专利名称：短小芽孢杆菌LD-b1的发酵工艺及其在防治植物病害中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株防治植物病害的生防菌株，包括其发酵生产工艺及其在植物病害生物防治中的应用，属于生物农药技术领域。
背景技术：
自1898年Vogl从黑麦草种子中分离出第一株内生菌至今，内生菌的研究已经有100多年的历史。近年来的研究表明，几乎所有植物都存在内生菌，它们生长在植物表皮下的组织中，主要包括细菌、真菌和放线菌等。据Dreyfuss和Chapela估计,至少有数十万种内生菌存活于维管植物细胞内或细胞间隙的特殊环境中。我国的植物资源极其丰富，但由于近年来开荒、放牧、造林、采挖等诸多原因，很多野生植物资源遭受严重破坏。云雾龙胆是 龙胆科龙胆属多年生宿根草木植物，主治胃炎、气管炎、尿道炎、天花及痘疹，是龙胆属植物中少数未被系统研究过的珍贵药材，被国家列为重点保护品种。对云雾龙胆内生菌的分离和研发有利于保护濒危植物内生菌，并开发植物病害生物防治新的菌种资源。植物病害是影响农业生产的主要因素之一，目前的防治以使用化学农药为主，容易诱导病菌产生抗药性；而且化学杀菌剂污染环境，破坏农田中微生物菌群的生态平衡，残留的农药不仅影响农产品质量，而且危害人类健康。植物病害的生物防治方法安全有效，越来越引起人们的关注。但从土壤和植物根际分离筛选到的植物病害生防菌在植物体内定植困难，在与病害菌的竞争中难以占据优势。植物内生细菌占据有利生态位、不易受环境条件影响、容易定植于植物体中，能抗病原菌入侵，在植物病害生物防治中具有显著的优势。芽孢杆菌是常见的内生细菌种类，可以产生杆菌肽、环脂、氨基酸类、核酸类、类噬菌体颗粒等多种抗菌物质，能抑制多种植物病原菌；而且芽孢杆菌具有生长快、营养简单、抗逆性强等优点，非常适合开发成生防菌剂。
发明内容
本发明的目的是提供具有防治植物病害作用的一株短小芽孢杆菌菌株，发酵制备出高效的生防菌剂，能更好地防治农田植物病害，减少化学农药对环境的污染。本发明是从云雾龙胆的茎中分离筛选到一株具有广谱抗植物病害真菌活性的细菌，经鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，菌株代号为LD-bl。其生物学特征为革兰氏阳性，菌体细胞大小O. 5μπι O. 6μπιΧ1. 5μπι 2. Ιμπι ;接触酶、柠檬酸盐利用、酪蛋白水解、七叶苷水解、V. P为阳性；氧化酶、脲酶、H2S产生、吲哚产生、硝酸盐还原、明胶液化、精氨酸双水解酶、淀粉水解、Μ. R.为阴性；能够利用的碳源有葡萄糖、蔗糖、乳糖、树胶醛糖、木糖、半乳糖、甘露醇、N-乙酰-葡糖胺、葡糖酸盐；不能利用淀粉、糊精、蜜二糖、鼠李糖和山梨醇。菌株LD-bl现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年5月14日，保藏号为CGMCC No. 6112。本发明所述生防菌株LD-bl的发酵生产工艺流程为斜面菌种一摇瓶菌种一种子罐一生产罐一产品。本发明中生防菌株LD-bl发酵生产的详细步骤为将保藏菌种划线接种于固体斜面培养基上，培养基配方(g/L)为蔗糖10，蛋白胨2，牛肉膏3，酵母膏O. 5，琼脂15，pH7. 5 ;30°C培养36 48h，形成菌苔。用5mL无菌水将活化菌种从试管斜面上洗下，接入种子培养基中，培养基配方(g/L)为蔗糖15，蛋白胨5，酵母粉O. 2，磷酸氢二钾O. 5，硫酸镁O. 05，氯化钠O. 1，pH7. 5 ；250mL三角瓶装IOOmL的液体种子培养基，接种后的三角瓶置于旋转式摇床上，150r/min、30°C培养24 30h制成摇瓶种子液。