特征在于是含有利用(I)所述的方法制备的包含虾青素的类胡萝卜素的组合物，其中，所制备的类胡萝卜素中角黄素与虾青素之比为8质量％以下。本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请2010-057321号的说明书和/或附图
中记载的内容。发明效果
根据本发明，可以在微生物学生产中使角黄素的浓度抑制在低水平的同时以低成本制备高浓度的虾青素。根据本发明制备的类胡萝卜素可以用作饲料用和食品用的原料。
具体实施例方式以下，进一步详细说明本发明。本发明的范围并不受这些说明的限定，关于下述例示以外的内容，在不损及本发明的宗旨的范围内也可以适当变更、实施。本发明涉及在含有生物素的培养基中培养同时生产虾青素和角黄素的细菌(以下有时称作“产生类胡萝卜素的细菌”或“产生虾青素的细菌”)，来制备包含虾青素的类胡萝卜素的方法(以下称作“本方法”)。在本方法中，与不含生物素的培养基中的培养结束后的同样的产生类胡萝卜素的细菌的培养物相比，培养结束后的培养物中角黄素与虾青素的生产浓度之比低。在本方法中，通过向培养基中添加生物素，可以在抑制角黄素的生产浓度的同时以低成本制备高浓度的虾青素。作为本方法中使用的细菌，只要是同时产生虾青素和角黄素的细菌即可，没有任何限定，但优选使用属于副球菌属的细菌。在属于副球菌属的细菌中，优选使用产类胡萝卜素副球菌 iParacoccus caroiifli/aciefls)、马氏苜Ij球菌矛口Zkracoccw1S haeundaensis,場秘优选使用产类胡萝卜素副球菌。属于副球菌属的细菌的具体菌株的例子有产类胡萝卜素副球菌E-396株(FERM BP-4283)和副球菌属细菌A-581-1株(FERM BP-4671)(专利文献 3和非专利文献3)，在本方法中上述菌株也优选使用。作为产生类胡萝卜素的细菌，优选使用16S核糖体RNA所对应的DNA的核苷酸序列与SEQ ID NO: I记载的E-396株的核苷酸序列实质上同源的细菌。这里，“实质上同源”是指，考虑到确定DNA的核苷酸序列时的误差频率等，核苷酸序列优选95%以上、更优选96%以上、进一步优选97%以上、特别优选98%以上、最优选99%以上同源。同源性例如可以通过基因分析软件Clustal W来确定。“ 16S核糖体RNA所对应的DNA的核苷酸序列”是指，将16S核糖体RNA的核苷酸序列中的U(尿嘧啶)取代成T(胸腺嘧啶)而得到的核苷酸序列。基于该16S核糖体RNA的核苷酸序列的同源性的微生物分类法近年来成为主流。以往的微生物分类法是基于以往的运动性、营养要求性、糖的利用性等菌学性质，因此在因自然突变而发生形质变化等的情况下，有时会将微生物错误分类。相对于此，16S核糖体RNA的核苷酸序在遗传上极为稳定，因此基于其同源性的分类法与以往的分类法相比分类的可信度格外高。产类胡萝卜素副球菌E-396株的16S核糖体RNA的核苷酸序列与其他产生类胡萝卜素的细菌马氏副球菌 DSM 11574 株(International Journal of SystematicBacteriology (1998)，48，543-548)、副球菌属细菌 N-81106 株(专利文献 5)、Paracoccus haeundaensis BC 74171株(非专利文献4)、副球菌属细菌A-581-1株和副球菌PC-I株(专利文献6)的16S核糖体RNA的核苷酸序列之间的同源性分别为99. 7%、99. 7%,99. 6%,99. 4%和95. 4%，表明这些菌株在分类学上是极为近缘的菌株。因此，可以说这些菌株作为产生类胡萝卜素的细菌形成了一个类群。因此，在本方法中优选使用这些菌株，可以有效率地产生虾青素。在本方法中，还可以使用虾青素的生产率得到改良的突变株。作为这样的突变株，例如可以列举日本特开2001-95500号公报中公开的突变株、专利文献9中公开的突变株
坐
寸ο或者，虾青素的生产率得到改良的突变株可以通过突变处理和筛选而获得。对突变处理方法没有特别限定，只要诱发突变即可。例如可以采用使用N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍(NTG)和甲磺酸乙酯(EMS)等诱变剂的化学方法、紫外线照射和X线照射等物理方法、通过基因重组和转座子等进行的生物学方法等。另外，突变株可以是通过自然发生的突变产生的突变株。从公众认可或安全性的角度考虑，优选使用不是基因重组体的微生物。对虾青素的生产率得到改良的突变株的筛选方法没有特别限定，例如除了根据琼脂培养基上的集落的颜色选择目标突变株的方法以外，还有在试管、烧瓶、发酵槽等中培养突变株，并利用吸光度、高效液相色谱、薄层层析等进行类胡萝卜素色素分析来选择目标突变株的方法等。