一种离体快繁短月藓配子体的方法及其培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种离体快繁短月藓配子体的方法，包括以下步骤：1)将生长于自然环境中的短月藓孢蒴表面消毒后，接种到无任何激素的改良Knop′s培养基上培养10天后，孢子萌发形成原丝体，再培养30天后，经初生原丝体生长获得较多原丝体；2)将步骤1)得到的原丝体转接到诱导配子体产生的培养基上培养30天，获得配子体分枝；3)将步骤2)诱导培养得到的配子体单枝接种到配子体继代增殖的培养基上，培养30天，每个配子体可新生数量众多的新生配子体。本发明可以在短时间内实现人工大量扩繁短月藓配子体，为利用苔藓植物指示和监测大气污染提供大量理想试验材料，为应用苔藓植物进行园林造景提供丰富的种苗。
【专利说明】一种离体快繁短月藓配子体的方法及其培养基
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种利用植物组织培养技术进行离体快繁短月藓配子体的方法。
【背景技术】
[0002]短月藓(Brachymeniumnepalense Hook.)是隶属于真藓科(Bryaceae)的短月藓属(Brachymenium Schwaegr.)苔藓植物。植物体多强壮，中等大小，群集纵生,莖叶无或略具光泽，黄绿色至深绿色。茎直立，新生枝多数，高可达2cm (我国北方约lcm，因环境不同变化较大)。基部具红褐色假根，叶多丛集生于枝的顶端，呈莲座状。下部叶稀而小。干时皱缩，紧密螺旋于茎上。叶呈长圆状舌形、长圆状匙形或卵状长圆形，渐尖，除上部边缘扁平具齿外，叶多全缘背卷；中肋粗壮，贯顶呈长芒状，下部及叶基部呈红褐色。
[0003]苔藓植物由于结构简单，吸附力强，易对污染物做出反应。有关研究表明，苔藓类植物对大气环境污染因子的反应敏感程度是种子植物的10倍，苔藓植物会积累和集中有毒物质，即使有毒物质在环境中存在浓度很低。1968年，在荷兰召开的第一届关于大气污染对于动植物影响的欧洲会议上，苔藓植物因处理简单、对空气污染物敏感等优点被推荐作为污染的指示生物。目前，如何利用苔藓植物指示监测和研究环境重金属的沉降污染问题，已成为国际上环境科学研究的一个热点。
[0004]近年来，国内有关利用苔藓植物进行园林绿化和造景的研究正方兴未艾。追溯苔藓绿化的历史，日本园林中苔藓植物的应用可以追溯到奈良时代(公元12世纪。目前，仍保留各类苔藓庭院数十处(主要在京都地区)。西芳寺是日本历史最悠久的苔藓公园；美国的苔藓绿化历史可以追溯到1930年代，到1987年已经有人拥有1英亩以上的苔藓园了 ；英国在20世纪70年代建成了有37种苔藓植物的庭院；荷兰1982年建成了有57种苔藓的庭院。而我国目前还尚未有成形的苔藓园。
[0005]短月藓(Brachymenium nepalense Hook.)植株体较大，株型美观，分布广泛，易于采集。因此无论是利用它作为指示环境污染的指示植物还是作为园林绿化用苔藓均具有明显优势。
[0006]通过组织培养方式，建立短月藓快繁系统，既可以为利用短月藓指示和监测大气污染提供理想的试验材料，也可以为应用短月藓进行园林绿化和造景提供丰富种源。目前现有技术中还没有关于短月藓在培养瓶内大量扩繁配子体的培养技术，也没有通过利用短月藓孢蒴离体培养获得配子体的相关研究报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种利用植物组织培养技术离体快繁短月藓配子体的方法，以填补现有技术的空白，实现人工大量快速扩繁短月藓配子体。
[0008]为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
[0009]一种离体快繁短月藓配子体的方法，包括以下步骤:[0010]1)将生长于自然环境中的短月藓孢蒴表面消毒后，接种到无任何激素的改良Knop' s培养基上，用无菌器械破碎孢蒴使孢子释放，培养10天，孢子萌发产生原丝体，筛选获得无菌原丝体，再培养30天，经初生原丝体生长获得较多原丝体；
[0011]2)将步骤1)得到的无菌原丝体转接到诱导配子体产生的培养基上培养30天，获得配子体，高度约为0.3cm ；