种子罐的培养基与摇瓶种子的培养基相同，发酵条件为装 液量70%，接种量5%，发酵温度30°C，通气量I : 1，罐压O. 2kg/cm2，搅拌转速200 600r/min，溶氧10%以上，发酵时间24小时,菌量可达108cfu/mL。生产罐的培养基配方(g/L)为蔗糖25，豆饼粉3，硫酸铵2. 5，酵母粉O. 2，磷酸氢二铵O. 8，硫酸镁O. 05，硫酸亚铁O. 02，氯化钠O. 1，pH7. 5 ;发酵条件为装液量70%，接种量5%，发酵温度30°C，通气量I : 1，罐压O. 2kg/cm2，搅拌转速100 300r/min，溶氧5%以上，发酵30小时和45小时分别补加10g/L蔗糖两次，发酵时间68小时，菌量可达IOltlCfu/
mLo本发明中菌株LD-bl对植物病害真菌的生物防治效果混菌琼脂平板打孔法的试验表明，菌株LD-bl对黄瓜褐斑病菌、黄瓜灰霉病菌、黄瓜菌核病菌、苹果腐烂病菌、茄子枯萎病菌、小麦赤霉病菌、白菜黑斑病菌和番茄灰霉病菌等植物病害真菌的生长均有显著的抑制效果，其中对黄瓜褐斑病菌和苹果腐烂病菌的拮抗作用最强。菌株LD-bl在苹果果实上能够显著地抑制苹果腐烂病菌对果实的侵蚀；温室盆栽试验中，LD-bl对黄瓜褐斑病菌的防治效果达到81. 2%。
图I菌株LD-bl对苹果腐烂病菌生长的拮抗作用。图2菌株LD-bl对黄瓜褐斑病菌生长的拮抗作用。图3菌株LD-bl在苹果果实上对苹果腐烂病菌的抑制作用。图4菌株LD-bl防治黄瓜褐斑病害的盆栽试验。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。实施例I短小芽孢杆菌LD-bl的分离取新鲜云雾龙胆的一段茎，无菌水冲洗2次，用无菌滤纸吸干水分；在70%乙醇溶液中浸泡2分钟，再用O. I %升汞浸泡30秒，无菌水冲洗3次。在无菌条件下用刀片将外皮削去，并截成I厘米左右的小段，置于筛选培养基表面，30°C培养4 8天。待平板有菌长出后，平板划线纯化，得到分离细菌菌株的纯培养物。实施例2
菌株LD-bl的形态学特征LD-bl在固体培养基平板上30°C培养I天，形成乳白色不透明菌落，菌落近似圆形，边缘不整齐，中间有小突起，直径O. 6 I. 1cm，不分泌色素；菌株LD-bl的菌体细胞为短杆状，大小O. 5 μ . m O. 6 μ mX I. 5 μ m 2. I μ m,革兰氏阳性，有芽孢。菌株LD-bl的生理生化特征菌株LD-bl的生长温度范围为8 50°C，pH范围5. 5 8. 5，NaCl浓度范围O 7% ;能够利用的碳源有葡萄糖、蔗糖、乳糖、树胶醛糖、木糖、半乳糖、甘露醇、N-乙酰-葡糖胺、葡糖酸盐；不能利用淀粉、糊精、蜜二糖、鼠李糖和山梨醇；菌株LD-bl的接触酶、柠檬 酸盐利用、酪蛋白水解、七叶苷水解、V. P为阳性，氧化酶、脲酶、H2S产生、吲哚产生、硝酸盐还原、明胶液化、精氨酸双水解酶、淀粉水解、M. R.为阴性。菌株LD-bl的16S rDNA基因的PCR扩增和序列测定将菌株LD-bl接种于种子培养基，150r/min、30°C摇床培养24小时，离心收集菌体，用O. 5mol/LNaCl洗I次，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，用酚-氯仿法提取基因组DNA，用UNIQ-10试剂盒提取细菌基因组DNA。用细菌16S rDNA通用引物27F(5' -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和 1541R(5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')扩增得到目的基因片段。