一种药用植物荆芥的组织培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种药用植物荆芥的组织培养方法，该方法以荆芥种子为试材，获得无菌试管苗，再以无菌叶片为外植体，以60℃热水浸泡5min,75%乙醇浸泡45S，2%—5%NaClO加几滴吐温-80消毒10—20min是荆芥种子的最佳消毒方法；以MS培养基为基本培养基，附加TDZ0.5mg/L+IAA0.005mg/L适于叶片再生芽的诱导；附加NAA0.2mg/L适于愈伤组织的诱导；附加6-BA1.0mg/L+IAA0.2mg/L适于愈伤组织的分化。以1/2MS培养基为基本培养基，附加IAA0.01mg/L适于芽的伸长与与生根。该方法能较好的实现药用植物荆芥离体组织培养快速繁殖。本发明缩短了荆芥植物的育苗周期，以有选择性的进行荆芥植物的定向性大规模工厂化生产。
【专利说明】一种药用植物荆芥的组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种药用植物荆芥的快速繁殖技术，具体来说是一种药用植物荆芥的组织培养方法。
【背景技术】
[0002]荆芥为临床常用解表药之一，来源于唇形科植物裂叶荆芥Schizonepetatenuifolia Briq的干燥地上部分。传统中医学认为荆芥为入血分之风药，具有散邪解肌发汗，炒炭止血之功效。味辛，微温，归肝、肺经，用于感冒、头痛、麻疹、风疹、疮疡初起，炒炭治便血、崩漏、产后血晕。由于其味辛微温不烈，药性缓和:又辛散气香，善散风邪，既散风寒，又疏风热，亦能疏散血中夕风执.亦临床上运用广泛，或与辛温的羌活、独活、防风配伍，或与辛凉的银花、连翘、薄荷配伍，如荆防败毒散(《摄生众妙方》)、银翘散(《瘟病条辨.上焦篇》)等常用方剂，用于外感表证(表寒证、表热证)、麻疹不透、风疹痰痒和疮疡初期兼有表证者均有较好疗效，为历代医家喜好之品，在解表药中其地位独特而重要。现代药理研究表明荆芥解热作用较弱，而荆芥水煎剂具有较明显抗炎作用，故推测其对表证的治疗除与能驱除致病因素外，可能主要与抗炎作用有关，通过抗炎作用来消除或减弱致病因子所引起的病理变化。此外，中医药性学说认为辛味为解表药共同的药性特点，辛味药多含挥发油，是辛味药性的主要物质基础。
[0003]化学成分研究表明，荆芥含挥发油、单菇类、黄酮类及苯丙酸类等化学成分，其中挥发油为其主要有效成分，其含量变异较大，全草0.4-2.05%,穗0.51-4.11%，梗
0.14-0.60%，根和种子不含挥发油；荆芥生长的不同时期其挥发油含量有所变化，以山东产荆芥为例:初花期为0.96%，半穗期为0.64%，全穗期为0.41%。油中主要成分为右旋薄荷酮(d-Menthone)、消旋薄荷酮,少量右旋朽1檬烯(d_Limonene),除此之外尚含有α-菔烯(a -pinene)、茨烯(camphene)、β -菔烯(β -pinene)、3_ 辛酮(3-octanone)等。荆芥穗挥发油中还含有少量的醛、醚、酚`、醇及酮类化合物，荆芥炒炭后挥发油的含量显著减少(0.06%)，主要成分有所改变，产生一些生荆芥中没有的成分，致使两者在功能疗效上有所不同。
[0004]荆芥花还含有荆芥苷(schizonepetoside) A、B、C、D、E,香叶木素(diosmetin)、橙皮 6 (hesperidin)、木犀草素(Iuteolin)、芳:菜素-7-0- β -D-葡萄糖苷(aplgenio-7-O-β-D-glucoside)、木犀草素-7-0— β 一卜荀萄糖苷，咖啡酸、迷迭香酸
坐寸ο
[0005]荆芥全草中的单萜类成分除已知的荆芥二酮(schizonodilo) (6，8- 二羟基-4-薄荷烯-3-酮)、荆芥苷等外，最近又鉴别出了两个新的单萜类成分，分别为3-羟基-4⑶_烯-对-薄荷烧-3 (9)-内脂和1，2- 二羟基-8 (9)_烯-对-薄荷烧。
[0006]综上所述中药荆芥具有很大的药用价值，且为全草用药。但由于荆芥中药用成分的种类和数量因地区和气候的不同而有很大的差异，给品质的控制带来极大的困难。这些弊端使荆芥的种植受到很大的限制，不能满足日益增长的社会需要。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是建立一种药用植物荆芥的组织培养方法，规模化生产优质药用植物荆芥植物的种苗。该方法简单实用，高效迅速，适宜规模化生产。