上述突变处理和筛选的步骤可以进行I次，也可以进行两次以上的突变处理和筛选步骤，例如，通过突变处理和筛选得到突变株，再将所得的突变株进一步通过突变处理和筛选而得到虾青素的生产率得到改良的突变株。在本方法中，可以使用PHB (聚I-羟基丁酸)的生产能力降低的突变株。例如，可以由上述的E-396株、A-581-1株等属于副球菌属的细菌诱导该突变株。已知生产虾青素的细菌在细胞内蓄积PHB作为储藏碳源。蓄积PHB时，相应地会白白消耗培养基碳源，因此为了降低制造成本，尽可能不蓄积PHB为宜。因此，通过突变处理和筛选获得PHB的蓄积少或者完全不蓄积的突变株是有效的。作为PHB低生产株的具体的获得方法，可以列举下述方法进行与上述相同的突变处理后，例如在试管、烧瓶、琼脂培养基等中培养各突变株，确定PHB的量，选择PHB的生成量少的突变株。在本方法中，可以使用葡萄糖酸的生产能力降低的突变株。例如，可以由上述的E-396株、A-581-1株等属于副球菌属的细菌诱导该突变株。生成葡萄糖酸时，相应地会白白消耗培养基碳源，而且当蓄积大量的葡萄糖酸时，会阻碍发育或阻碍类胡萝卜素生产。因此，尽可能减少葡萄糖酸的生成对类胡萝卜素的生产有效。作为葡萄糖酸低生产株的具体的获得方法，可以列举下述方法进行与上述相同的突变处理后，例如在试管、烧瓶等中培养各突变株，测定培养液的PH，选择pH的下降少的突变株，之后再测定培养液的葡萄糖酸，选择葡萄糖酸的生成量少的突变株。可以分别获得上述的虾青素的生产率得到改良的突变株、PHB的生产能力降低的突变株、葡萄糖酸的生产能力降低的突变株等被赋予了优选性质的突变株，但也可以反复进行突变处理和筛选使其一并具有上述两种以上的性质。另外，可以将两种以上的筛选与一次突变处理组合以获得同时被赋予两种以上的性质的突变株。在本方法中可以使用具有上述两种以上的优选性质的突变株。作为本方法中使用的产生类胡萝卜素的细菌的例子而列举的E-396株如下国际保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。国际保藏当局独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心 (旧名称通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所)
〒 305-8566 日本国茨城县筑波市东I丁目I番地I中央第6 用于识别的标示E-396 保藏号FERM BP-4283 原保藏日1993年4月27日。另外，作为本方法中使用的产生类胡萝卜素的细菌的其他例子列举的A-581-1株如下国际保藏于上述机构。用于识别的标示A-581-1 保藏号FERM BP-4671
原保藏日1994年5月20日。需要说明的是，除虾青素和角黄素以外，对通过本方法产生的类胡萝卜素没有特别限定，例如可以列举金盖花黄质、绿蚬黄质、卢-胡萝卜素、海胆酮、asteroidenone、3-羟基海胆酮、玉米黄素、隐黄素、番茄红素，优选金盏花黄质和金盏花红素。利用本方法制备的类胡萝卜素可以是一种，也可以将多种组合。以下说明本方法中培养上述细菌的方法。需要说明的是，在以下的说明中，“培养物”并不限于培养液，还包括固体、半固体等。在本方法中，用于培养的虾青素生产用培养基只要是添加有生物素、且产生虾青素的细菌生长、生产虾青素的培养基即可，可以是任一种培养基，但优选使用含有碳源、氮源、无机盐类和所需的维生素类等的培养基。即，在本方法中，生物素被添加在产生虾青素的细菌生长、且能够产生虾青素的培养基中。作为碳源，例如可以列举葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和麦芽糖等糖类；乙酸、富马酸、枸橼酸、丙酸、苹果酸、丙二酸和丙酮酸等有机酸；乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和甘油等醇类；大豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油和亚麻籽油等油脂类等，其中优选使用葡萄糖或蔗糖。上述碳源中可以使用一种或两种以上。培养前的培养基(始发培养基，starting medium)中所添加的碳源的量根据碳源的种类而不同，只要适当调整即可，通常每IL培养基中碳源的添加量为I 100g、优选为2 50g。另外，不仅在始发培养基中添加碳源，还优选在培养中途依次或连续地追加供给碳源。作为无机氮源，例如可以列举硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等铵盐类；硝酸钾等硝酸盐类；氨和尿素等，其中可以使用一种或两种以上。添加量根据氮源的种类而不同，只要适当调整即可，通常每IL培养基中无机氮源的添加量为O. Ig 20g、优选为O. 2 10g。作为有机氮源，例如可以列举玉米浆(包含过滤处理物)、药用培养基、大豆柏、大豆粉、花生粉、谷氨酸钠、可溶酒糟和干燥酵母等，上述有机氮源中可以使用一种或两种以上。添加浓度根据氮源的种类而不同，只要适当调整即可，通常培养基中有机氮源的添加浓度为O 80g/L、优选为O 30g/L。无机氮源和有机氮源通常添加在始发培养基中，但也优选依次或连续地追加供
