专利名称：一种甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物病害生物防治领域，特别是利用有益微生物对植物病害进行生物防治，具体涉及甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus),以及利用该菌株制备生物菌剂以及所述生物菌剂防治植物病害的应用。
背景技术：
植物病害的流行不但引起作物减产，给人类造成重大经济损失，甚至带来灾难性后果。植物病害的危害还会导致农产品品质低劣，不堪使用或加工，甚至导致人畜中毒。在植物病害的防治中，化学农药因为具有成本低、见效快、省时省力等优点曾一度成为人们的首选，但是，化学农药一般不可降解，随着化学农药的大量使用，引发了环境污染、生态破坏、食品污染等事件。这使研究开发利用生物农药成为植物保护工作者的重要研究课题。生物农药是指利用生物活体或其代谢产物针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂，具有安全、高效、无污染等特点，与保护生态环境和社会协调发展的要求相吻合，是未来农药发展的必然趋势。微生物农药是生物农药中应用最为广泛的一类，也是生物防治的重要材料。微生物源农药的主要成分是微生物活体及其次生代谢产物，由于微生物种类多样，其活性也很广泛，包括杀虫、杀菌、除草以及植物生长调节作用等。自然界中用于生防细菌的，主要有芽孢杆菌属、假单胞菌属。特别是 近几年，利用微生物防治植物真菌性病害由于对环境安全，可以减缓病原菌产生抗药性，已经成为当前防治植物病害的主流方法。甲基营养型芽孢杆菌是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，其生理特征多样，该菌在自然界中广泛存在，具有独特的一碳代谢途径，能够将自然界中取之不尽的一碳化合物如甲醇、甲醛等转变为菌体自身所需的营养物质，同时又会产生多种有益的代谢副产物L.丝氨酸、维生素B12、聚P羟基丁酸盐等。对人畜无毒无害，不污染环境，具备生命力强，繁殖快速能产生多种抗菌素和酶，具有抗菌活性和极强的抗高温、抗强酸强碱能力。甲基营养型芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在，而且是植物体内常见内生细菌，尤其是在植物的根、茎内部。甲基营养型芽孢杆菌通过成功定殖于烟草、水稻等植物根际、体表或体内，改变其周围菌群环境和种类，与病原菌竞争植物周围的位点，并且分泌多种抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到改良土壤和生防的目的，具有防病和促生作用。烟草青枯病是一种由青枯劳尔氏菌(Ralatonia solanacearum)引起的、以土壤传播为主的、毁灭性的细菌性病害。此病是热带、亚热带地区烟草的主要病害之一，在我国长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、湖南、四川及贵州烟区危害较重。目前，在生产中主要采用化学农药防治，但是无法有效防止该病发生，而且长期大量施用化学农药既容易使病菌产生抗药性，又容易造成严重的环境污染。水稻白叶枯病是由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae, Xoo)引起的，是水稻三大病害之一，在世界上几乎所有的水稻种植区均有发生，我国除新疆、西藏和东北的北部以外均有不同程度的发生，长江以南和江淮平原籼稻产区是常发区，严重影响水稻产量，目前主要依赖化学农药防治，但是长期使用，使病菌容易产生抗药性，并且严重污染环境。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的甲基营养型芽孢杆菌。本发明的另一目的在于提供所述甲基营养型芽孢杆菌的发酵方法，以及由该方法制备所得的发酵产物。本发明的另一目的在于提供甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂及其制备方法。本发明的另一目的在于提供利用所述甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂防治植物病害的用途。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种甲基营养型芽孢杆菌，其属于芽孢杆菌属，其命名为Bacillusmethylotrophicus ;保藏登记号为CGMCCNo. 6793,保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址北京市朝阳区大屯路；保藏时间为2012年11月07
