专利名称：一种利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用植物愈伤组织繁殖和保存植物寄生线虫的人工培养方法，具体涉及一种利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法。
背景技术：
针线虫(Paratylenchusspp.)隶属于垫刃目(Tylenchida)垫刃亚目(Tylenchina)环总科(Criconematoidea)半穿刺科(Tylenchulidae)针亚科(Paratylenchinae),是一类外寄生植物线虫，主要侵染寄生植物的根和其他地下组织，影响植物的正常生长，导致产量和品质的下降。对针线虫的生物学、病理学、生态学和防治方法等进行测定和系统研究，需要有大量纯化的个体并予以长期保存，这就必须对针线虫进行人工繁殖和培养。曾有研究利用白三叶(Trifolium r印ens)的愈伤组织培养突出针线 虫(Par at y I enchu s pr o j e c tu s ),该方法需先在植物组织培养基上培养出愈伤组织再接种培养针线虫，过程繁琐，培养周期长；又由于组织培养基的存在，培养过程对无菌条件的要求很高，而针线虫作为植物外寄生线虫，比内寄生线虫更难做到表面的无菌消毒，该方法在培养过程中使用HgCl2溶液和双氯苯双胍己烷溶液对线虫进行表面消毒，消毒液浓度过低无法达到该方法所要求的消毒效果，而高浓度的HgCl2却会严重影响针线虫的生物活性。总之利用白三叶的愈伤组织培养针线虫的方法耗时耗力，各个环节的污染率较大，获得纯化线虫的效率低。
发明内容
本发明的目的在于针对针线虫人工繁殖和培养保存现有技术中的上述不足，提供一种利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，该方法可实现简单、高效大量繁殖针线虫的目的，同时还能长期保存针线虫并保持针线虫对植物的寄生性和致病性。本发明的目的通过下述技术方案实现一种利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，包括如下步骤(I)制备胡萝卜愈伤组织无菌条件下将干净的胡萝卜用酒精浸泡后灼烧，再将胡萝卜去表皮后切成薄片放入灭菌培养皿中，封口，放入培养箱培养至胡萝卜片长出愈伤组织。(2)针线虫的消毒和接种将针线虫用硫酸链霉素溶液消毒后，离心收集针线虫，用无菌水洗涤针线虫，再离心收集针线虫，最后用无菌水制备针线虫悬浮液，将针线虫悬浮液滴在胡萝卜愈伤组织上。(3)针线虫的繁殖和培养保存将接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织放入培养箱培养。上述利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，还包括线虫继代培养的步骤，是用无菌水或0. 2 0. 3被％硫酸链霉素溶液清洗培养针线虫的培养皿中的线虫，或用贝曼漏斗法分离胡萝卜愈伤组织上的针线虫，再重复步骤(2)和(3)的操作，即消毒、离心、接种培养。步骤(I)中所述的胡萝卜优选为新鲜胡萝卜，所述的新鲜胡萝卜为健康、无伤、采收2周以内的胡萝卜。步骤(I)中所述的酒精优选为90% (V/V)以上酒精。步骤(I)中所述的培养的条件优选为25 27°C黑暗培养。步骤(I)所述的制备胡萝卜愈伤组织的方法优选为将新鲜胡萝卜洗净晾干，在超净工作台中用95% (V/V)工业酒精中浸泡2min后灼烧，并重复2 3次，用无菌刀削去表皮，将胡萝卜切成约5mm左右薄片，放入灭菌培养皿中，封口，放入培养箱中于25°C黑暗培养至胡萝卜片长出愈伤组织。 步骤(2)中所述的针线虫的消毒优选为使用0. 2 0. 3wt%硫酸链霉素溶液表面消毒6 12h。步骤(2)中所述的离心的条件优选为4500 5000rpm离心2 5min,更优选的，所述的离心条件为4700rpm离心3min。步骤(3)中所述的繁殖的条件优选为将接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织放入培养箱23 27°C黑暗培养8 10周；更优选的，所述的繁殖的条件为将接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织放入培养箱25°C黑暗培养8 10周。