专利名称：一种防治植物土传病害杀菌微胶囊及其悬浮剂的制备和使用方法
技术领域：
本发明属于生物农药加工与应用领域，具体涉及一种防治植物土传病害的那他霉素微胶囊及其悬浮剂的制备和使用方法。
背景技术：
土传真菌病害一直是困扰果蔬生产的一大问题，如甘蓝枯萎病、西瓜枯萎病、黄瓜枯萎病等，这些病害轻则产量下降20%-30%，重则减产50%以上，甚至绝产。例如，北京延庆县2002-2006年期间甘蓝枯萎病年发生面积增加了 6. 5倍，年产量损失由2002的18万kg发展到2006年的137万kg，累计年产量损失达到403万kg。目前，该病害有快速发展和蔓 延态势，危害日趋加重，已经构成对当地甘蓝生产的巨大威胁，而且生产中缺少有效的防治措施，成为甘蓝生产中的防治难题[张扬等，中国农学通报，2007，23 (5)]。因此，研发新的病害防治技术迫在眉睫。其中，创制新农药是一条主要的途径，但研发出能够满足安全、高效、经济三原则的新药的概率越来越低，开发时间和费用也大幅度增加。相比之下，开发各种新的剂型和施用技术却是一条简单易行的方法。生物农药具有耗资少、周期短、无残留、无公害、特异性强、对人畜及天敌无副作用、不易产生抗性等优点。但不少生物农药存在稳定性较差、对光敏感等弱点，如那他霉素等。那他霉素(Natamycin, NA),又称匹马菌素。NA是纳他链霉菌(Streptomycesnatalensis)、利迪链霉菌 AOl (Sotrytis Iydicus)(中国专利:200710187435. I)等链霉菌的次生代谢产物，属抗生素类抗真菌剂。NA具有广谱、高效、安全、不易获得抗性等优点，目前已在饮料、饲料、食品及医药领域广泛应用，但在农业生产上很少使用，仅限于防治棉花和豆类的种菌病害。这是由于NA的分子结构属于多烯大环内酯，易受土壤、微生物、紫外光、等环境消解因素的影响而分解，从而限制了它的使用范围。微胶囊(MC)技术是一种用成膜材料将活性物质作为囊芯包覆起来形成微小粒子的技术，在医药、涂料、食品、纺织、日化、农业等行业中已被广泛应用(宋健等，微胶囊化技术及应用.化学工业出版社，2001，234-379)。微胶囊具有抑制因环境因素(如光、热、空气、雨水、土壤、微生物)造成囊芯活性成分的分解和流失，提高药剂本身稳定性的特点(高德霖，微胶囊技术在农药剂型中的应用，现代化工，2000, 20(2) : 10-14)。鉴于以上情况，以微胶囊化来解决NA易降解、持效期短的问题具有较大潜力。郑雅婧等采用复凝聚法制备了那他霉素微胶囊，并证实其具有良好的抗光解作用(郑雅婧等.那他霉素微胶囊的制备及性能测试.农药2012，51 (4) :267-269)，但是复凝聚法所制备的微胶囊释放速率较快，在土壤中持效期较短，不适宜较长时期有效控制土传病害。为此研制一种密封性好、释放缓慢的微胶囊十分必要。而选用原位聚合法(In Situ Polymerization)、并以密封性好的脲醒树脂作为壁材来制备微胶囊正是解决这一问题的良好途径
发明内容
本发明提供了一种防治植物土传病害的NA微胶囊的制备方法。为了提高NA抗土壤环境降解的能力，本发明采用原位聚合法制备了 NA微胶囊，以脲醛树脂作壁材，以疏水性药物NA为芯材，通过正交试验获得了制备NA微胶囊的优化工艺条件。采用本发明制备的微胶囊具有较高的包封率，在最佳制备工艺条件下平均包封率可达89. 55%(质量比)；以30%(体积比)甲醇溶液为释放介质，本发明的原位聚合法微胶囊在Ih和12h时，累积释放率分别为8. 7%和13. 1%，从12h以后释放速率趋于平缓，在120h时累累积释放率达到19. 6%。复凝聚法微胶囊在Ih和12h时，累积释放率分别为22. 4%和35. 2%，从12h到48h释放速率变平缓，但由48h到72h的这段时间，再次出现大量释放现象，从72h以后释放趋于平缓，在120h时累积释放率达63. 9%，这表明原位聚合法微胶囊较复凝聚法微胶囊释放更缓慢、更平稳，具良好的缓释性能。在同等浓度下加药24h时原位法MC的抑菌效果优于复凝聚法MC，说明原位法MC的囊壁具有良好的通透性。本发明还提供了那他霉素微胶囊悬浮剂(简称NACS)的制备和使用方法。田间药效试验表明，在甘蓝移栽初期(移栽后21天)，本发明的NACS-I和复凝聚法微胶囊NACS-2 防治甘蓝枯萎病的效果没有显著差异，它们的防治效果分别为65. 4%和64. 