5口 O作为无机盐类，例如可以 列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠等磷酸盐类；硫酸镁、氯化镁等镁盐类；硫酸铁、氯化铁等铁盐类；氯化钙、碳酸钙等钙盐类；碳酸钠、氯化钠等钠盐类；硫酸锰等锰盐类；氯化钴等钴盐类；硫酸铜等铜盐类；硫酸锌等锌盐类；钥酸钠等钥盐类；硫酸镍等镍盐类；硒酸钠等硒盐类；硼酸和碘化钾等，上述无机盐类中可以使用一种或两种以上。添加量根据无机盐的种类而不同，只要适当调整即可，通常相对于IL培养基为O. 0001 15g。磷酸盐类、镁盐类、钙盐类、钠盐类和铁盐类在培养基中的浓度优选O. 02 15g/L，加入锰盐类、钴盐类、铜盐类、锌盐类、钥盐类、镍盐类、硒盐类、硼酸、碘化钾等时，O. I 15mg/L为优选的浓度。无机盐类通常添加在始发培养基中，但也可以依次或连续地追加供给。作为生物素以外的维生素类，例如可以使用氰钴铵、核黄素、泛酸、吡哆醇、硫胺、抗坏血酸、叶酸、烟酸、对氨基苯甲酸、肌醇、胆碱等。添加比例根据维生素类的种类而不同，只要适当调整即可，通常相对于IL培养基为O. 001 lOOOmg，优选为O. 01 lOOmg。维生素类通常添加在始发培养基中，但也可以依次或连续地追加供给。本方法的特征在于在添加了生物素的培养基中培养产生虾青素的细菌。通过用添加了生物素的培养基培养产生虾青素的细菌，可以使角黄素浓度抑制在低水平的同时高浓度地制备虾青素。本方法中使用的生物素可以是DL-体也可以是D-体，但优选使用D-体。生物素通常添加在始发培养基中，但也可以在培养中途间断地或连续地添加，还可以添加在始发培养基中之后进一步在培养中途间断地或连续地追加添加。生物素可以与主培养基混合进行灭菌，也可以另外灭菌后添加。对生物素的灭菌方法没有特别限定，可以是加热灭菌也可以是过滤灭菌。培养基中添加的生物素的浓度不会特别设定下限，但优选0.001mg/L以上、更优选0. 005mg/L以上、进一步优选0. 01mg/L以上、特别优选为0. 02mg/L以上。另外，生物素的添加浓度也不会特别设定上限，优选50mg/L以下、更优选20mg/L以下、进一步优选IOmg/L以下、特别优选5mg/L以下、最优选为2mg/L以下。在本方法中，优选使用消泡剂以抑制培养物的起泡。消泡剂的种类只要是具有抑制泡的产生或消除已产生的泡的作用、且对生产菌的抑制作用少的消泡剂即可，可以是任一种。例如可以例示醇系消泡剂、聚醚系消泡剂、酯系消泡剂、脂肪酸系消泡剂、有机硅系消泡剂、磺酸系消泡剂等。消泡剂的添加量根据消泡剂的种类而不同，只要适当调整即可，但通常相对于IL培养基为0. Olg 10g。消泡剂通常添加在灭菌前的始发培养基中。还可以在培养中途连续地或间断地追加添加消泡剂。在培养中途添加消泡剂的方法例如有使用传感器感知泡后自动添加的方法、使用程序定时器以一定的时间间隔进行添加的方法、适应生长速度的变化与饲养用碳源、氮源或PH调节剂等混合后添加的方法等。添加在始发培养基中的消泡剂和培养中途添加在培养物中的消泡剂可以是相同种类，但也可以根据作用而使用不同种类的消泡剂。在本方法中，培养开始时的培养基的pH调节至2 12、优选6 9、更优选6. 5 8.0。培养中也优选维持上述范围的pH。作为维持pH的方法，优选使用设置在发酵槽内的PH电极在线测定培养液的pH，并自动供给碱的方法。作为pH调节剂，例如可以列举氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、碳酸钠水溶液、氨水、氨气、硫酸水溶液或它们的混合物。在本方法中，将培养基灭菌处理后用于细菌的培养。灭菌处理可以由本领域技术人员适当进行。例如，可以将适当容器中的培养基在高压灭菌器中加热灭菌。或者，可以使用灭菌过滤器进行过滤灭菌。或者，可以通过夹套加热和注蒸汽进行灭菌。葡萄糖等碳源若与其他培养基成分一起加热灭菌则发生褐变，因此可以另外进行灭菌。维生素类或微量的金属类可以和主培养基一起加热灭菌，但为了防止失活或产生沉淀，可以另外进行灭菌。