对菌株LD-bl的16S rDNA序列扩增，测序后获得1444bp的序列，具体如SEQ ID No I所示。该序列在GenBank/EMBL/DDBJ中的序列登记号为JF932295,序列分析表明菌株LD-bl 与 Bacillus pumilus KNUC389 和 Bacillus pumilusKNUC235 的同源性最高，分别为达到99. 8%和99. 7%，结合形态学和生理生化特征指标，确定菌株LD-bl为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。菌株LD_bl现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京)，保藏日期为2012年5月14日，保藏登记号为CGMCC No. 6112。实施例3菌株LD-bl的发酵生产工艺斜面培养基(g/L):蔗糖10，蛋白胨2，牛肉膏3，酵母膏O. 5，琼脂15，pH7. 5，121°C灭菌30min。种子培养基(g/L):蔗糖15，蛋白胨5，酵母粉0.2，磷酸氢二钾0.5，硫酸镁0.05，氯化钠 O. 1，ρΗ7· 5，121°C 灭菌 30min。发酵培养基(g/L):蔗糖25，豆饼粉3，硫酸铵2. 5，酵母粉O. 2，磷酸氢二铵O. 8，硫酸镁O. 05，硫酸亚铁O. 02，氯化钠O. I, ρΗ7· 5，121°C灭菌30min。将保臧菌种划线接种于固体斜面培养基上，30°C培养36 48h，用5mL无菌水将活化菌种从试管斜面上洗下，接入种子培养基中，250mL三角瓶装IOOmL的液体种子培养基，接种后的三角瓶置于旋转式摇床上，150r/min、30°C培养24 30h制成摇瓶种子液。种子罐培养条件装液量70%，接种量5%，发酵温度30°C，通气量I : 1，罐压
O.2kg/cm2,搅拌转速200 600r/min,溶氧10%以上,发酵时间24小时。发酵罐培养条件装液量70%，接种量5%，发酵温度30°C，通气量I : 1，罐压
O.2kg/cm2,搅拌转速100 300r/min,溶氧5%以上,发酵30小时和45小时分别补加IOg/L蔗糖两次，发酵时间68小时。实施例4短小芽孢杆菌LD-bl对病原真菌生长的拮抗效果
将黄瓜褐斑病菌、黄瓜灰霉病菌、黄瓜菌核病菌、苹果腐烂病菌、茄子枯萎病菌、小麦赤霉病菌、白菜黑斑病菌、番茄灰霉病菌活化和扩大培养，稀释制成IO6孢子/mL的悬液，取O. 2mL孢子悬液与灭菌改良马丁培养基15mL混合制成平板,凝固后,用灭过菌的6_直径打孔器在每个平板上打孔，除去孔内琼脂并向孔中加入O. ImL短小芽孢杆菌LD-bl发酵上清液，28°C培养4d后，测量抑菌圈直径。结果表明菌株LD-bl对黄瓜褐斑病菌、黄瓜灰霉病菌、黄瓜菌核病菌、苹果腐烂病菌、茄子枯萎病菌、小麦赤霉病菌、白菜黑斑病菌和番茄灰霉病菌等植物病害真菌的生长均有显著的抑制效果，其中对黄瓜褐斑病菌和苹果腐烂病菌的拮抗作用最强。实施例5短小芽孢杆菌LD-bl在苹果果实上对苹果腐烂病菌的拮抗效果将红富士苹果用70 %酒精消毒，晾干后，用接种针在苹果上刺一个6mm (深)X 4mm (直径)的伤口，分别加入200 μ L的LD_bl发酵上清液和无菌水，2小时后分别接种IO5孢子/mL的苹果腐烂病菌200 μ L，将果实放于果盘中，果盘用保鲜膜包裹，25°C放置6天，对照果实的病斑直径为17. 5mm, LD-bl样品处理后果实的病斑直径为2. 4mm,仅为对照的13. 7%，结果表明内生菌LD-bl产生的抑菌物质能够显著地抑制苹果腐烂病菌对果实的侵蚀。