[0012]3)将步骤2)诱导培养得到的配子体接种到配子体增殖扩繁的培养基上，培养30天，每个配子体可新生数量众多的新生配子体。
[0013]上述各步骤的培养条件为:温度23±2°C，光照强度20001x，光照时间14小时/天。
[0014]步骤(1)中所述无任何激素的改良Knop' s培养基配方为:改良Knop' s基本培养基+ 10g/L蔗糖+ 6g/L琼脂粉。
[0015]步骤(2)中所述诱导配子体产生的培养基配方为:改良Knop' s基本培养基+125mg/L KH2P04 + 10g/L 蔗糖+ 6g/L 琼脂粉。
[0016]所述改良Knop ' S 基本培养基配方为:KN03250mg/L、MgS04.7H20250mg/L、KH2P04250mg/L、Ca (N03) 2.4H20 1000mg/L、酒石酸氨 0.115mg/L、NaFe-EDTA 36.7mg/L、MnS04.4H20 11.15mg/L、H3B033.lmg/L、ΚΙ0.415mg/L、ZnS04.7H20 4.3mg/L、CuS04.5H200.0125mg/L、NaMo04.2H20 0.125mg/L、CoCl2.6H20 0.0125mg/L。
[0017]步骤(3)所述配子体增殖扩繁的培养基配方为:1/4MS基本培养基(大量元素化合物的用量为配方规定用量的1/4) +10g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，其中MS基本培养基配方为:KN031900mg/L、NH4N031650mg/L、MgS04.7H20370mg/L、KH2P04170mg/L、CaCl2.2H20 440mg/L、MnS04.4H20 22.3mg/L、ZnS04.7H20 8.6mg/L、H3B036.2mg/L、ΚΙ0.83mg/L、NaMo04.2H200.25mg/L、CuS04.5H20 0.025mg/L、CoCl2.6H20 0.025mg/L、Na2_EDTA37.3mg/L、FeS04.7H2027.8mg/L、NaFe-EDTA36.7mg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸 2.0mg/L、盐酸硫胺素 0.5mg/L、盐酸吡哆锌 0.5mg/L、烟酸 0.5mg/L ;其中大量元素化合物为:KN03、NH4N03> MgS04.7Η20、ΚΗ2Ρ04、CaCl2.2H20。
[0018]步骤(1)中短月藓孢蒴表面消毒方法为:分别用75%体积分数的酒精溶液消毒30秒钟和用0.1%质量体积比浓度的升汞溶液消毒5分钟。
[0019]步骤(1)中所述孢蒴来源于野外生长的短月藓配子体上生长的孢蒴。
[0020]本发明的有益效果为:首次建立了离体快繁短月藓配子体的方法，填补了现有技术的空白；并且，使用本发明的离体快速扩繁方法，极利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产；在短时间内可实现人工大量扩繁短月藓配子体，既可以为利用短月藓指示和监测大气污染提供理想的试验材料，也可以为应用短月藓进行园林绿化和造景提供丰富种源；科研与应用价值明显。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整的说明:
[0022]实施例1
[0023]剪取生长于自然环境中的短月藓孢蒴进行表面消毒，消毒剂为75%体积分数的酒精溶液和0.1%质量体积分数的升汞溶液；消毒后，将无菌孢蒴里的孢子接种到无任何激素的改良Knop' s培养基进行培养，以获得无菌原丝体。培养条件为:温度23±2°C，光照强度20001χ，光照时间14小时/天，培养10天后观察培养结果。
[0024]按常规方法制备75%体积分数的酒精溶液和0.1%质量体积分数的升汞溶液，用于短月藓配子体的表面灭菌，灭菌剂组合和灭菌时间为以下3种:
[0025]a) 75%体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1%质量体积分数的升汞溶液3分钟；
[0026]b) 75%体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1%质量体积分数的升汞溶液5分钟；