8%，优于多菌灵(51. 2%)和未包囊的NA浓缩液(11. 9%);在甘蓝种植后期(移栽后65天)，本发明的原位聚合法微胶囊(NACS-I)防治甘蓝枯萎病的效果显著优于复凝聚法微胶囊(NACS-2)，它们的防治效果分别为63. 2%和57. 6%，优于多菌灵(43. 8%)和NA浓缩液(5. 6%);这说明对生物农药NA进行微胶囊化可以改善环境因素导致的降解，而释放速率较慢的NACS-I较释放速率较快的NACS-2具有更好的持效性，更适宜于防治植物土传病害。抑菌试验表明，NACS具有杀菌的广谱性，对大部分植物土传病菌有良好的抑制作用。—种那他霉素微胶囊的制备方法，其特征在于，以脲醛树脂作为壁材，包括如下步骤按脲素和甲醛的摩尔比1:1. 5称取脲素和甲醛，将甲醛置于反应容器内，在磁力搅拌下按比例加入脲素，搅拌溶解后，用体积比为20%的氢氧化钠溶液调节pH为8. 0-9. O,65-75°C下反应50-70min，得到透明粘稠的脲醛树脂预聚体溶液；另称取那他霉素，分散于以质量计为那他霉素2-3倍量的质量浓度为7%-9%的苯乙烯马来酸酐水溶液中，搅拌下加入前述脲醛树脂预聚体溶液，使得那他霉素与脲醛树脂的质量比为l:l，5000-7000rpm分散8-12min，然后缓慢滴加体积比为10%的盐酸溶液调节pH至I. 5-3. O后，逐步升温至55-65°C，固化反应l_3h，自然降至室温，调节体系pH值至中性，即得那他霉素微胶囊悬浮液。该NA微胶囊悬浮液经浓缩后添加农药助剂后即得NA微胶囊悬浮剂(NACS)，制备方法可以为本领域制备农药悬浮剂的常规方法，例如先称取抗沉剂，加适量水充分化开，调成浆糊状，再加入经称量的微胶囊悬浮液，然后加入其它成分，在搅拌机转速800 IOOOrpm条件下充分搅拌均匀，即得那他霉素微胶囊悬浮剂(NACS)。悬浮剂以其总重量计，包含以下质量百分比的组分那他霉素O. 5% 5. 4% ;微胶囊壁材脲醛树脂O. 5% 10% ;抗沉剂O. 5% 10%、表面活性剂O. 5% 10%、余量为水。所述抗沉剂(又称增稠剂或悬浮稳定剂)选自聚丙烯酸钠、海藻酸钠和羧甲基纤维素中的一种或多种。所述表面活性剂选自0P-10、TX-10、土温-20和土温-80的一种或多种。微胶囊悬浮剂中还可以包括如下组分中的一种或多种，分散剂、防冻剂、消泡剂和pH调节剂，其使用剂量为本领域常规剂量。其中，分散剂选自木质素磺酸钠、NNO、MF等；防冻剂选自乙二醇、丙二醇、甘油、尿素等；消泡剂选自消泡剂GPE (敌泡)、聚醚类消泡剂7010等、有机硅铜类、CS 10的脂肪醇、ClO 20饱和脂肪族羧酸及其酯类、酯-醚型化合物等；pH调节剂选自醋酸、盐酸、氢氧化钠等。所述NACS优选含有下列以质量百分比计的组分那他霉素1% 5% ;脲醛树脂I 8% ;表面活性剂O. 5% 10% ;抗沉剂O. 5% 10% ;余量为水。所述NACS的防治对象为真菌病害，所述病害为豌豆根腐病(Fusarium solanif. sp. pisi )、西瓜枯萎病(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)、黄瓜枯萎病(Fusariumoxysporum f. sp. cucumerinum)> 百合根腐病(Rhizoctonia solani)、桃枯萎病(Fusarium oxysporum f. sp. persica)、甘蓝枯萎病(Fusarium oxysporum Schl. f. sp.conglutinans)、棉花黄萎病(Verticillium dahliae)、棉花枯萎病(Fusarium oxysporumf. sp. vasinfectum)等,但不局限于上述真菌病害。一种那他霉素微胶囊悬浮剂的使用方法，具体操作步骤如下在农作物播种前、移·栽前5-7天和移栽后当天各用药剂处理土壤I次，按NA有效用量I 5g/m2，将微胶囊悬浮剂兑水稀释，均匀泼浇于地表，然后灌水2-3cm自然落干；每次用药后间隔7-10天再用药I次，连续2-3次。本发明具有以下优点( I)采用原位聚合法制备的NA微胶囊，具有良好的药剂缓释效果，在30%甲醇溶液中释放120h累积释放率仅为19. 6%，而且释放平稳；(2)由于微胶囊内的活性成分具有良好的缓释作用，因此较常规制剂具有较长的持效性，而且微胶囊囊壁可保护活性成分免于土壤及其微生物的分解作用，在田间甘蓝移栽后65天防治甘蓝枯萎病的效果仍可保持在63. 2% ；(3)微胶囊囊壁具有良好的通透性，用药后有良好的速效性；(4)采用原位聚合法制备NA微胶囊，反应条件温和，不会造成活性成分NA因高温而分解失效；(5)由原位聚合法制备NA微胶囊，粒径较小，90%粒径范围在I 20μπι，因此在水中悬浮性好，有利于药液的稳定性和施药的均匀性。(6)为作物生产，尤其是蔬菜生产，提供了安全的生物农药品种，保障了人民的身体健康。