步骤(3)中所述的培养保存的条件优选为将接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织放入培养箱22 25°C黑暗培养保存16周以上；更优选的，所述的培养保存的条件为将接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织放入培养箱23°C黑暗培养保存16周以上。不同属间的植物寄生线虫的生物学特性差异较大，并非所有的植物线虫都可以采用统一的方法进行培养，例如，在紫花苜蓿(Medicago sativa)的愈伤组织上可以培养茎线虫(Ditylenchus spp.),短体线虫(Pratylenchus spp.)和矮化线虫(Tylenchorhynchusspp.)等,却不能培养针线虫(Paratylenchus projectus)。现有技术中也可以用胡萝卜愈伤组织培养香蕉穿孔线虫(Radopholus spp.)、短体线虫(Pratylenchus spp.)和水稻干尖线虫(Aphelenchoides spp.)等,但是目前尚未有利用胡萝卜愈伤组织培养繁殖针线虫的研究报道。所以本发明的实现为针线虫的人工繁殖和培养保存提供了一种经济高效、操作简便的方法。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明培养得到的针线虫，能够为针线虫的生物学、病理学及分子生物学等方面的研究提供充足的虫源，并且操作简便、经济高效。(I)用无培养基培养的胡萝卜愈伤组织培养繁殖针线虫，与用植物组织培养基培养的白三叶愈伤组织繁殖培养方法相比，操作更加简便，培养材料更易获得。制备白三叶的愈伤组织需要植物组织培养基的存在，而制备胡萝卜愈伤组织时，直接将胡萝卜切成薄片放入无菌培养皿，于合适温度下2周后即可长出愈伤组织。(2)用白三叶愈伤组织培养针线虫，由于植物组织培养基的存在，对无菌条件的要求很高，该方法中使用的针线虫消毒液HgCl2溶液，影响针线虫的生物活性。而用胡萝卜愈伤组织培养针线虫的方法中使用0. 2 0. 3wt%的硫酸链霉素溶液消毒针线虫，既能达到消毒目的，又不影响针线虫的活性。(3)用胡萝卜愈伤组织培养针线虫，培养8周左右后，在培养皿皿底或(和)皿盖上即可出现大量针线虫，此时胡萝卜愈伤组织部分出现黄褐色病变组织，但整个胡萝卜片并不会污染腐烂，所以此时可以在超净台中用无菌水或者0. 2 0. 3wt%的硫酸链霉素溶液将游离在皿底或(和)皿盖上的针线虫冲洗收集下来，重新将该皿封口，放入培养箱继续培养，一段时间后，在皿底或(和)皿盖上重新出现大量线虫，可以重复上述步骤收集线虫。收集两到三次后，胡萝卜片大部分呈现黄褐色或黑褐色病变样，此时即可转皿继代培养。因此采用胡萝卜愈伤组织法不仅可以获得大量线虫满足实验所需，而且可以减少继代培养次数。
图1是放入培养皿中的胡萝卜片图。图2是2周后长出愈伤组织的胡萝卜片图。图3是被针线虫侵食的胡萝卜愈伤组织图。·图4是胡萝卜愈伤组织上培养繁殖的针线虫图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中如无特殊说明，均为本领域常规实验技术手段。实施例1针线虫在胡萝卜愈伤组织上的繁殖( I)胡萝卜愈伤组织的制备选取健康、无伤、刚采收2周以内的胡萝卜洗净晾干，在超净工作台中用95%(V/V)工业酒精浸泡2min后在酒精灯上灼烧，重复3次，至胡萝卜表皮由桔红色变成红褐色；用无菌刀削去胡萝卜表皮，切成厚5_左右的薄片，放入灭菌培养皿中(如图1所示)，用保鲜膜封口，放入25°C恒温培养箱黑暗培养，2周左右长出胡萝卜愈伤组织备用(如图2所示)。(2)针线虫的分离用贝曼漏斗法从采集的病根和病土中分离针线虫，具体方法如下选用直径12cm的玻璃漏斗，下面接一段IOcm左右的乳胶管，在乳胶管上装一个小玻璃试管，在漏斗中装满清水，将漏斗置于架上，在筛网上铺2层韧性较好的面巾纸，将剪碎的根系组织及根际土置于铺有面巾纸的筛网中，然后将筛网轻轻地放到漏斗中，沿漏斗侧壁轻轻地加清水，使筛网中样品尽量完全浸没在水中，由于趋水性和本身的重量，经过36小时线虫从根组织及土壤中游出，最后沉集到小试管中，如此收集到针线虫悬浮液。