一种新型转基因质粒载体及其构建方法、体内含新型重组基因家蚕的培育方法
【专利摘要】本发明涉及一种新型转基因载体及其构建、体内含有新型重组基因家蚕培育方法，这种新型转基因家蚕具有一种重组的含MMP酶切位点的丝素重链蛋白基因，这项发明属于农业昆虫优良品种培育利用领域；新型转基因载体构建流程图见附图；利用MMPs酶切位点可被MMPs酶切的特点，将MMPs酶切位点引入到家蚕丝素中，使家蚕丝素具有新的性能，达到通过生物学方法对家蚕丝素改性的目的；本专利将含有MMPs酶切位点的重组丝素蛋白基因克隆到PiggyBac转座子载体上并将该载体通过显微注射的方法注入家蚕蚕卵内，蚕卵经孵化后通过选择眼睛发绿色荧光的个体确定培育成功的新型转基因家蚕。
【专利说明】一种新型转基因质粒载体及其构建方法、体内含新型重组 基因家蚕的培育方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业昆虫优良品种培育利用领域，具体涉及一种新型重组基因家蚕培 育方法领域。
【背景技术】
[0002] 作为一种天然材料，蚕丝在生物医学领域有着强劲的优势，如生物相容性，安全 性，可降解性，良好的机械性能等。蚕丝作为医用材料有着很多的要求，也会产生一些局限， 例如作为组织工程支架，它的降解速率要求和组织细胞的生长速率相一致，但是现有蚕丝 不能更好地被控制在合适的时间里被降解；作为药物输送体系，药物作用部位对蚕丝本身 的识别性很低，如果蚕丝具有更好的导向作用将在药物输送过程中发挥更大的作用；当蚕 丝参与肿瘤等疾病的治疗过程中，作为传感器，快速的反应时间还需要进一步的探索研究。 目前使用的蚕丝多为天然蚕丝，而从基因水平利用转基因技术对蚕丝蛋白进行改造，使改 造后的蚕丝蛋白具有更好的生物相容性，降解性以及特有的药物输送靶向性等特性将有着 很好的潜在价值。
[0003] 基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs)是降解细胞外基质 (extra-cellular matrix, ECM)的最重要的酶系，占 ECM降解酶总活性的70%以上，MMPs的 活化被认为是ECM降解的限速环节。利用MMPs酶切位点可被MMPs酶切的特点，已有相关 技术创新出现，如黄迪南等的发明专利：基质金属蛋白酶导向性重组人肿瘤坏死因子融合 蛋白及制备(专利申请号=2007100280375)。但目前还没有关于将MMPs酶切位点引入重组 丝素重链蛋白，构建新型家蚕丝素的报导。目前对家蚕丝素改性的方法有物理方法，如将蚕 丝制成微球/纳米颗粒等，但物理方法改性不能改变丝素的生物化学特性。也有化学方法， 如丝素蛋白的接枝改性等。化学方法对家蚕丝素进行加工改性，需要消耗更多的能源，甚至 造成环境污染。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于培育一种新型转基因家蚕，这种新型转基因家蚕具有一种重组 的丝素重链蛋白基因，并且这种重组丝素重链蛋白含有MMP酶切位点，解决化学方法耗能 多，环境污染问题，物理方法不能改变丝素的生物化学特性问题
[0005] 发明技术方案：本专利将MMP酶切位点引入到重组丝素重链蛋白基因中，构建一 种新型家蚕转基因质粒载体，并将这种新型载体采用显微注射法注入到产下一定时间内的 蚕卵中，通过观察蚕蛾眼部的荧光现象鉴定转基因是否成功，培育一种新型转基因家蚕，这 种新型转基因家蚕的培育方法将成为用生物学方法改造家蚕丝素，使家蚕丝素蛋白具有 MMP酶切位点的基础技术，达到丝素改性的目的。
[0006] 本发明第1个目的是采用基因克隆技术构建一种新型家蚕转基因质粒载体，这种 质粒载体具有一种重组的丝素重链蛋白基因，并且这种重组丝素重链蛋白含有MMP酶切位 点，通过以下方案实现：
[0007] 首先采用乙醇沉淀法提取家蚕(菁松）基因组，然后利用设计的引物PCR扩增出家 蚕重链N端和C端基因序列片段，接着运用pMD-18T simple载体连接技术，PCR技术，酶 切技术，T4DNA连接酶技术构建新型家蚕转基因质粒载体(构建流程图见图1)。
[0008] 本发明第2个目的是将已构建的新型家蚕转基因质粒载体采用显微注射法注入 到产下一定时间内的蚕卵中，通过观察蚕蛾眼部的荧光现象鉴定转基因是否成功，培育一 种新型转基因家蚕，这种家蚕基因组具有一种重组的丝素重链蛋白基因，并且这种重组丝 素重链蛋白含有MMP酶切位点，通过以下方案实现：
[0009] 首先将已构建的新型家蚕转基因质粒载体pBac[3XP3-EGFPafm]-FibH-GS-site 与Piggybac Help Plasmid进行等量混合，采用显微注射法将混合质粒注入产下一定时间 内的蚕卵中。通过观察后代蚕蛾眼部的荧光现象鉴定转基因是否成功，并通过基因组PCR 法及测序鉴定获得新型转基因家蚕。