曰。 本发明的上述甲基营养型芽孢杆菌是从烟草根际土壤分离得到的，通过菌株的分离、纯化以及筛选步骤获得的。菌株鉴定采用形态特征、生理生化实验、分子生物学鉴定法，以及16SrDNA同源序列比对分析最终确定上述保藏编号的菌株为甲基营养型芽孢杆菌(BaciIlusmethylotrophiIus)。本发明所述甲基营养型芽孢杆菌的发酵方法，所述方法包括下述步骤步骤一菌种活化将保藏登记号为CGMCCNo. 6793的甲基营养型芽孢杆菌菌种接种到LB固体培养基上面，于30°C活化培养48h，所述LB固体培养基配方为酵母浸膏3_5g，蛋白胨8-10g，NaCl 5g，琼脂15 20g，水1000ml,pH 7. 4 7. 6，连续转接3代，确保菌株纯度后，再接种到种子液中使用；步骤二 种子液的制备从LB固体培养基上挑取菌种接种到装有LB液体培养基的三角瓶中，于恒温振荡培养箱中振荡培养，即得到种子液，所述的LB液体培养基配方为酵母浸膏 3-5g，蛋白胨 8-10g，NaCl 5g，水 1000ml，pH 7. 4 7. 6 ;培养条件30°C，48h ;步骤三发酵培养将种子液先后进行种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养，得到发酵液；其中种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养步骤分别如下种子罐发酵培养FJ液体培养基，装料系数0. 7，培养条件35_37°C，42h，接种量6%，通气量 '2. 5L/min，搅拌转速200r/min ；大规模工业发酵培养FJ液体培养基，装料系数0. 7，培养条件35_37°C，60_70h，接种量6%，通气量2. 0L/min，搅拌转速220r/min ；其中在种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养中，种子液的接种量均占液体培养基总量的6-8% ；所述的FJ液体培养基配方为黄豆饼粉1.5%，蔗糖I %，KH2PO4 0. 05 %,MgSO4O. 02 %，NaClO.1 %，其余为水，所列百分比为重量百分比。
优选地，若在步骤三的发酵培养过程中有泡沫产生，可滴加敌消泡。进一步地，本发明提供由上述技术方案所述的甲基营养型芽孢杆菌的发酵方法制备所得的发酵产物。进一步地，根据上述发酵产物，本发明还提供一种甲基营养型芽孢杆菌的生物菌齐U，所述生物菌剂是通过如下步骤制得的步骤一过滤并浓缩产物将采用上述甲基营养型芽孢杆菌的发酵方法制备所得的发酵产物用草酸调节pH至6. 5-7. O后，将发酵产物通过截留分子量40000-100000k的无机陶瓷超滤膜过滤分离，操作温度为35-37°C，膜通量为50-60LMH，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为6-7倍，制得经浓缩的芽孢溶液，所述浓缩方法为使用50万Da的分子筛膜，蠕动泵流速为4档，通量为420ml/min，出液口压力为O. 08MPa ；步骤二 喷雾干燥向步骤一的经浓缩的芽孢溶液中添加1. 0%的填料，随后将芽孢溶液经喷雾制成粉末，喷雾干燥的进口温度为170-190°C，出口温度为65-85°C，进料速度60mL/min，喷头压力O. lOMPa，即得到本发明的甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂；所述填料为白炭黑、微细滑石粉、轻质碳酸钙或2500目超细重钙。进一步地，本发明提供将上述甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂防治植物病害的用途；特别是用于防治烟草、白菜、 水稻、棉花作物中的病害；优选地，所述烟草病害为烟草青枯病，该病害是由烟草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)引起的；所述白菜病害为白菜腐烂病，该病害是由软腐细菌(Erwiniacarotovora)引起的；所述水稻病害为水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病，所述病害均是由水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae)引起的；所述棉花病害为棉花角斑病，所述病害是棉角斑病黄单胞菌(Xanthomonas campestrispv. malvacearum(E.F. Smith)Dowson)引起的。