[0027]c) 75%体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1%质量体积分数的升汞溶液10分钟；
[0028]按常规方法制备无任何激素的改良Knop' s培养基，用于诱导孢子萌发形成原丝体的培养。培养基配方组成为:改良Knop' s基本培养基+ 10g/L蔗糖+ 6g/L琼脂粉。
[0029]所述改良Knop ' s 基本培养基配方为:KN03250mg/L、MgS04.7H20250mg/L、KH2P04250mg/L、Ca (N03) 2.4H20 1000mg/L、酒石酸氨 0.115mg/L、NaFe-EDTA 36.7mg/L、MnS04.4H20 11.15mg/L、H3B033.lmg/L、ΚΙ0.415mg/L、ZnS04.7H20 4.3mg/L、CuS04.5H20
0.0125mg/L、NaMo04.2H20 0.125mg/L、CoCl2.6H20 0.0125mg/L ；
[0030]孢蒴灭菌结果如下:
[0031 ] a) 75%体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1%质量体积分数的升汞溶液3分钟灭菌处理后，无菌原丝体获得率28.8%，污染原丝体获得率67.4%，孢子未萌发率3.8% ；
[0032]b) 75%体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1%质量体积分数的升汞溶液5分钟灭菌处理后，无菌原丝体获得率62.2%，污染原丝体获得率22.6%，孢子未萌发率15.2% ；
[0033]c) 75%体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1%质量体积分数的升汞溶液10分钟灭菌处理后，孢子未萌发率100% ；
[0034]比较上述灭菌结果可以看出:75%体积分数的酒精溶液30秒钟和0.1%质量体积分数的升汞溶液5分钟灭菌处理后，短月藓孢子无菌原丝体获得率最高，达到62.2%。
[0035]实施例2
[0036]将实施例1得到的无菌原丝体转接到诱导原丝体分化形成配子体的培养基上，进行培养30天。培养条件为:温度23°C，光照强度2000LX，光照时间14小时/天；
[0037]按常规方法制备诱导分化配子体产生的培养基，培养基配方组成为以下6种:
[0038]a)改良 Knop' s 基本培养基 _125mg/L KN03 + 10g/L 蔗糖+ 6g/L 琼脂粉；
[0039]b)改良 Knop' s 基本培养基+ 125mg/L ΚΝ03 + 10g/L 蔗糖+ 6g/L 琼脂粉；
[0040]c)改良 Knop' s 基本培养基-500mg/L Ca(N03)2.4H20 + lOg/L 鹿糖+ 6g/L 琼脂粉；
[0041]d)改良 Knop' s 基本培养基+ 500mg/L Ca(N03)2.4H20 + lOg/L 鹿糖+ 6g/L 琼脂粉；
[0042]e)改良 Knop' s 基本培养基 _125mg/L ΚΗ2Ρ04 + lOg/L 蔗糖+ 6g/L 琼脂粉；
[0043]f)改良 Knop' s 基本培养基+ 125mg/L KH2P04 + lOg/L 蔗糖+ 6g/L 琼脂粉。
[0044]所述改良Knop ' s 基本培养基配方为:KN03250mg/L、MgS04.7H20250mg/L、KH2P04250mg/L、Ca (N03) 2.4H20 1000mg/L、酒石酸氨 0.115mg/L、NaFe-EDTA 36.7mg/L、MnS04.4H20 11.15mg/L、H3B033.lmg/L、 ΚΙ0.415mg/L、ZnS04.7H20 4.3mg/L、CuS04.5H20
0.0125mg/L、NaMo04.2H20 0.125mg/L、CoCL2.6H20 0.0125mg/L ；
[0045]培养30天时的观察结果如下:[0046]a)改良Knop' s基本培养基_125mg/L ΚΝ03 + lOg/L蔗糖+ 6g/L琼脂粉中，无菌原丝体分化配子体速度较缓慢，分化出的配子体较少，同时原丝体生长速度也较慢。培养30天时，无菌原丝体平均长度约为4.8mm，分化出的配子体数量少且生长慢，均呈小芽状；