在本方法中，将产生虾青素的细菌接种在如上制备的添加了生物素的培养基中，在规定的条件下进行培养。接种可以如下进行通过使用试管、烧瓶或发酵槽等进行种子培养来适当增加菌株，再将所得培养物加入到虾青素生产用的添加有生物素的培养基中。用 于种子培养的培养基只要是产生虾青素的细菌良好增殖的培养基即可，没有特别限定，可以是添加了生物素的培养基，也可以是未添加生物素的培养基。培养在适当的培养容器中进行。培养容器可以根据培养容量适当选择，例如有试管、烧瓶、发酵槽等。培养温度例如为15 40°C、优选20 35°C、更优选为25°C 32°C。培养期间通常为I天 20天、优选2 12天、更优选3 9天、特别优选4 7天，在需氧条件下进行培养。作为需氧条件，例如可以列举振荡培养或通气搅拌培养等，但在氧不足时会对产生虾青素的细菌的生长或类胡萝卜素的生产产生不良影响，因此优选使用溶氧电极经常监测溶氧浓度。然而，培养刚刚开始后，由于微生物数量少，因此溶氧浓度显示出接近饱和浓度的数值，但若该微生物开始生长，氧消耗量增多，则溶氧浓度逐渐降低。可以将从培养开始到溶氧浓度降至某一程度、例如O 5ppm、优选I 4ppm的期间定义为培养初期、将此后直至虾青素生产浓度达到最高值的期间定义为培养中期、将从虾青素生产浓度达到最高值后到培养结束的期间定义为培养末期。在培养初期，为了使溶氧浓度尽快地达到控制范围，可以将通气量、搅拌转数、压力设定得稍低一点。但是，良好地保持培养物的混合状态所需的最低限的搅拌转数是必需的，防止杂菌混入所需的最低限的加压是必需的。培养中期是微生物耗氧最活跃的时期。其中，通气搅拌不足时，溶氧浓度达到零、即氧耗尽，给微生物的生长或类胡萝卜素的生产带来不良影响。因此，在培养中期，优选控制溶氧浓度以使氧不耗尽。溶氧浓度的控制例如可以通过改变搅拌转数、通气量、内压、通气气体中的氧浓度等来进行。本方法中，在产生虾青素的细菌的培养中，存在着培养物中的溶氧浓度越升高则相对于虾青素的角黄素的生产浓度越降低的倾向，因此在培养中期培养物中的溶氧浓度优选控制在Ippm以上、更优选I. 5ppm以上、进一步优选2ppm以上、特别优选2. 5ppm以上。对培养中期的培养物中溶氧浓度的控制范围的上限没有特别限定，但优选8ppm以下、更优选7ppm以下、进一步优选6ppm以下、特别优选为5ppm以下。在培养中期培养物中的溶氧浓度可以控制在一定水平，但为了抑制培养物中角黄素浓度的同时达到高的虾青素浓度，阶段性地或连续地提高该溶氧浓度也是有效的。对阶段的次数没有特别限定，只要是I个阶段以上即可，例如可以每小时提高O. 2ppm、需要20小时等半连续或连续地提高。对阶段性地或连续地提高培养物中的溶氧浓度前的溶氧浓度(即初期溶氧浓度)的下限没有限定，但优选Ippm以上、更优选I. 5ppm以上、进一步优选为2ppm以上，对上限也没有限定，但优选为3. 5ppm以下，更优选3ppm以下，进一步优选为2. 5ppm以下。另外，对阶段性地或连续地提高培养物中的溶氧浓度后的溶氧浓度的下限没有限定，但优选2. 5ppm以上、更优选3ppm以上、进一步优选为3. 5ppm以上。对上限也没有限定，但优选为8ppm以下,更优选为7ppm以下,进一步优选6ppm以下,特别优选为5ppm以下。在培养中期，对开始阶段性地或连续地提高培养物中的溶氧浓度的时间没有特别限定，但优选为自进入培养中期时起O小时 60小时、更优选2小时 50小时、进一步优选4小时 40小时、特别优选为6小时 30小时。对从开始阶段性地或连续地提高培养物中的溶氧浓度到达到最高溶氧浓度的时间没有限定。当为I个阶段的位移时，可以在I小时以内达到最高溶氧浓度。当为两阶段以上的半连续性或连续性的增加时，对从开始提高培养物中的溶氧浓度时起到达到最高浓度的时间没有限定，但优选为2小时 120小时， 更优选4小时 100小时、进一步优选6小时 90小时、特别优选8小时 80小时、最优选为10小时 70小时。另外，还优选在培养中期可以随时采集培养物，分析类胡萝卜素组成的同时在培养中提高或降低培养物中的溶氧浓度，使角黄素浓度与虾青素浓度之比达到希望的数值。即，当角黄素/虾青素之比高于希望值时，提高培养物中的溶氧浓度的控制设定值是有效的；而当角黄素/虾青素之比低时，降低培养物中的溶氧浓度是有效的。在培养末期，微生物的耗氧活性降低，菌体的增加或类胡萝卜素的生产停止，因此培养物中的溶氧浓度的控制不必象培养中期那样严密地进行，但可以继续与培养中期的后期一样地进行溶氧浓度控制，也可以在一定的搅拌、一定的通气量下进行培养。