除非另有说明，本申请说明书中的均为重量百分比。本发明具有以下有益效果1、由本发明的甲基营养型芽孢杆菌所制得的生物菌剂，其环境相容性好，具有很高的生物活性，特别是对由烟草青枯病具有较好的防效，通过实验证明，该甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂对烟草青枯病、白菜软腐病、水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病和棉花角斑病的防效高达80%以上。2、由本发明的甲基营养型芽孢杆菌制得的生物菌剂是采用新型工艺发酵、先进超滤浓缩分离技术研发的新型高活性高浓度生物菌剂，有效活孢子数达50亿/克以上。
图1为本发明的甲基营养型芽孢杆菌的16SrDNA同源序列比对分析树状图。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例作进一步的说明。实施例1 :本申请甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophilus)的分离与筛选(I)、芽孢杆菌的分离
称取烟草根际土壤IOg,倒入装有90ml灭菌水的锥形瓶中，200r/min振荡20min,80°C水浴30min, 10倍比稀释,涂布分离。(2)、芽孢杆菌的纯化根据细菌的特征及时挑取单个细菌落至LB固体培养基上，采用划线分离的方法纯化；纯化的细菌经革兰氏染色和芽孢染色，显示菌体呈杆状、产芽孢、G+的分离物为芽孢杆菌；所述LB固体培养基配方为酵母浸膏5g,蛋白胨8g,NaCl 5g,琼脂 15g，水 1000ml, pH 7. 4。(3)、拮抗芽孢杆菌的筛选用TTC培养基选择具有活性的烟草青枯病菌作为指示菌，将烟草青枯病菌配成2X108cfu/ml浓度的菌悬液，转接到BPA培养基上，制成青枯病菌含菌培养基。待吹干后，在平板中央接上述己分离纯化的芽孢杆菌菌株，30°C培养2-3d，测定抑菌圈直径和抑菌带(从活性菌菌落的边缘到抑菌圈的外缘)的大小。所述TTC培养基的配方为胰蛋白胨17. Og,大豆胨3. Og,氯化钠2. 5g,葡萄糖6. Og,硫乙醇酸钠O. 5g, L-胱氨酸O. 25g亚硫酸钠O.1g琼脂16. Og ;所述BPA培养基的配方为牛肉浸膏3-5g，蛋白胨5-10g，蔗糖10-12g，酵母浸膏l_2g，琼脂17-20g，加水至1L。分离筛选获得本申请的甲基营养型芽孢杆菌，实验室编号为LW-6。实施例2 :甲基营养型芽抱杆菌(Bacillus methy lotrophi lus)的鉴定对实施例1所得的甲基营养型芽孢杆菌的鉴定过程为(I)、形态特征在NA固体培养基上LW-6菌落呈现奶白色，菌落表面粗糙，边缘呈现锯齿状，透过电镜显示LW-6呈杆状，革兰氏阳性，周生鞭毛，单个细胞大小为O. 5-0. 6umX2. 0-2. 5um。所述NA固体培养基的配方为牛肉浸膏2_3g，蛋白胨5g，葡萄糖
2.5-3g，琼脂 16-18g，加水至 1000ml。(2)、生理生化实验通过对甲基营养型芽孢杆菌的生理生化特性试验(如表I所示)并结合该菌株的形态特征，对照《伯杰氏细菌手册》(Buchanan & Gibbons, 1984)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，2001)进行检索，鉴定该菌株为芽孢杆菌属。
表I本申请甲基营养型芽孢杆菌的生理生化特征
权利要求
1.一种甲基营养型芽孢杆菌，其属于芽孢杆菌属，其命名为 Bacillusmethylotrophicus ;保藏登记号为CGMCCNo. 6793,保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间为2012年11月07日。
