专利名称：农杆菌介导梅花成熟子叶再生体系的遗传转化方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及以通过农杆菌介导、利用梅花成熟子叶再生体系进行遗传转化方法。
背景技术：
梅花(Prunus mume)属于蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)植物，是中国十大传统名花之一，国外仅日本、朝鲜、新西兰等少数几个国家有种植。根据植物采集家的实际工作和中、日若干古籍的记载，肯定了中国乃梅之故乡。梅花主要分布于我国的长江流域及整个江南地区。川、滇、藏交界的横断山区和云贵高原一带被认为是梅、半野生梅的自然分布中心，即梅的变异与种质多样化中心。在我国有7000年以上的应用史和2000年以上的栽培史。梅花集色、香、姿、韵于一身，有“梅天下尤物”的美称，具有极高的观赏价值。其生性较为耐寒(一般能耐_5°C的低温)，且开花较早，能在早春怒放。然而，梅花一般不能抵御-15°C -20°C的低温，仅杏梅系的品种除外。梅花绝大多数品种(多属真梅系)集中分布于我国长江流域一带，在北方梅花品种则较少且主要以杏梅系和樱李梅系为主，少见真梅系品种，有“南梅北杏”之称。此外,梅花切花品种较少。为了使梅花在我国分布范围更为广泛，为了使梅花的栽培应用国际化，培育出大量的抗寒品种势在必打。传统的梅花品种选育和品质改良多采用实生苗选种、杂交育种等，这些方法周期长、偶然性大、消耗大量人力物力，且受季节限制，同时在性质改良上局限性很大。而现代化的生物技术，特别是植物基因工程的应用则可以克服传统育种方法的局限性，可以使我们在较短的育种周期内获得大量符合我们要求的植株。植物基因工程技术在保持品种的其他性状相对稳定的基础上，能够利用外源基因对其所控制的性状进行定向改良，从而为培育梅花新品种提供了新的途径。要获得转基因植物，最重要的前提是要建立遗传转化体系所需的植株再生体系。目前梅花再生体系的建立还存在较大的难度，目前只有从樱李梅系的‘美人’梅叶片再生出不定芽，并获得完整植株，所以有关梅花遗传转化成功的报道非常有限。目前只有一篇关于梅花遗传转化的报道，Mei Gao et al.(2010)以梅花品种‘Nanko’的未成熟子叶作为遗传转化受体，利用体细胞胚发生途径，经农杆菌侵染、共培养、选择培养、萌发培养、增殖培养和生根培养，转化GUS报告基因并得到抗性植株。这篇报道采用梅花未成熟子叶作为转化受体材料，通过体细胞胚发生途径，建立了一个遗传转化体系并且得到了抗性植株，但是转化效率极低，而且体细胞胚的诱导对于未成熟子叶的大小有严格的要求，当未成熟子叶为2-3_长的时候，诱导效率最高，小于或者大于2-3_的时候诱导效率均很低，这对于外植体的采样时间有严格要求，一年只能够采样一次，而且未成熟的果实容易腐烂不易保存，不能周年进行细胞培养和生产；并且在遗传转化的过程中，未成熟子叶经侵染和共培养后延迟筛选7d，这势必导致假阳性率高，转化效率低，这些都不利于转化。目前，国内外还没有关于以梅花成熟子叶为受体进行遗 传转化的成功报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种以梅花成熟子叶再生体系为基础，通过农杆菌介导的方法，建立一种梅花遗传转化体系，该体系不需要通过胚发生途径，直接获得转基因植株。本发明的技术方案如下:一种农杆菌介导的梅花成熟子叶直接再生体系的遗传转化方法，其步骤包括遗传转化及植株鉴定，其特征在于，以梅花成熟子叶作为遗传转化的受体材料，不经过体细胞胚发生途径，通过直接的器官发生途径获得转化植株，其步骤经预培养、农杆菌侵染、共培养、选择培养、成苗培养和生根培养，将GUS报告基因和正义PmCBFb基因导入受体细胞，利用抗生素进行抗性筛选，通过GUS化学染色或PCR检测筛选得到转基因植株，其步骤如下所示:I)预培养:将消毒后梅花成熟子叶接种到成熟子叶再生培养基中，置于24±2°C，光照强度为2000Ix光下预培养0-5d ；2)菌株的制备:从-70°C冰箱中取出保存的包含有⑶S报告基因和正义PmCBFb基因的农杆菌EHA105，用接种环在100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，然后将平板倒置于28°C温箱中黑暗培养直至单菌落产生；挑取单菌落接种于100mg/L卡那霉素LB液体培养基中，在28°C恒温摇床上200r/min振荡培养过夜；然后将对数生长期为0D_ =