按照上述方法进行培养、培养结束后最终得到的培养物中角黄素浓度与虾青素浓度之比优选为25质量％以下，更优选20质量％以下、进一步优选15质量％以下、更进一步优选8质量％以下、特别优选6质量％以下、最优选为4质量％以下。另外，培养结束后的培养物中角黄素浓度与虾青素浓度之比不会特别存在下限，但优选O. 5质量％以上、更优选为1.0质量％以上。培养结束后的培养物中角黄素与虾青素之比为25质量％以下的培养物适合用于饲料添加，而角黄素与虾青素之比为8质量％以下的培养物适合在食品中使用。同时生产虾青素和角黄素的细菌还同时生产金盏花黄质作为副产物。按照上述方法进行培养得到的培养结束后的培养物中金盏花黄质浓度与虾青素浓度之比优选为100质量％以下，更优选90质量％以下，进一步优选80质量％以下，更进一步优选30质量％以下、特别优选25质量％以下、最优选为20质量％以下。另外，培养结束后的培养物中金盏花黄质浓度与虾青素浓度之比不会特别存在下限，但优选为I质量％以上，更优选为5质量％以上。本方法中使用的细菌在培养液中生成葡萄糖酸。生成葡萄糖酸时，相应地白白消耗培养基碳源，而且当蓄积大量的葡萄糖酸时，会阻碍生长或类胡萝卜素的生产。因此，尽可能减少葡萄糖酸的生成对类胡萝卜素的生产有效。在本方法中，通过在培养基中添加生物素，可以减少葡萄糖酸的生成量。最终得到的培养结束后的培养物中葡萄糖酸浓度优选为30g/L以下，更优选20g/L以下、进一步优选为10g/L，特别优选为5g/L以下，下限为Og/L0在本方法中，若在培养基中添加生物素，则可以抑制PHB (聚-β_羟基丁酸)的生成。最终得到的培养结束后的 培养物中基于干燥细胞的PHB含量优选为30质量％以下，更优选20质量％以下、进一步优选10质量％以下、特别优选为5质量％以下，下限为O质量％。特别是培养结束后的培养物中基于干燥细胞的PHB含量为30质量％以下的培养物可适用于饲料添加。在本方法中，培养产生虾青素的细菌得到的培养物中的类胡萝卜素、或从培养物中提取的类胡萝卜素的定量例如可以通过高效液相色谱法来进行。以上述方式培养产生虾青素的细菌而得到的培养物，可以作为类胡萝卜素直接使用，或者由培养液等培养物制备例如培养上清、菌体浓缩物(菌体浓缩液)、湿菌体、干燥菌体、菌体溶解物等，可以使用这些制备物。而且，可以通过提取、纯化等从上述培养物或制备物中采集类胡萝卜素。通过对培养物进行离心处理或过滤处理，从培养物中除去菌体，即可制备培养上清。菌体浓缩物(菌体浓缩液)可以通过对培养物进行离心分离、膜过滤浓缩或倾析而得至IJ。湿菌体可以通过对培养物进行离心或过滤而得到。干燥菌体可以通过按照普通的干燥方法使培养物、湿菌体或菌体浓缩物(菌体浓缩液)干燥而得到。如此操作得到的含有类胡萝卜素的干燥菌体可以直接用作饲料添加剂。在本方法中，对从上述培养物或制备物中采集类胡萝卜素的方法没有特别限定，可以是稳定、高效地回收类胡萝卜素的任一种方法。关于上述方法，本领域技术人员可以从公知的提取或纯化技术中适当选择而进行。另外，在进行提取前，可以将培养物或制备物供给使用碱性试剂或表面活性剂等的化学处理，使用溶菌酶、脂质分解酶和蛋白分解酶等的生化学处理，或超声波或粉碎等物理处理中的一种或两种以上的处理。例如，从培养物或制备物中提取类胡萝卜素时，对用于提取和清洗的溶剂没有特别限定，例如可以列举甲醇、乙醇、异丙醇等低级醇类；丙酮、四氢呋喃、丁酮、甲基异丁基酮、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等。想要极力防止提取操作中的类胡萝卜素的氧化时，可以在氮气等惰性气体环境下进行处理。另外，可以选择药品或食品中使用的抗氧化剂，适当加入到提取溶剂中。或者，可以将上述处理组合起来。此外，为了极力防止由光引起的类胡萝卜素的分解，可以在不接触光的条件下进行提取。如此操作得到的提取物可以作为类胡萝卜素直接使用，还可以进一步纯化后使用。对从提取操作后的提取液等提取物中分离细菌等的方法没有特别限定，例如可以列举膜过滤、离心分离、倾析等。作为由提取物得到类胡萝卜素沉淀物的方法，通常有加热和/或减压浓缩或晶析。此外，通过低温下的类胡萝卜素色素的析出、使用酸·碱试剂或各种盐类进行的析出，可以不使类胡萝卜素色素浓缩而将其分离。工业上使用时，优选晶析。为了清洗所得的类胡萝卜素沉淀物，根据需要可以使用少量的低级醇类等溶剂将其悬浮搅拌。对清洗的方法没有特别限定，作为实用的优选方法，可以列举如悬浮搅拌后进行过滤收集的方法或液体从沉淀物上流过的方法等。以上述方式得到的培养物、制备物、提取物或纯化物可以作为类胡萝卜素各自单独使用、或者可以将它们以任意的比例混合后使用。