(3)针线虫的消毒和接种在体视显微镜下挑取针线虫雌虫20条，雄虫10条，放入装有0. 3wt%硫酸链霉素溶液的1. 5mL离心管中表面消毒6h后，将离心管置于离心机中，4700rpm离心3min，吸去上清液，加入无菌水洗涤线虫,4700rpm条件下，再次离心3min，如此重复3次。最后一次离心后，在超净工作台中，去除上清液，留0.1mL左右无菌水，摇晃均匀制成针线虫悬浮液，用移液器或无菌的胶头滴管吸取线虫悬浮液滴到制备的胡萝卜愈伤组织上，用保鲜膜封口后，放到恒温培养箱中，25°C条件下黑暗培养10周，该处理设置5个重复。(4)针线虫在胡萝卜愈伤组织上培养10周后线虫的收集和计数把接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织培养10周后，从培养箱中取出(被针线虫侵食的胡萝卜愈伤组织如图3所示)，先用清水冲洗培养皿和胡萝卜愈伤组织表面的线虫，将冲洗液收集到烧杯中，定容之后充分混匀，吸取ImL线虫悬浮液于洁净的培养皿中(胡萝卜愈伤组织上培养繁殖的针线虫如图4所示)，在体视显微镜下统计线虫数量，重复3次，然后根据定容的体积计算出定容溶液中针线虫的数量(NI)。把培养繁殖线虫的胡萝卜愈伤组织放入搅拌器中，加适量水搅拌，将搅拌后得到的悬浮液通过孔径250 u m、150 y m和13 y m的组合筛，用自来水反复冲洗后，用洗瓶冲洗收集孔径13 y m筛上的针线虫至小烧杯中按上述方法统计针线虫数量(N2)。记录每个重复的针线虫总量N=N1+N2，即为该胡萝卜愈伤组织上培养繁殖的针线虫的数量。最后计算出5个重复的平均值，即为挑取的20条雌虫、10条雄虫的针线虫，在胡萝卜愈伤组织上培养10周后的线虫数量。实验结果表明挑取的20条雌虫、10条雄虫的针线虫群体，在胡萝卜愈伤组织上培养10周后，针线虫数量可以达到平均9万条左右。实施例2针线虫在胡萝卜愈伤组织上的培养保存( I)胡萝卜愈伤组织的制备见实施例1
(2)针线虫的消毒和接种在前期培养繁殖针线虫的胡萝卜愈伤组织部分呈现黄褐色或黑褐色病变样时，在超净工作台中，将该培养皿中的针线虫用无菌水清洗并吸到离心管中，然后按实施例1所述消毒和接种方法，将针线虫消毒后接种到新制备的胡萝卜愈伤组织上，放到恒温培养箱中，23°C条件下黑暗培养保存。16周后，胡萝卜胡愈伤组织大部分呈现黄褐色或黑褐色病变样且有活针线虫存在。(3)针线虫的继代培养当前期培养保存针线虫的胡萝卜愈伤组织部分出现黄褐色病变组织，但整个胡萝卜片未污染腐烂，此时可在超净台中用无菌水或者0. 2 0. 3wt%的硫酸链霉素溶液将游离
在皿底或(和)皿盖上的针线虫冲洗收集下来，接种到制备的胡萝卜愈伤组织上。若胡萝卜片大部分呈现黄褐色或黑褐色病变样或出现污染症状时，可用贝曼漏斗法从该愈伤组织上分离针线虫，然后用特制的线虫挑针挑取20头以上的针线虫雌虫至装有0. 2被％硫酸链霉素溶液的离心管中，表面消毒12h后将离心管置于离心机中，4700rpm离心3min，吸去上清液，加入无菌水洗涤线虫，4700rpm条件下，再次离心3min，如此重复3次。最后一次离心后，在超净工作台中，去除上清液，留0.1mL左右无菌水，摇晃均匀制成针线虫悬浮液，用移液器或无菌的胶头滴管吸取线虫悬浮液滴到制备的胡萝卜愈伤组织上，用保鲜膜封口后，放到恒温培养箱中，23°C条件下黑暗培养保存。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，其特征在于包括如下步骤 (1)制备胡萝卜愈伤组织无菌条件下将干净的胡萝卜用酒精浸泡后灼烧，再将胡萝卜去表皮后切成薄片放入灭菌培养皿中，封口，放入培养箱培养至长出胡萝卜愈伤组织； (2)针线虫的消毒和接种将针线虫用硫酸链霉素溶液消毒后，离心收集针线虫，用无菌水洗涤针线虫，再离心收集针线虫，最后用无菌水制备针线虫悬浮液，将针线虫悬浮液滴在胡萝卜愈伤组织上； (3)针线虫的繁殖和培养保存将接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织放入培养箱培养。
2.根据权利要求1所述的利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，其特征在于还包括针线虫继代培养的步骤，是用无菌水或O. 2 O. 3wt%硫酸链霉素溶液清洗培养线虫的培养皿中的线虫，或用贝曼漏斗法分离胡萝卜愈伤组织上的针线虫，再重复步骤(2)和(3)的操作。