[0047]b)改良Knop' s基本培养基+ 125mg/L KN03 + 10g/L蔗糖+ 6g/L琼脂粉中，无菌原丝体分化出的配子体数量较少且生长速度慢。培养30天时，无菌原丝体平均长度约为
3.4mm,分化形成的配子体均呈小芽状；
[0048]c)改良 Knop' s 基本培养基 _500mg/L Ca(N03)2.4H20 + 10g/L 鹿糖+ 6g/L 琼脂粉中，无菌原丝体分化配子体速度一般，分化出的配子体数量较多，但配子体生长慢，均呈小芽状。同时，无菌原丝体生长速度较慢，平均长度约为3.5mm ；
[0049]d)改良 Knop' s 基本培养基+ 500mg/L Ca(N03)2.4H20 + lOg/L 鹿糖+ 6g/L 琼脂粉中，无菌原丝体分化形成配子体数量少且生长速度很缓慢。同时新生原丝体很少且短。培养30天时,无菌原丝体平均长度仅为1.8mm ；
[0050]e)改良 Knop' s 基本培养基-125mg/L KH2P04 + 10g/L 蔗糖+ 6g/L 琼脂粉中，无菌原丝体分化形成配子体速度一般，新生原丝体少且短，分化出的配子体数量较多但生长速度较慢，配子体茎杆较粗短。培养30天时，无菌原丝体平均长度为2.1mm，没有高度达
0.5cm以上的配子体；。
[0051]f)改良Knop' s基本培养基十125mg/L KH2P04 + 10g/L蔗糖十6g/L琼脂粉中，无菌原丝体分化形成配子体 速度较快，原丝体颜色浓绿且生长速度快，分化形成的配子体数量较多且生长较快。培养30天时，无菌原丝体平均长度为5.2mm,分化形成的配子体高度大多达到了 0.5cm。
[0052]比较上述培养结果可以看出，在改良Knop ^ s基本培养基基础上，增加或减少不同大量元素化合物的用量，对诱导短月藓原丝体分化形成配子体有很大影响。在改良Knop' s基本培养基基础上，再添加125mg/L ΚΗ2Ρ04既有利于无菌原丝体的生长又有利于原丝体分化形成配子体，且配子体能快速长高。
[0053]实施例3
[0054]将实施例2中f)诱导培养得到的配子体单枝接种到配子体增殖扩繁的培养基上，培养30天。培养条件为:温度23±2°C，光照强度20001x，光照时间14小时/天。
[0055]按常规方法制备配子体增殖扩繁的培养基，配方组成为以下四种:
[0056]a) MS基本培养基+ 10g/L蔗糖+ 6g/L琼脂粉；
[0057]b) 1/2MS基本培养基(大量兀素化合物的用量为配方规定用量的1/2) + 10g/L鹿糖十6g/L琼脂粉；
[0058]c) 1/3MS基本培养基(大量元素化合物的用量为配方规定用量的1/3) + 10g/L蔗糖十6g/L琼脂粉；
[0059]d) 1/4MS基本培养基(大量元素化合物的用量为配方规定用量的1/4) + 10g/L蔗糖十6g/L琼脂粉；
[0060]所述MS 基本培养基配方为:KN031900mg/L、NH4N031650mg/L、MgS04.7H20 370mg/L、KH2P04170mg/L、CaCl2.2H20 440mg/L、MnS04.4H20 22.3mg/L、ZnS04.7H20 8.6mg/L、H3BO36.2mg/L、ΚΙ0.83mg/L、NaMo04.2H20 0.25mg/L、CuS04.5H20 0.025mg/L、CoCl2.6H20
0.025mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS04.7H20 27.8mg/L、NaFe-EDTA 36.7mg/L、肌醇 lOOmg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素0.5mg/L、盐酸吡哆锌0.5mg/L、烟酸0.5mg/L ;其中大量元素化合物为:KN03、NH4N03、MgS04.7H20、KH2P04、CaCl2.2H20。
[0061]培养结果如下:
[0062]a) MS基本培养基+ lOg/L蔗糖+ 6g/L琼脂粉中，配子体茎叶基部分化形成很发达的原丝体系统，主要由大量褐色丝状体和部分绿丝体组成，且以配子体基部为中心呈辐射状生长，生长迅速；在原丝体上分化形成数量较多的新生配子体小芽。配子体叶腋处萌发形成少量新生配子体植株，平均长度为0.2cm ；