实施例以下，列举实施例以具体说明本发明，但本发明的范围并不限于以下的实施例。需要说明的是，实施例中的类胡萝卜素类的定量采用高效液相色谱法(HPLC)如下进行。柱是将两根Inertsil SIL-100A, 5//m (Φ 4. 6X 250mm) (GL Sciences 制)连接使用。进行洗脱时，作为流动相的正己烷/四氢呋喃/甲醇混合液(40:20:1)在室温附近的一定温度下以I. OmL/分钟流动。测定中，将样品用四氢呋喃溶解，以20// L用流动相稀释了 100倍的液体作为注入量，柱洗脱液的检测在波长470nm下进行。此外，作为定量用的标准品，使用Sigma公司制虾青素(Cat. No. A9335)。关于标准液的虾青素浓度的设定，在测定标准液在477nm的吸光度(A)和在上述条件下进行HPLC分析时的虾青素的峰面积百分率％ (B)后利用下式进行设定。虾青素的浓度(mg/L)= A + 2150XBX100 [实施例I]
将IOOml具有以下组成的培养基(30g/L的蔗糖、30g/L的玉米浆、I. 5g/L的磷酸二氢钾、3. 8g/L的磷酸氢二钠12水合物、5. Og/L的氯化钙2水合物、O. 7g/L的硫酸镁7水合物、O. 3g/L的硫酸铁7水合物、pH7. 2)装入500ml容量的带有棉塞的三角烧瓶中，在121°C下高压灭菌15分钟，制备7瓶接种(seed)用烧瓶培养基。接下来，将2. OL具有以下组成的培养基(20g/L的葡萄糖、30g/L的玉米浆、O. 5g/L的硫酸铵、2. 25g/L的磷酸二氢钾、5. 7g/L的磷酸氢二钠12水合物、O. lg/L的氯化钙2水合物、O. 5g/L的硫酸镁7水合物、5g/L的硫酸铁7水合物、O. 5g/L的醇系消泡剂)装入5L容量的发酵槽中，准备7个这样的发酵槽。向该发酵槽中添加D-生物素使分别达到0、0. 001、O. 01,0. I、I. O、10 和 50mg/L，在 121°C下高压灭菌 30 分钟。将一钼环量的产类胡萝卜素副球菌E-396株(FERM BP-4283)接种在上述接种用烧瓶培养基中，在28°C下以IOOrpm的转速旋转振荡培养2天，之后将80mL该培养液接种在上述各发酵槽中。在28°C、lvvm的通气量下进行120小时的需氧培养。使用15%的氨水连续调节PH，使培养中的pH维持在7. 2。在培养的第I天、第2天、第3天和第4天分别添加30g葡萄糖使之不耗尽。另外，最低搅拌转数为200rpm，改变搅拌转数使培养中期的培养液中溶氧浓度维持在2ppm。通过用气泡传感器感知起泡来自动添加醇系消泡剂，以抑制起泡。测定培养结束时的培养液的类胡萝卜素浓度、葡萄糖酸浓度和基于干燥细胞的PHB含量时，结果如表I所示。可知与未添加生物素的区相比，添加了 O. 001 50mg/L的生物素的实验区中角黄素与虾青素的比例低。[实施例2]
将IOOml具有以下组成的培养基(30g/L的蔗糖、30g/L的玉米浆、I. 5g/L的磷酸二氢钾、3. 8g/L的磷酸氢二钠12水合物、5. Og/L的氯化钙2水合物、O. 7g/L的硫酸镁7水合物、O. 3g/L的硫酸铁7水合物、pH7. 2)装入500ml容量的带有棉塞的三角烧瓶中，在121°C下高压灭菌20分钟，制备8瓶接种用烧瓶培养基。接下来，将2. OL具有以下组成的培养基(40g/L的蔗糖、30g/L的玉米浆、O. 5g/L的硫酸铵、2. 25g/L的磷酸二氢钾、5. 7g/L的磷酸氢二钠12水合物、O. lg/L的氯化钙2水合物、O. 5g/L的硫酸镁7水合物、5g/L的硫酸铁7水合物、O. 5g/L的醇系消泡剂)装入5L容量的发酵槽中，准备8个这样的发酵槽。向该发酵槽中添加D-生物素使分别达到O. lmg/L,在121°C下高压灭菌30分钟。将一钼环量的产类胡萝卜素副球菌E-396株(FERM BP-4283)接种在上述接种用烧瓶培养基中，在28°C下以IOOrpm的转速旋转振荡培养2天，之后将80mL该培养液接种在上述各发酵槽中。在28°C、Ivvm的通气量下进行120小时的需氧培养。使用15%的氨水连续调节PH，使培养中的pH维持在7. 2。在培养的第I天、第2天、第3天和第4天分别添加30g蔗糖使之不耗尽。另外，最低搅拌转数为200rpm，改变搅拌转数，使培养中期的培养液中溶氧浓度维持在O. 5、1、2、3、4、5、6和7ppm。通过用气泡传感器感知起泡来自动添加醇系消泡剂，以抑制起泡。测定培养结束时的培养液的类胡萝卜素浓度、葡萄糖酸浓度和基于干燥细胞的PHB含量时，结果如表2所示。可知溶氧浓度越升高，则角黄素浓度与虾青素浓度之比表现出越降低的趋势，可以降低至I. 4%。为了进行比较，使用未添加生物素的培养基进行相同的实验。结果见表3。角黄素浓度与虾青素浓度之比只能降低至9%。[表2]添加生■物素tt.l_g/L
n.顾...