实施例6短小芽孢杆菌LD-bl对黄瓜褐斑病菌的盆栽防治效果选取生长一致的黄瓜苗，先将LD-bl菌液2mL均匀喷施在黄瓜叶片上，8h后接种IO6孢子/mL的黄瓜褐斑病菌孢子悬浮液2mL，以仅喷水而不喷施病菌的处理为阴性对照，以仅喷施黄瓜褐斑病菌孢子液的处理为阳性对照，室温保持25 28°C，湿度保持80% 90%，每处理3个重复，每个重复5株黄瓜苗，进行病级调查。黄瓜褐斑病严重度分级标准如下O级无病斑；1级病斑面积占整个叶面积的5%以下；3级病斑面积占整个叶面积的5% 25% ;5级病斑面积占整个叶面积的26% 50% ;7级病斑面积占整个叶面积的51% 75% ；9级病斑面积占整个叶面积的75%以上。病情指数和防效的计算方法如下
权利要求
1.一株防治植物病害的云雾龙胆内生菌，为革兰氏阳性的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus),菌株代号为LD-bl,该菌株于2012年5月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 6112。
2.防治植物病害的生防剂，包括短小芽孢杆菌LD-bl或从其来源的拮抗活性物质作为有效成分。
3.权利要求2所述的生防剂，其中植物病害包括黄瓜褐斑病、黄瓜灰霉病、黄瓜菌核病、苹果腐烂病、茄子枯萎病、小麦赤霉病、白菜黑斑病和番茄灰霉病。
4.短小芽孢杆菌LD-bl的培养基配方 种子培养基(g/L):蔗糖15，蛋白胨5，酵母粉O. 2，磷酸氢二钾O. 5，硫酸镁O. 05，氯化钠 O. 1，ρΗ7· 5，121°C 灭菌 30min。
发酵培养基(g/L):蔗糖25，豆饼粉3，硫酸铵2. 5，酵母粉O. 2，磷酸氢二铵O. 8，硫酸镁O. 05，硫酸亚铁 O. 02，氯化钠 O. 1，ρΗ7· 5，121°C 灭菌 30min。
5.短小芽孢杆菌LD-bl的种子罐培养条件 装液量70%，接种量5%，发酵温度30°C，通气量I : 1，罐压O. 2kg/cm2，搅拌转速200 600r/min，溶氧10%以上，发酵时间24小时。
6.短小芽孢杆菌LD-bl的发酵罐培养条件 装液量70%，接种量5%，发酵温度30°C，通气量I : 1，罐压O. 2kg/cm2，搅拌转速100 300r/min，溶氧5%以上，发酵30小时和45小时分别补加10g/L蔗糖两次，发酵时间68小时。
全文摘要
本发明提供一种可用于植物病害生物防治的云雾龙胆内生菌及其发酵工艺，属于生物农药技术领域。本发明所述菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)LD-b1，已于2012年5月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6112。混菌琼脂平板打孔法试验表明，菌株LD-b1可抑制多种植物病害真菌的生长。LD-b1能够显著抑制苹果腐烂病菌对苹果果实的侵蚀；温室盆栽试验中，LD-b1对黄瓜褐斑病菌的防治效果达到81.2％。将LD-b1在种子罐中培养24小时至对数生长期，按5％接种量接入生产罐，控制初始pH 7.5，发酵温度30℃，溶氧5％以上，补料分批发酵68小时，菌量可达1010cfu/mL以上。菌株LD-b1生长快，抗菌谱广，在植物病害生物防治方面具有很好的应用前景。
文档编号A01N63/02GK102965299SQ20121029037
公开日2013年3月13日 申请日期2012年8月16日 优先权日2012年8月16日
发明者黄海东, 杨红澎, 李晓雁 申请人:天津农学院