图I为NA浓度与吸光值的标准曲线图2原位聚合法MC与复凝聚法MC的释放曲线比较
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。以下是实施例中涉及的菌种、原料、试剂、药剂和设备I、供试菌株植物病原真菌棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum f. sp. vasinfectum)、豌豆根腐病菌(Fusarium solani f. sp. pisi)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum)、百合根腐病菌(Rhizoctonia solani )、桃枯萎病菌(Fusarium oxysporumf. sp. persica)、甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schl. f. sp. conglutinans)。酵母菌啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)。以上植物病原真菌是由中国农业大学植物病理学系和北京市农林科学院植环所提供，啤酒酵母菌购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)。2、供试培养基PDA培养基马铃薯200g，洗净切成lcm3小块煮沸约30min后用四层纱布过滤， 滤液用蒸懼水补足至1000ml,加葡萄糖20g,琼脂15g, pH自然，121° C灭菌30min。3、供试药剂、试剂和农药助剂药剂纯度为95. 8% (质量比)那他霉素原药(粉末)(北京东方瑞德生物技术有限公司)；1.4g/L NA浓缩液；I. 4%NA微胶囊悬浮剂(复凝聚法，制备方法参照中国专利201110388140. 7);纯度为91. 7% (质量比)那他霉素标准品(USP);50%多菌灵可湿性粉剂。试剂99%脲素、37%甲醛、甲醇(AR)(国药集团化学试剂有限公司)。农药助剂抗沉剂羧甲基纤维素(CMC)，聚丙烯酸钠(分子量3X107)，海藻酸钠(CP，温州助剂厂)；表面活性剂苯乙烯马来酸酐(北京中西远大科技有限公司)、Tween-20、Tween-80 (中国医药公司北京采购供应站)、0P-10、TX-10 ;分散剂木质素磺酸钠、萘磺酸甲醛缩合物(如ΝΝ0、MF等)；抗冻剂乙二醇、丙二醇、甘油、尿素。4、仪器和设备DU800可见-紫外分光光度计(美国BECKMAN)、800型台式离心机(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)、生物显微镜(日本OLYMPUS)、STARTER-3C pH计(上海奥豪斯仪器有限公司)、ZKXF型真空干燥箱(上海树立仪器仪表有限公司)、THZ-300型恒温培养摇床(上海一恒科学仪器有限公司)、BT-9300H激光粒度分析仪(丹东百特科技有限公司)、450mL磨口二角瓶。5、供试作物品种甘蓝中甘21 (中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供)。试验例I那他霉素的抑菌谱测定采用抑菌圈法。供试植物病原真菌在PDA斜面上28° C恒温培养7天后，刮取其分生孢子和菌丝体置盛有无菌玻璃珠(直径2. 5mm)和无菌水的三角瓶中用力充分振荡，配成106 CFU/ml的菌悬液；取200 μ I菌悬液均匀涂布在PDA平板(直径9cm)上，用直径0. 7cm的无菌不锈钢打孔器等距离打制三个孔，然后向每孔内注入100mg/L NA浓缩液100μ1，25。C恒温培养48h，十字交叉法测量抑菌圈的直径；供试啤酒酵母菌测定方法按实施例3进行。每个处理3次重复。从表I中可以看出，除了对啤酒酵母菌的抑菌圈直径在3.00cm以下外，对其他病原真菌的抑菌圈直径均达到了 3. OOcm以上，最强的抑菌效果是对甘蓝枯萎病菌(oxysporum Schl. f. sp. conglutinans),直径达4. 47cm。由此说明NA具有广谱的抑制真菌的活性。表I那他霉素抑菌测定结果