2.根据权利要求1的甲基营养型芽孢杆菌的发酵方法，所述方法包括下述步骤 步骤一菌种活化将保藏登记号为CGMCCNo. 6793的甲基营养型芽孢杆菌菌种接种到LB固体培养基上面，于30°C活化培养48h，所述LB固体培养基配方为酵母浸膏3_5g，蛋白胨8-10g，NaCl 5g，琼脂15 20g，水1000ml,pH 7. 4 7. 6，连续转接3代，确保菌株纯度后，再接种到种子液中使用；步骤二 种子液的制备从LB固体培养基上挑取菌种接种到装有LB液体培养基的三角瓶中，于恒温振荡培养箱中振荡培养，即得到种子液，所述的LB液体培养基配方为酵母浸膏 3-5g，蛋白胨 8-10g，NaCl 5g，水 1000ml，pH 7. 4 7. 6 ;培养条件30°C，48h ;步骤三发酵培养将种子液先后进行种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养，得到发酵液；其中种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养步骤分别如下种子罐发酵培养FJ液体培养基，装料系数O. 7，培养条件35-37°C，42h，接种量6%， 通气量2. 5L/min，搅拌转速200r/min ；大规模工业发酵培养FJ液体培养基，装料系数O. 7，培养条件35-37°C，60-70h,接种量6%，通气量'2. OL/min，搅拌转速220r/min ；其中在种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养中，种子液的接种量均占液体培养基总量的6_8% ；所述的FJ液体培养基配方为:黄豆饼粉1.5%，蔗糖I%，KH2PO4 O. 05%,MgSO4O. 02%, NaClO.1 %，其余为水,所列百分比为重量百分比。
3.根据权利要求2的发酵方法，其中在步骤三的发酵培养过程中滴加敌消泡。
4.根据权利要求2至3任一所述的甲基营养型芽孢杆菌的发酵方法制得的发酵产物。
5.一种甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂，所述生物菌剂是通过如下步骤制得的 步骤一过滤并浓缩产物将权利要求4的发酵产物用草酸调节pH至6. 5-7. O后，将发酵产物通过截留分子量40000-100000k的无机陶瓷超滤膜过滤分离，操作温度为35-37°C， 膜通量为50-60LMH，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为6-7倍， 制得经浓缩的芽孢溶液，所述浓缩方法为使用50万Da的分子筛膜，蠕动泵流速为4档，通量为420ml/min,出液口压力为O. 08MPa ；步骤二 喷雾干燥向步骤一的经浓缩的芽孢溶液中添加1.0%的填料，随后将芽孢溶液经喷雾制成粉末，喷雾干燥的进口温度为170-190°C，出口温度为65-85°C，进料速度 60mL/min,喷头压力O.1OMPa,即得到本发明的甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂；所述填料为白炭黑、微细滑石粉、轻质碳酸钙或2500目超细重钙。
6.根据权利要求5的甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂防治植物病害的用途。
7.根据权利要求6的用途，所述植物病害是烟草、白菜、水稻、棉花作物中的病害。
8.根据权利要求6的用途，所述植物病害是烟草青枯病，白菜腐烂病,水稻白叶枯病、 水稻细菌性条斑病或棉花角斑病。
全文摘要
本发明涉及一种新的保藏登记号为CGMCCNo.6793的甲基营养型芽孢杆菌，该菌株是从烟草根际土壤分离得到的，通过菌株的分离、纯化以及筛选步骤获得的。本发明进一步提供所述甲基营养型芽孢杆菌的发酵方法、由该方法制备所得的发酵产物，以及基于该发酵产物的生物菌剂及其制备方法，进一步地还提供所述生物菌剂防治多种植物病害的用途。该生物菌剂环境相容性好，有效活孢子数达50亿/克以上，具有很高的生物活性，特别是对由烟草青枯病具有较好的防效，其对烟草青枯病、白菜软腐病、水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病和棉花角斑病的防效高达80％以上。
文档编号A01P1/00GK103045515SQ201210579899
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者唐满仓, 翟枫, 马玉明, 安德荣 申请人:陕西恒田化工有限公司