0.6-0.8的菌液从三角瓶中转入无菌的50ml离心管中，4000r/min离心IOmin,去上清液,将收集得到的农杆菌置于ΙΟΟμπιοΙ/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基中，作为重悬液使用，在28°C恒温摇床上200r/min重悬培养2_4h后用于转化受体的侵染；3)侵染:将步骤I)的梅花成熟子叶再生培养基中生长健壮、无污染的子叶转入步骤2)中制备好的农杆菌菌液侵染10-30min，期间每隔2_3分钟摇动一下；4)共培养:将步骤3)中侵染过的梅花成熟子叶放在滤纸上除去菌液后接种到共培养培养基中，置于24±2°C,黑暗条件下培养l-5d ；5)选择培养:将步骤4)中共培养后的梅花成熟子叶转入选择培养基中，置于24±2°C光下培养，光照强度为20001X，每两周补充一次新鲜选择培养基直至不定芽分化；6)成苗培养:将步骤5)中再生出的不定芽接种到到成苗培养基培养，对获得的抗性芽进一步的筛选和促进生长，于光下培养，光照强度为20001X，每四周补充一次新鲜的成苗培养基，直到得到抗性苗；7)生根培养:将步骤6)获得的抗性苗切成2-3厘米长的茎段转入生根培养基中进行生根培养，光下培养，光照强度为20001x，直到获得抗性植株；8)将步骤7)中获得的转GUS报告基因的抗性苗进行GUS化学染色，验证获得转基因植株；或提取步骤7)中获得的转正义PmCBFb基因植株的基因组DNA，进行PCR检测，验证获得转基因植株；培养基组分及配制:成熟子叶再生培养基:1/2MS，6_苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L, α -萘乙酸0.2mg/L，噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L,鹿糖30.0g/L,琼脂7.5g/L,用蒸懼水定容至1L, pH6.0 ；共培养培养基:1/2MS ，6_苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L, α -萘乙酸0.2mg/L,噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L,乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L,鹿糖30.0g/L,琼脂7.5g/L,用蒸懼水定容至1L, ρΗ6.0 ；选择培养基:1/2MS，6_苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L, α -萘乙酸0.2mg/L，噻二唑苯基
脲0.2-0.4mg/L,卡那霉素20mg/L,头孢霉素300mg/L,鹿糖30.0g/L,琼脂7.5g/L,用蒸懼水
定容至1L，pH6.0 ；成苗培养基:1/21^，玉米素1.011^/1，3-吲哚乙酸0.lmg/L，卡那霉素20mg/L，头孢
霉素300mg/L,鹿糖30.0g/L,琼脂7.5g/L,用蒸懼水定容至1L, pH6.0 ；生根培养基:1/2MS，α -萘乙酸0.5mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定
容至 1L，pH6.0。作为优选方案，步骤I)中所述的成熟子叶预培养时间为3d。作为优选方案，步骤3)中所述的农杆菌的侵染时间为20min。作为优选方案，步骤4)中所述的农杆菌与转化受体的共培养时间为3d。本发明的积极效果是:本发明是国内外首次利用梅花成熟子叶转化报告基因和目的基因获得梅花转基
因植株，为今后梅花的遗传改良提供新的技术平台。具体的优点如表I所示。表I本发明与现有技术的区别