[0008]发明人经过多重筛选实验优化培养繁育条件，提出了适宜药用植物荆芥植物的组织培养快速繁殖的方法。本发明选择优质荆芥植物的叶片为外植体；筛选了芽快速增殖的培养基组成成分；筛选了壮苗培养的条件；筛选了生根培养培养基的组成；筛选并建立了试管苗移栽及田间管理条件和措施。
[0009]本发明的技术方案具体为:
[0010]一种药用植物荆芥的组织培养方法，具体步骤包括:
[0011](I)无菌外植体的获得:在超净工作台上取荆芥种子，放在无菌离心管中，加60°C热水浸泡3-5min,把水倒出后再在离心管中加体积百分数为75%的乙醇没过种子,浸泡45S后倒出乙醇，再加2% — 5%的NaCIO，消毒10_20min，无菌水冲洗种子5— 6次，每次一分钟，然后接种在培养基中培养15-20天后长出荆芥试管苗；
[0012]所述的培养基是含0.6wt%琼脂以及1.5wt%蔗糖的1/2MS培养基，培养基pH6.0;
[0013]培养条件为培养温度25±1°C ;光10_12h/d，光照强度20001x ；
[0014](2)愈伤组织的诱导:选取较幼嫩的荆芥试管苗的不同部位接入MS+NAA0.2mg/L培养基中进行愈伤组织的诱导；
[0015](3)愈伤组织的分化与生根培养:将愈伤组织接入MS+6-BAL 0mg/L+IAA0.2mg/L的分化培养基进行愈伤组织的分化，将分化所得的芽接入1/2MS+IAA0.01mg/L的培养基中进行芽生根培养。
[0016]本发明与现有技术相比，本发明具有以下的优点和效果:
[0017]缩短了荆芥植物的育苗周期。传统的荆芥植物育苗周期长，难以满足大规模生产的需求，本发明可以大大缩短荆芥植物的育苗周期；
[0018]通过芽的繁殖进行快速繁殖，保证了遗传的稳定性。
[0019]具有普遍的适用性，本发明基于对荆芥植物类型的快速繁殖研究，均能进行试管快速繁殖，有助于今后筛选得到的荆芥优质品种或类型的快速繁殖与推广。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]本发明共有附图4幅，
[0021]图1为由种子发育的荆芥无菌试管苗；
[0022]图2为由荆芥愈伤组织诱导分化所得再生芽；
[0023]图3、图4为伸长、生根的试管苗。
【具体实施方式】
[0024]实施例1
[0025](I) 无菌外植体的获得:在超净工作台上取荆芥种子，放在无菌离心管中，加60°C热水浸泡3min,把水倒出后再在离心管中加体积百分数为75%的乙醇没过种子,浸泡45S后倒出乙醇，再加5%的NaCIO，消毒lOmin，无菌水冲洗种子6次，每次一分钟，然后接种在培养基中培养15天后长出荆芥试管苗；
[0026]所述的培养基是含0.6wt%琼脂以及1.5wt%蔗糖的1/2MS培养基，培养基pH6.0;
[0027]培养条件为培养温度25±1°C ;光12h/d，光照强度20001x ；
[0028](2)愈伤组织的诱导:选取较幼嫩的荆芥试管苗的不同部位接入MS+NAA0.2mg/L培养基中进行愈伤组织的诱导；
[0029](3)愈伤组织的分化与生根培养:将愈伤组织接入MS+6-BAL 0mg/L+IAA0.2mg/L的分化培养基进行愈伤组织的分化，将分化所得的芽接入1/2MS+IAA0.01mg/L的培养基中进行芽生根培养。
[0030]试验结果:将带有3条根且健壮的植株揭开封口膜炼苗3-5天，然后洗干净培养基，移入装有草炭土、河沙和珍珠岩(体积比为1:1:1)混合基质的营养钵中，置于温室，移栽时应注意保护试管苗的根尖，炼苗21天后进行田间移栽。移栽初期要注意遮荫与水分的补充，移栽苗的成活率达95%以上。该方法能较好的实现药用植物荆芥离体组织培养快速繁殖。本发明缩短了荆芥植物的育苗周期，以有选择性的进行荆芥植物的定向性大规模工厂化生产。
[0031]实施例2
[0032](I)无菌外植体的获得:在超净工作台上取荆芥种子，放在无菌离心管中，加60°C热水浸泡5min,把水倒出后再在离心管中加体积百分数为75%的乙醇没过种子,浸泡45S后倒出乙醇，再加2%的NaCIO，消毒20min，无菌水冲洗种子5次，每次一分钟，然后接种在培养基中培养20天后长出荆芥试管苗；
[0033]所述的培养基是含0.6wt%琼脂以及1.5wt%蔗糖的1/2MS培养基，培养基pH6.0;
[0034]培养条件为培养温度25± 1°C ;光10h/d，光照强度20001x ；
[0035](2)愈伤组织的诱导:选取较幼嫩的荆芥试管苗的不同部位接入MS+NAA0.2mg/L培养基中进行愈伤组织的诱导；
[0036](3)愈伤组织的分化与生根培养:将愈伤组织接入MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.2mg/L的分化培养基进行愈伤组织的分化，将分化所得的芽接入1/2MS+IAA0.01mg/L的培养基中进行芽生根培养。