3.根据权利要求1所述的利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，其特征在于 步骤(I)中所述的胡萝卜为新鲜胡萝卜，所述的新鲜胡萝卜为健康、无伤、采收2周以内的胡萝卜； 步骤(I)中所述的酒精为体积浓度90%以上酒精； 步骤(I)中所述的培养的条件为25 27°C黑暗培养。
4.根据权利要求1所述的利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，其特征在于步骤(I)所述的制备胡萝卜愈伤组织的方法为 将新鲜胡萝卜洗净晾干，在超净工作台中用体积浓度95%工业酒精中浸泡2min后灼烧，并重复2 3次，用无菌刀削去表皮，将胡萝卜切成5mm薄片，放入灭菌培养皿中，封口，放入培养箱中于25°C黑暗培养至长出胡萝卜愈伤组织。
5.根据权利要求1所述的利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，其特征在于 步骤(2)中所述的针线虫的消毒为使用O. 2 O. 3wt%硫酸链霉素溶液表面消毒6 12h ； 步骤(2)中所述的离心的条件为4500 5000rpm离心2 5min。
6.根据权利要求5所述的利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，其特征在于所述的离心的条件为4700rpm离心3min。
7.根据权利要求1所述的利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，其特征在于 步骤(3)中所述的繁殖的条件为将接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织放入培养箱23 27°C黑暗培养8 10周。
8.根据权利要求7所述的利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，其特征在于 所述的繁殖的条件为将接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织放入培养箱25°C黑暗培养8 10周。
9.根据权利要求1所述的利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，其特征在于 步骤(3)中所述的培养保存的条件为将接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织放入培养箱22 25°C黑暗培养保存16周以上。
10.根据权利要求9所述的利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，其特征在于 所述的培养保存的条件为将接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织放入培养箱23°C黑暗培养保存16周以上。
全文摘要
本发明公开了一种利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，属于植物寄生线虫培养领域。该方法包括如下步骤(1)无菌条件下将胡萝卜用酒精浸泡后灼烧，去表皮后切成薄片放入灭菌培养皿中，封口，放入培养箱培养至胡萝卜片长出愈伤组织；(2)将针线虫用硫酸链霉素溶液消毒后，离心收集，用无菌水洗涤，再离心收集，最后用无菌水制备针线虫悬浮液，将悬浮液滴在胡萝卜愈伤组织上；(3)将接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织放入培养箱培养。本发明的方法不需要使用培养基培养，操作简便，使用硫酸链霉素溶液消毒不影响针线虫的活性，实现了简单、高效、大量繁殖针线虫的目的，同时还能长期保存针线虫并保持针线虫对植物的寄生性和致病性。
文档编号A01K67/033GK103004592SQ201210531519
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者谢辉, 王珂, 徐春玲, 李宇 申请人:华南农业大学