比较项目_本发明技术特征_现有的技术特征_
受体材料梅花成熟子叶外植体一次采收后，梅花未成熟子叶采收受季节限制，不易
不受季节限制，易于保存，可以周于保存，不能周年用于遗传转化的材料 年用于遗传转化的材料
遗传转化体系以梅花成熟子叶作为遗传转化的受以梅花未成熟子叶作为遗传转化的受
体材料，利用直接的器官发生途径体材料，利用体细胞胚发生途径，其步 (未经过体细胞胚发生途径)，其步骤经农杆菌侵染15mm、脱菌培养7d(不 骤经预培养3d、农杆菌侵染20mm、加入卡那霉素筛选)、选择培养、萌发 共培养3d、选择培养、成苗培养和培养和生根培养获得抗性植株，进行阳 生根培养获得抗性植株，进行阳性性检测，由于共培养后延迟筛选，导致 检测，阳性率高，转化效率高假阳性率高，转化效率低
转化基因Gf 报告基因和正义PmCSFZ)基只转Gf 报告基因，未转入目的基因，
因，缩短了生产流程离生产应用较远
序列表SEQ ID NO:1是⑶S(i3 -葡萄糖苷酸酶)报告基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO:2是NPTII选择基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO:3是PmCBFb目的基因的核苷酸序列。
图1:本发明中以梅花成熟子叶为受体的遗传转化技术流程图。图2:是本发明应用的一个报道的质粒PBI121的物理图谱。图3:是本发明应用的表达载体pCAMBIA2300s的物理图谱。图4:本发明中以梅花成熟子叶为受体的⑶S瞬时表达检测。图中:a.未转化成熟子叶染色；b.转化成熟子叶染色；c.转基因植株。图5:本发明中以梅花成熟子叶为受体再生出抗性不定芽的⑶S稳定表达检测。图6:本发明实施例中由梅花成熟子叶诱导出的不定芽。图7:本发明实施例中转化PmCBFb目的基因所得的阳性植株，提取其叶片的基因组DNA进行PCR检测结果。(泳道“P”代表农杆菌质粒，泳道“CK”代表未转化的植株，泳道“ I” - “ 11”代表转化得到的植株)。图8:本发明实施例中转化GUS报告基因，卡那霉素对梅花成熟子叶不定芽诱导率的影响。
具体实施方式
以下实施例进一步定义本发明，但不是限制本发明的保护范围。实施例1梅花成熟子叶转化获得转基因植株1.转化受体材料及培养::用于本实施例的梅花材料来自于中国(武汉)梅花研究中心晏小兰高级工程师惠增的梅花品系‘雪梅’和‘米单绿’的成熟果实(晏小兰，刘小祥等，2007)，用锤子将成熟的梅花果实敲开，取出梅花成熟胚，再用含有洗衣粉的水浸泡IOmin后,流水冲洗30min,然后在超菌操作台上用70%的酒精消毒30s，无菌水冲洗I次,然后用0.1 %升汞溶液消毒15min，用无菌水冲洗4-5次，用无菌水浸泡约24h后，在无菌操作台上将外植体(梅花成熟子叶)接种到子叶再生培养基中，置于24±2°C，光照强度为20001X光下预培养3d，选择没有污染，生长状况良好的梅花成熟子叶为受体材料。2.转化载体材料:1)⑶S报告基因携带GUS报告基因所用的根癌农杆菌菌株为EHA105 (由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室宋建坤惠赠)为一种报道和常用的商业菌株，该菌株包含商业质粒pBI121(见GenBank，基因登录号:AF485783.1，该质粒的物理图谱参见图2，其携带⑶S报告基因和NPTII选择基因(该⑶S基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示)，NPTII选择基因(其核苷酸序列见序列表SEQ ID N0:2所示)。2)正义 PmCBFb 基因携带正义PmCBFb基因的根癌农杆菌菌株为EHA105 ( —种报道的商业菌株，由华中农业大学作物园艺植物生物学教育部重点实验室过聪惠增)，该农杆菌包含表达载体pCAMBIA2300s (该载体的原始来源为澳大利亚CAMBIA实验室，一种公开销售的商业载体，其物理图谱参见图3)，该载体正向插入PmCBFb目的基因(其序列见GenBank，登陆号:HM099910.1所示，参见序列表SEQ ID NO:3)，携带NPTII选择基因(见序列表SEQ ID NO:2)。3.遗传转化方法:
I)受体材料的准备:以梅花‘米单绿’、‘雪梅’(来源同上)成熟子叶为外植体，将所述的外植体成熟子叶接种到成熟子叶再生培养基中，置于24±2°C，光照强度为20001X光下预培养3d(在另外的实施例中预培养时间为0-5d)，为遗传转化提供受体材料；2)菌株的制备:从_70°C冰箱中取出所保存的农杆菌EHA105(来源同上)，用接种环在含100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，然后将平板倒置于28°C温箱中黑暗培养直至单菌落产生。挑取单菌落接种于含有100mg/L卡那霉素LB液体培养基中，在28°C恒温摇床上200r/min振荡培养过夜。然后将对数生长期的菌液(0D_ = 0.6-0.8)从三角瓶中转入无菌的50ml离心管中，4000r/min离心lOmin，去上清液，将收集到的农杆菌菌体置于含有ΙΟΟμπιοΙ/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基(作为重悬液使用)中，在28°C恒温摇床上200r/min重悬培养2_4h后用于转化受体的侵染；3)侵染:将步骤I)中在梅花成熟子叶再生培养基中生长健壮、无污染的子叶转入制备好的菌液侵染20min ；4)共培养:将步骤3)中侵染过的梅花成熟子叶放在滤纸上除去菌液后接种到共培养培养基中，置于24±2°C,黑暗条件下培养3d ；5)选择培养:将步骤4)中共培养后的梅花成熟子叶转入选择培养基中，置于24±2°C光下培养，光照强度为20001X，每两周补充一次新鲜选择培养基直至不定芽分化；6)成苗培养:将步骤5)中再生出的不定芽接种到到成苗培养基中进行抗性芽的进一步的筛选和促进芽的生长，光下培养，光照强度为20001X，每四周补充一次新鲜的成苗培养基，直到得到抗性苗；7)生根培养:将步骤6)获得的抗性苗切成2-3厘米长的茎段转入生根培养基中进行生根培养，光下培养，光照强度为20001χ，从而获得抗性植株；本实施例涉及的培养基组分及配比见表表2本发明的梅花的遗传转化用的培养基设计
权利要求
1.一种农杆菌介导的梅花成熟子叶直接再生体系的遗传转化方法，其步骤包括遗传转化及植株鉴定，其特征在于，以梅花成熟子叶作为遗传转化的受体材料，不经过体细胞胚发生途径，通过直接的器官发生途径获得转化植株，其步骤经预培养、农杆菌侵染、共培养、选择培养、成苗培养和生根培养，将GUS报告基因和正义PmCBFb基因导入受体细胞，利用抗生素进行抗性筛选，通过GUS化学染色或PCR检测筛选得到转基因植株，其步骤如下所示: 1)预培养:将消毒后梅花成熟子叶接种到成熟子叶再生培养基中，置于24±2°C，光照强度为20001x光下预培养0-5d ； 2)菌株的制备:从_70°C冰箱中取出保存的包含有GUS报告基因和正义PmCBFb基因的农杆菌EHA105，用接种环在100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，然后将平板倒置于28°C温箱中黑暗培养直至单菌落产生；挑取单菌落接种于100mg/L卡那霉素LB液体培养基中，在28°C恒温摇床上200r/min振荡培养过夜；然后将对数生长期为0D_ = 0.6-0.8的菌液从三角瓶中转入无菌的50ml离心管中，4000r/min离心lOmin，去上清液，将收集得到的农杆菌置于ΙΟΟμπιοΙ/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基中，作为重悬液使用，在28°C恒温摇床上200r/min重悬培养2_4h后用于转化受体的侵染； 3)侵染:将步骤I)的梅花成熟子叶再生培养基中生长健壮、无污染的子叶转入步骤2)中制备好的农杆菌菌液侵染10-30min，期间每隔2_3分钟摇动一下； 4)共培养:将步骤3)中侵染过的梅花成熟子叶放在滤纸上除去菌液后接种到共培养培养基中，置于24±2°C,黑暗条件下培养l-5d ； 5)选择培养:将步骤4)中共培养后的梅花成熟子叶转入选择培养基中，置于24±2°C光下培养，光照强度为20001X，每两周补充一次新鲜选择培养基直至不定芽分化； 6)成苗培养:将步骤5)中再生出的不定芽接种到到成苗培养基培养，对获得的抗性芽进一步的筛选和促进生长，于光下培养，光照强度为20001X，每四周补充一次新鲜的成苗培养基，直到得到抗性苗； 7)生根培养:将步骤6)获得的抗性苗切成2-3厘米长的茎段转入生根培养基中进行生根培养，光下培养，光照强度为20001x，直到获得抗性植株； 8)将步骤7)中获得的转GUS报告基因的抗性苗进行GUS化学染色，验证获得转基因植株；或 提取步骤7)中获得的转正义PmCBFb基因植株的基因组DNA，进行PCR检测，验证获得转基因植株； 培养基组分及配制: 成熟子叶再生培养基:1/2MS，6-苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L, α -萘乙酸0.2mg/L，噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L,鹿糖30.0g/L,琼脂7.5g/L,用蒸懼水定容至1L, pH6.0 ； 共培养培养基:1/2MS，6-苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L, α -萘乙酸0.2mg/L,噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L,乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L,鹿糖30.0g/L,琼脂7.5g/L,用蒸懼水定容至1L,ρΗ6.0 ； 选择培养基:1/2MS，6-苄基腺嘌呤1.0-2.0mg/L, α -萘乙酸0.2mg/L,噻二唑苯基脲.0.2-0.4mg/L,卡那霉素20mg/L,头孢霉素300mg/L,鹿糖30.0g/L,琼脂7.5g/L,用蒸懼水定容至 1L，pH6.0 ； 成苗培养基:1/2MS，玉米素1.011^/1，3-吲哚乙酸0.lmg/L，卡那霉素20mg/L，头孢霉素300mg/L,鹿糖30.0g/L,琼脂7.5g/L,用蒸懼水定容至1L, pH6.0 ； 生根培养基:1/2MS，α -萘乙酸0.5mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂7.5g/L，用蒸馏水定容至1L, pH6.0。
1/2MS液体培养基:l/2MS+100ymol/L AS+蔗糖30.0g/L，用蒸馏水定容至lL，pH5.5。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)所述的成熟子叶预培养时间为3d。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的农杆菌的侵染时间为20min。
4.如权利要求1所述的方法 ，其特征在于，步骤4)所述的农杆菌与转化受体的共培养时间为3d。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的梅花成熟子叶再生体系的遗传转化方法。本发明的步骤包括遗传转化、筛选再生、GUS染色检测和PCR检测。其特征在于，通过农杆菌介导将GUS报告基因和PmCBFb基因导入受体梅花成熟子叶细胞中，对影响梅花成熟子叶转化的不同因素进行了筛选，利用卡那霉素作为选择剂，对转化后的受体细胞进行筛选，再通过GUS染色或PCR检测等辅助方法筛选得到转基因梅花植株。本发明的优点在于，本发明的遗传转化体系不经过体细胞胚发生途径，直接获得转基因植株，因而显著提高了梅花的遗传转化效率。
文档编号A01H4/00GK103215307SQ201210016150
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者张俊卫, 杨洁, 闻娟, 张蔚, 包满珠 申请人:华中农业大学