ppm I I I 2 3 4 I 5 I 6 7
:丨"":::::I w-τ- -rrr—-..............................................................t[::::::===^~=|==^μ|^—M ==—|==.................I...............βββββββμ;
角黄素 n g/LI 7.31 3.3J.6 丨 1.2 丨 0.6 0.310.2 I LI
虾音素 _| /Ι,I 8.3 I 13320.2 | 20.9 | ISJ IlJ |9.6 |7.0
金裊花黄潘 r ig/L丨 |·41 ZJ3,9 丨 5·|| 6.1 S.21SM I11.4 爲黃素/*F音素质-I S8.§ I 24.87.9] 5.7 I 3.8 2.7 |2.1 I1.4
金盔花黃廣/_音素质量％ ； IO I 17JWJ \ 24.4 \ 38Λ | 72.6 |91,7 \163
葡萄糖酸 g/LI 24 I 19171 14 I 麵61 II I10 I9
PHB 潘 fr%I 251 19IS: 17 | 14 | 20113 !17
[表3]
未添Λ 生物金
溶氡浓度 μριιι0.5 I I 2 I J [ 4 ' 5 ! 6 I 7
---1.............................................................1-1.............................................................1-:-■*■............................................................. ..............................................................
Λ 黃素 mg/L6.71 4.1 3.21 2.2 1.2 tt.71 0,51 0.4
坏音.I: mg/L3J I 7.8 12J | IJJ 10.97.S ;5.5 |4.2
金.1:花貴质 mg/Li.61 1.7 3,41 5.5 6.86.517.318,7
爲黃素/筹 素膚. %223 I 52J 26.(11 16,5 11.0f.0 I9,1 |9.5
金Jfc花黄质/#音素貭量％2<M) I 21. 27,fi| 41,4 62.483.3;133 |207
葡萄耱酸 g/L561 47 311 44 JSM 丨3_ |31
PIIB 盾量％441 47 ； 291 34 [ 2727 I36132
[实施例3]
使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍对产类胡萝卜素副球菌E-396株(FERM BP-4283)进行突变处理，选择红色的颜色深的集落。测定所选择的株的培养液中的PHB浓度和类胡萝卜素浓度，选择PHB生产能力低、且虾青素生产能力高的突变株LP-26株。将IOOml具有以下组成的培养基(30g/L的蔗糖、30g/L的玉米浆、I. 5g/L的磷酸二氢钾、3. 8g/L的磷酸氢二钠12水合物、5. Og/L的氯化钙2水合物、O. 7g/L的硫酸镁7水合物、O. 3g/L的硫酸铁7水合物、pH7. 2)装入500ml容量的带有棉塞的三角烧瓶中，在121 °C下高压灭菌20分钟，制备接种用烧瓶培养基。接下来，将2. OL具有以下组成的培养基(30g/L的葡萄糖、30g/L的玉米浆、O. 5g/L的硫酸铵、2. 25g/L的磷酸二氢钾、5. 7g/L的磷酸氢二钠12水合物、O. lg/L的氯化钙2水合物、O. 5g/L的硫酸镁7水合物、5g/L的硫酸铁7水合物、6g/L的L-谷氨酸钠I水合物、