权利要求
1.一种那他霉素微胶囊的制备方法，其特征在于，以脲醛树脂作为壁材，包括如下步骤 按脲素和甲醛的摩尔比I: I. 5称取脲素和甲醛，将甲醛置于反应容器内，在磁力搅拌下按比例加入脲素，搅拌溶解后，用体积比为20%的氢氧化钠溶液调节pH为8. 0-9. O,65-75°C下反应50-70min，得到透明粘稠的脲醛树脂预聚体溶液；另称取那他霉素，分散于以质量计为那他霉素2-3倍量的质量浓度为7%-9%的苯乙烯马来酸酐水溶液中，搅拌下加入前述脲醛树脂预聚体溶液，使得那他霉素与脲醛树脂的质量比为l:l，5000-7000rpm分散8-12min，然后缓慢滴加体积比为10%的盐酸溶液调节pH至I. 5-3. O后，逐步升温至55-65°C，固化反应l_3h，自然降至室温，调节体系pH值至中性，即得那他霉素微胶囊悬浮液。
2.根据权利要求I所述的制备方法，包括如下步骤 按脲素和甲醛的摩尔比I: I. 5称取脲素和甲醛，将甲醛置于反应容器内，在磁力搅拌下按比例加入脲素，搅拌溶解后，用体积比为20%的氢氧化钠溶液调节pH为8. 5，70°C下反应lh，得到透明粘稠的脲醛树脂预聚体溶液；另称取那他霉素，分散于以质量计为那他霉素2-3倍量的质量浓度为8%苯乙烯马来酸酐水溶液中，搅拌下加入前述脲醛树脂预聚体溶液，使得那他霉素与脲醛树脂的质量比为l:l，6000rpm分散10分钟，然后缓慢滴加体积比为10%的盐酸溶液调节pH至2. O后，逐步升温至60°C，固化反应2h，自然降至室温，调节体系PH值至中性，即得那他霉素微胶囊悬浮液。
3.—种那他霉素微胶囊悬浮剂，其特征在于，其中的微胶囊由权利要求I或2所述的方法制备，悬浮剂以其总重量计，含有如下质量百分比的成分那他霉素O. 5% 5. 4% ;脲醛树脂O. 5 10% ;表面活性剂O. 5% 10% ;抗沉剂O. 5% 10% ;余量为水。
4.根据权利要求3所述的微胶囊悬浮剂，其特征在于，悬浮剂以其总重量计，含有如下质量百分比的成分那他霉素1% 5% ;脲醛树脂I 8% ;表面活性剂1% 5% ;抗沉剂1% 8% ;余量为水。
5.根据权利要求3或4所述的微胶囊悬浮剂，其特征在于，所述微胶囊悬浮剂还含有如下组 分中的一种或多种分散剂、防冻剂、消泡剂和pH调节剂。
6.根据权利要求3或4所述的微胶囊悬浮剂，其特征在于，微胶囊外观为无规则晶体，囊壁由脲醛树脂组成，内含芯材那他霉素微晶I个，90%的那他霉素微晶的粒径范围在I 20 μ m,优选 10 μ m。
7.根据权利要求3或4所述的微胶囊悬浮剂，其特征在于， 所述表面活性剂选自OP-10、TX-10、吐温-20和吐温-80中的一种或多种。
8.根据权利要求3或4所述的微胶囊悬浮剂，其特征在于，所述抗沉剂选自聚丙烯酸钠、海藻酸钠和羧甲基纤维素中的一种或多种。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的杀菌微胶囊悬浮剂的使用方法，其特征在于，所述微胶囊悬浮剂用于防治植物土传真菌病害。
10.根据权利要求9所述的微胶囊悬浮剂的使用方法，其特征在于，在农作物播种前、移栽前5-7天和移栽后当天各用兑水稀释的微胶囊悬浮剂处理土壤I次，按那他霉素有效用量I 5g/m2均匀泼浇于地表，然后灌水2-3cm自然落干；每次用药后间隔7_10天再用药I次，连续2-3次。
全文摘要
本发明公开了一种防治植物土传病害杀菌微胶囊悬浮剂及制备方法。该微胶囊的芯材活性成分为那他霉素，以脲醛树脂为壁材，采用原位聚合法制备微胶囊。该微胶囊可用于防治农作物土传真菌病害，具有活性成分释放缓慢，持效期长、杀菌谱广、用量低、杀菌效果好、不易获得抗性等特点，有良好的开发应用前景。
文档编号A01N43/90GK102939962SQ20121043989
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者卢向阳, 刘伟成, 卢彩鸽, 郑雅婧, 张殿朋, 张涛涛 申请人:北京市农林科学院