[0010] 本发明的有益效果是：
[0011] 1、本发明提供的技术中将家蚕(菁松)基因组中丝素重链的N端和C端基因以及基 质金属蛋白酶的酶切位点基因序列克隆进PiggyBac载体中，采用显微注射的方法进行家 蚕蚕卵的转基因，达到了培育一种新型转基因家蚕的效果。这种新型转基因家蚕具有一种 重组的丝素重链蛋白基因，并且这种重组丝素重链蛋白含有MMP酶切位点。
[0012] 2、本发明提供的技术中将眼特异启动子3XP3启动子调控下转录的绿色荧光蛋 白基因置于PiggyBac载体中与重组丝素重链蛋白基因一同转入家蚕蚕卵中。达到了直观 分离培育成功的新型转基因家蚕的效果。
[0013] 3、生物学方法改造家蚕丝素，可减少丝素产品加工的步骤，从而减少能源的消耗。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1用于构建一种新型家蚕转基因质粒载体的流程图
[0015] 图2新型家蚕转基因质粒载体的PCR验证
[0016] 图3体视显微镜下观察对照组和实验组蚕蛾
[0017] 图4PCR扩增检测转基因蚕蛾基因组
[0018] 图5转基因蚕蛾基因组中片段Fib H-GS-site的测序结果。
【具体实施方式】
[0019] 本发明结合具体实施例作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不 用于限制本发明范围。
[0020] 实施例1
[0021] 本发明采用基因克隆技术构建一种新型家蚕转基因质粒载体，这种质粒载体具有 一种重组的丝素重链蛋白基因，并且这种重组丝素重链蛋白含有MMP酶切位点。具体步骤 如下：
[0022] 1，设计新型家蚕转基因质粒载体构建流程
[0023] 设计用于构建一种新型家蚕转基因质粒载体的流程，见图1。其中fibroin H指丝 素重链基因，PCR指聚合酶链式反应技术，FibH-N指丝素重链蛋白N端基因序列，A，B，F分 别指 Asc I，BamH I，Fse I 酶切位点，pMD-FibH-N 指克隆有 FibH-N 的 pMD-18T simple 载 体(购于Takara公司），FibH-GS-site-C指带有MMPs酶切位点的丝素重链蛋白C端基因序 列。
[0024] 2,家蚕(菁松）基因组提取
[0025] 取家蚕(菁松）5龄三天蚕的中肠，放入预冷的研钵中，加入液氮快速研磨 成粉状；将粉末刮入I. 5ml EP管中，加入抽提缓冲液（IOMm Tris-Cl (PH8. 0)，0. IM EDTA(PH8. 0)，0. 5%SDS) 700 μ 1，室温放置lh，再加入蛋白酶K至终浓度为500 μ g/mL，同时 加入RNase至终浓度为50 μ g/ml，放置于56°C水浴锅中水浴5h (每隔Ih摇晃一次）；取出 消化后的样品，加入等体积苯酚，摇勻后，12000rpm离心IOmin,取上清650 μ 1至新的I. 5ml EP管中；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25 :24 :1)，摇匀后，12000rpm离心lOmin，取上清 600 μ 1至新的I. 5ml EP管中；加入等体积的酚/氯仿（1 :1)，摇勻后，12000rpm离心IOmin, 取上清550μl至新的1.5mlEP管中；加入等体积的氯仿，摇勻后，12000rpm离心10min，取 上清500 μ 1至新的I. 5ml EP管中；加入900 μ 1预冷的无水乙醇，再加入100 μ 13M NaAC (ΡΗ5. 2)，置于-20°C冰箱中冰冻15min ;12000rpm离心lOmin，沉淀DNA，弃上清；用lml70% 冰乙醇洗涤沉淀2次，然后尽量弃上清，自然晾干，使乙醇挥发殆尽；加入40μ1 dd H20灭 菌dd H20,溶解沉淀2h或者4°C过夜，_20°C保存备用。
[0026] 3,聚合酶链式反应（PCR)扩增丝素重链蛋白基因目的序列
[0027] (1)引物设计
[0028] 以家蚕(菁松）基因组为模板，利用Primer Premier5. O设计以下引物：
[0029] Asc ! ： Fib-H-p I i^iictiGGCGCGCCtucmuatcaiigaaaaat^-.V X O O O O C5 CO O GGCGCGCC Fib-H-p2 51-cgC3GATCCtgcaccgactgcagcactagtg-3 5 BaniH i: GGATCC 5'-c ^GCj ATCCgetgetgetgiittccccattii Ligtttutauuc Big-o-p3 ^ ---- ' ' 一 BamH i： GGATCC tggtggtggtggttccagcgtcagttacggagcrgg-S5 Fse I : Fib-H-p4 5,-ucgGGCCGGCCtataiitattcttauttiiau-3 , GGCCGGCC