[0037]试验结果:将带有3-4条根且健壮的植株揭开封口膜炼苗3-5天，然后洗干净培养基，移入装有草炭土、河沙和珍珠岩(体积比为1: 3: I)混合基质的营养钵中，置于温室，移栽时应注意保护试管苗的根尖，炼苗21天后进行田间移栽。移栽初期要注意遮荫与水分的补充，移栽苗的成活率达95%以上。该方法能较好的实现药用植物荆芥离体组织培养快速繁殖。本发明缩短了荆芥植物的育苗周期，以有选择性的进行荆芥植物的定向性大规模工厂化生产。
[0038]实施例3
[0039](I)无菌外植体的获得:在超净工作台上取荆芥种子，放在无菌离心管中，加60°C热水浸泡4min,把水倒出后再在离心管中加体积百分数为75%的乙醇没过种子,浸泡45S后倒出乙醇，再加3.5%的NaCIO，消毒15min，无菌水冲洗种子5次，每次一分钟，然后接种在培养基中培养18天后长出荆芥试管苗；
[0040]所述的培养基是含0.6wt%琼脂以及1.5wt%蔗糖的1/2MS培养基，培养基pH6.0;
[0041]培养条件为培养温度25±1°C ;光llh/d，光照强度20001x ；[0042](2)愈伤组织的诱导:选取较幼嫩的荆芥试管苗的不同部位接入MS+NAA0.2mg/L培养基中进行愈伤组织的诱导；
[0043](3)愈伤组织的分化与生根培养:将愈伤组织接入MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.2mg/L的分化培养基进行愈伤组织的分化，将分化所得的芽接入1/2MS+IAA0.01mg/L的培养基中进行芽生根培养。
[0044]试验结果:将带有3-4条根且健壮的植株揭开封口膜炼苗3-5天，然后洗干净培养基，移入装有草炭土、河沙和珍珠岩(体积比为1: 2: I)混合基质的营养钵中，置于温室，移栽时应注意保护试管苗的根尖，炼苗21天后进行田间移栽。移栽初期要注意遮荫与水分的补充，移栽苗的成活率达95%以上。该方法能较好的实现药用植物荆芥离体组织培养快速繁殖。本发明缩短了荆芥植物的育苗周期，以有选择性的进行荆芥植物的定向性大规模工厂化生产。
[0045]应用植物组织培养的方法很好的解决了【背景技术】中的弊端，应用组织培养快速繁殖的方法可以生产出大量优质的荆芥试管苗，从而可以解决荆芥繁殖系数低和品质难以控制的问题。通过愈伤组织再分化的途径则有可能筛选出药用成分含量高、产量也高的变异植株。从文献检索结果来看，国内外有关荆芥组织培养方面的工作少有报道，关于以荆芥组织培养为手段进行次生代谢产物荆芥挥发油类生产方面的研究尚属空白。因此本发明为提高荆芥产量开辟了一条行之有效的途径。
[0046]本发明的研究方法通过具体的实验进行了描述，本领域技术人员可借鉴本
【发明内容】
，适当改变生长激素、营养成分、实验条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范·围之内。
【权利要求】
1.一种药用植物荆芥的组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)无菌外植体的获得:在超净工作台上取荆芥种子，放在无菌离心管中，加60°c热水浸泡3-5min,把水倒出后再在离心管中加体积百分数为75%的乙醇没过种子,浸泡45S后倒出乙醇，再加2% — 5%的NaCIO，消毒10_20min，无菌水冲洗种子5— 6次，每次一分钟，然后接种在培养基中培养15-20天后长出荆芥试管苗； 所述的培养基是含0.6wt%琼脂以及1.5wt%蔗糖的1/2MS培养基，培养基pH6.0; 培养条件为培养温度25±1°C ;光10-12h/d，光照强度20001x ； (2)愈伤组织的诱导:选取较幼嫩的荆芥试管苗的不同部位接入MS+NAA0.2mg/L培养基中进行愈伤组织的诱导； (3)愈伤组织 的分化与生根培养:将愈伤组织接入MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.2mg/L的分化培养基进行愈伤组织的分化，将分化所得的芽接入1/2MS+IAA0.01mg/L的培养基中进行芽生根培养。
【文档编号】A01H4/00GK103583363SQ201310562935
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】李春斌, 金黎明, 岳玉莲, 刘宝全, 马洪丰 申请人:大连民族学院, 大连市金贵缘科技开发有限公司