0.5g/L的醇系消泡剂)装入5L容量的发酵槽中，准备8个这样的发酵槽。向该发酵槽中添加D-生物素使分别达到O. lmg/L，在121°C下高压灭菌30分钟。将一钼环量的上述选择的副球菌属细菌LP-26株接种在上述接种用烧瓶培养基中，在28°C下以IOOrpm的转速旋转振荡培养2天，之后将80mL该培养液接种在上述各发酵槽中。在28°C、Iwm的通气量下进行140小时需氧培养。使用15%的氨水连续调节pH，使培养中的PH维持在7. 2。在培养的第I天、第2天、第3天和第4天分别添加50g葡萄糖使其不耗尽。另外，最低搅拌转数为IOOrpm，改变搅拌转数使培养中期的培养液中的溶氧浓度维持在O. 5、1、2、3、4、5、6和7ppm。通过使用气泡传感器感知起泡来自动添加醇系消泡剂，以抑制起泡。测定培养结束时的培养液的类胡萝卜素浓度、葡萄糖酸浓度和基于干燥细胞的PHB含量时，结果如表4所示。可知溶氧浓度越升高，则角黄素浓度与虾青素浓度之比表现出越降低的倾向，可以降低至I. 6%。为了进行比较，使用未添加生物素的培养基，控制培养中期的溶氧浓度为2ppm，进行相同的实验。结果见表5。在控制溶氧浓度为相同的2ppm且添加生物素时，角黄素与虾青素之比为8%，相对于此，未添加生物素时角黄素与虾青素之比高达26. 8%。[表4]
权利要求
1.制备包含虾青素的类胡萝卜素的方法，其特征在于包括在含有生物素的培养基中培养同时生产虾青素和角黄素的细菌的步骤，其中，与不含生物素的培养基中的培养结束后的培养物相比，上述培养结束后的培养物中角黄素与虾青素的生产浓度之比低。
2.权利要求I所述的方法，其特征在于培养基中生物素的浓度为O.001mg/L 50mg/Lo
3.权利要求I所述的方法，其特征在于培养结束后的培养物中角黄素与虾青素的生产浓度之比为25质量％以下。
4.权利要求I所述的方法，其特征在于培养结束后的培养物中葡萄糖酸的生成浓度为30g/L以下。
5.权利要求I所述的方法，其特征在于在培养中，将培养物中的溶氧浓度控制在 Ippm以上。
6.权利要求I所述的方法，其特征在于培养结束后的培养物中基于干燥细胞的聚-β_羟基丁酸即PHB的含量为30质量％以下。
7.权利要求I所述的方法，其特征在于在培养中，将培养物中的溶氧浓度控制在 Ippm以上，使培养结束后的培养物中角黄素与虾青素的生产浓度之比为25质量％以下。
8.权利要求I所述的方法，其特征在于在培养中，将培养物中的溶氧浓度控制在 2ppm以上，使培养结束后的培养物中角黄素与虾青素的生产浓度之比为8质量％以下。
9.权利要求I所述的方法，其特征在于在培养中，控制培养物中的溶氧浓度使之阶段性地或连续地升高。
10.权利要求I所述的方法，其特征在于将培养中期的培养物中的初期溶氧浓度控制在I 2. 5ppm、且阶段性地或连续地提高溶氧浓度，使培养结束后的培养物中角黄素与虾青素的生产浓度之比为25质量％以下。
11.权利要求I所述的方法，其特征在于将培养中期的培养物中的初期溶氧浓度控制在2 3. 5ppm、且阶段性地或连续地提高溶氧浓度，使培养结束后的培养物中角黄素与虾青素的生产浓度之比为8质量％以下。
12.权利要求I所述的方法,其特征在于细菌为属于副球菌属(Paracoccus)的细菌。
13.权利要求I所述的方法，其特征在于细菌为使PHB生产能力降低的突变株。
14.权利要求I所述的方法，其特征在于细菌为使葡萄糖酸生产能力降低的突变株。
15.权利要求I所述的方法，其特征在于细菌为16S核糖体RNA所对应的DNA的核苷酸序列与SEQ ID NO: I记载的核苷酸序列实质上同源的细菌。
16.权利要求15所述的方法，其特征在于细菌为E-396株(FERMBP-4283)或 A-581-1株(FERM BP-4671)、或者它们的突变株。
17.饲料用类胡萝卜素组合物，其特征在于是含有利用权利要求I所述的方法制备的包含虾青素的类胡萝卜素的组合物，其中，所制备的类胡萝卜素中角黄素与虾青素之比为25质量％以下。
18.权利要求17所述的饲料用类胡萝卜素组合物，其特征在于所制备的包含虾青素的类胡萝卜素中PHB含量为30质量％以下。
19.食品用类胡萝卜素组合物，其特征在于是含有利用权利要求I所述的方法制备的包含虾青素的类胡萝卜素的组合物，其中，所制备的类胡萝卜素中角黄素与虾青素之比为8质量％以下。
全文摘要
本发明的目的在于提供在抑制角黄素生产的同时高浓度且廉价地以微生物学的方式制备虾青素的方法，具体而言，涉及制备包含虾青素的类胡萝卜素的方法，其特征在于包括在含有生物素的培养基中培养同时生产虾青素和角黄素的细菌的步骤，其中，与不含生物素的培养基中的培养结束后的培养物相比，上述培养结束后的培养物中角黄素与虾青素的生产浓度之比低。
文档编号A23K1/16GK102933718SQ20118002428
公开日2013年2月13日 申请日期2011年3月15日 优先权日2010年3月15日
发明者平泽和明, 佐藤博, 米田久, 矢田哲久, 东光利 申请人:吉坤日矿日石能源株式会社