[0030] 其中Fib-H-Pl和Fib-H-p2是用来扩增家蚕丝素重链N端基因的引物对， Fib-H-pl和Fib-H-p2分别为上游引物和下游引物。Big-〇-p3和Fib-H-p4是用来扩增家蚕 丝素重链C端基因的引物对，Big-〇-p3和Fib-H-p4分别为上游引物和下游引物，Big-〇-p3 引物中含有MMPs酶切位点序列。
[0031] (2)PCR扩增：利用设计的引物对提取的家蚕基因组进行PCR扩增获得家蚕丝素重 链N端和C端基因序列片段。PCR扩增体系如下 ：
[0032]
【权利要求】
1. 一种新型家蚕转基因质粒载体，其特征在于，质粒载体含有重组丝素重链蛋白基因， 重组丝素重链蛋白含有基质金属蛋白酶（MMPs)酶切位点。
2. 根据权利要求1所述的一种新型家蚕转基因质粒载体，其特征在于，质粒载体为 PiggyBac转座子载体。
3. 根据权利要求1所述的一种新型家蚕转基因质粒载体，其特征在于，PiggyBac转座 子含有眼特异启动子3XP3启动的绿色荧光蛋白基因。
4. 一种新型家蚕转基因质粒载体构建方法，其特征在于，步骤如下： A :采用沉淀法提取家蚕基因组； B :PCR扩增丝素重链蛋白基因目的序列； C、构建新型家蚕转基因质粒载体。
5. 根据权利要求4所述的新型家蚕转基因质粒载体构建方法，其特征在于，PCR扩增丝 素重链蛋白基因目的序列过程，先PCR引物设计，以家蚕(菁松)基因组为模板，利用Primer Premier5. O设计引物，引物中含有MMPs酶切位点序列。
6. 根据权利要求4所述的新型家蚕转基因质粒载体构建方法，其特征在于，构建新型 家蚕转基因质粒载体，其载体构建方法如下： (1) 构建质粒：将引物Fib-H-pl和Fib-H-p2的PCR产物直接连接至pMD-18T simple 载体中，构建质粒pMD-FibH-N ; (2) 制备感受态细胞； (3) 转化、存菌； (4) 质粒提取； (5) DNA的琼脂糖凝胶电泳及胶回收； (6 )对提取好的质粒pMD-FibH-N和经琼脂糖凝胶电泳及胶回收的PCR产物 FibH-GS-site-C进行双酶切；酶切后胶回收FibH-N序列和FibH-GS-site-C序列，并用 T4DNAligase 连接； (7) 第6步连接产物胶回收后以引物对Fib-H-pl和Fib-H-p4PCR扩增含MMPs酶切位 点的重组丝素重链蛋白基因； (8) 对第7步PCR产物的胶回收产物和转基因载体质粒pBac[3XP3-EGFPafm]进行双 酶切； (9) 酶切后胶回收目的序列，并用T4DNA Iigase连接，构建新型家蚕转基因质粒载体， 并将连接产物转化至感受态细胞中。
7. -种新型转基因家蚕的培育方法，其特征在于，将已构建的新型家蚕转基因质粒载 体采用显微注射法注入到产下一定时间内的蚕卵中，通过观察蚕蛾眼部的荧光现象鉴定出 已经成功进行转基因的家蚕，并通过基因组PCR法及测序鉴定获得的转基因家蚕进行培 育，其步骤如下： (1) 质粒提取：将已构建的PiggyBac转座载体提取待用； (2) 显微注射：将PiggyBac转座载体注入蚕卵内的方法是在PiggyBac转座子载体与 Help质粒混合后，以0. 4 μ g/μ 1注射到非滞育的早期胚胎中； (3) 家蚕饲育； (4) 突光筛选：筛选具有PiggyBac转座载体的家蚕； (5) 转基因蚕蛾的PCR扩增测序：进一步检测筛选出的家蚕是否具有转基因。 (6) 家蚕培育：对具有转基因的家蚕进行常规培育。
8. 根据权利要求7所述的新型转基因家蚕的培育方法，其特征在于，PiggyBac转座子 载体与Help质粒体积比例为1 :1。
9. 根据权利要求7所述的新型转基因家蚕的培育方法，其特征在于，注射量为15-20ng (10-15nl)DNA。
10. 根据权利要求7所述的新型转基因家蚕的培育方法，其特征在于，早期胚胎为产卵 后1?3h〇
【文档编号】A01K67/04GK104212833SQ201310209747
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年5月30日 优先权日:2013年5月30日
【发明者】黄国平, 孙春凤, 陈克平, 姚勤, 陈慧卿, 张春霞, 张志燕 申请人:江苏大学