[0063]b) 1/2MS基本培养基+ 10g/L蔗糖+ 6g/L琼脂粉中，配子体茎叶基部分化形成发达的原丝体系统，由大量褐色丝状体和部分绿丝体组成，以配子体基部为中心呈辐射状生长；在原丝体上没有新生配子体小芽分化形成。
[0064]配子体叶腋处萌发形成少量新生配子体植株，配子体平均长度为0.3cm ；
[0065]c) 1/3MS基本培养基+ 10g/L蔗糖+ 6g/L琼脂粉中，配子体茎叶基部分化形成的原丝体系统由少量褐色丝状体和较多绿丝体组成，以配子体基部为中心呈辐射状生长，原丝体末端分支较多；在原丝体上没有新生配子体小芽分化形成。配子体叶腋处萌发形成很少量新生配子体植株，配子体平均长度为0.6cm ；
[0066]d) 1/4MS基本培养基+ 10g/L蔗糖+ 6g/L琼脂粉中，配子体茎叶基部分化形成的原丝体系统不发达， 褐色丝状体和绿丝体均很少，以配子体基部为中心呈辐射状生长；在原丝体上没有新生配子体小芽分化形成。配子体叶腋处萌发形成较多数量的新生配子体植株，且生长速度较快，配子体平均高度为0.8cm。
[0067]比较上述培养结果可以看出，在MS基本培养基基础上，改变其中大量元素化合物的用量，对诱导配子体形成原丝体以及由配子体形成新生配子体植株均有很大影响。当大量元素化合物的用量为MS配方规定用量的1/4时，既有利于获得较多数量的新生配子体植株又有利于新生配子体植株的生长。
[0068]以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的原理下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
【权利要求】
1.一种离体快繁短月藓配子体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:1)将生长于自然环境中的短月藓孢蒴表面消毒后，接种到无任何激素的改良Knop'S培养基上，用无菌器械破碎孢蒴使孢子释放，培养10天，孢子萌发产生原丝体，筛选获得无菌原丝体，再培养30天，经初生原丝体生长获得较多原丝体；2)将步骤1)得到的无菌原丝体转接到诱导配子体产生的培养基上培养30天，获得配子体；3)将步骤2)诱导培养得到的配子体接种到配子体增殖扩繁的培养基上，培养30天，每个配子体可新生数量众多的新生配子体。
2.根据权利要求1所述的离体快繁短月藓配子体的方法，其特征在于，步骤(1)、(2)和(3)的培养条件为:温度23±2°C，光照强度20001x，光照时间14小时/天。
3.根据权利要求1所述的离体快繁短月藓配子体的方法，其特征在于，步骤(1)中所述无任何激素的改良Knop' s培养基配方为:改良Knop' s基本培养基+ 10g/L鹿糖+ 6g/L琼脂粉。
4.根据权利要求1所述的离体快繁短月藓配子体的方法，其特征在于，步骤(2)中所述诱导配子体产生的培养基配方为:改良Knop' s基本培养基+ 125mg/L KH2P04 + 10g/L蔗糖+ 6g/L琼脂粉。
5.根据权利要求3或4所述的离体快繁短月藓配子体的方法，其特征在于，所述改良 Knop ' s 基本培养基配方为:KN03250mg/L、MgS04.7H20250mg/L、KH2P04250mg/L、Ca(N03)2.4Η201000π^/1、酒石 酸氨 0.115mg/L、NaFe_EDTA 36.7mg/L、MnS04.4Η20 11.15mg/L、H3B033.lmg/L、K10.415mg/L、ZnS04.7H20 4.3mg/L、CuS04.5Η20 0.0125mg/L、NaMo04.2Η200.125mg/L、CoCl2.6H20 0.0125mg/L。
6.根据权利要求1所述的离体快繁短月藓配子体的方法，其特征在于，步骤(3)所述配子体增殖扩繁的培养基配方为:1/4MS基本培养基(大量元素化合物的用量为配方规定用量的1/4) + 10g/L蔗糖+ 6g/L琼脂粉，其中MS基本培养基配方为:KN031900mg/L、NH4N031650mg/L、MgS04.7H20370mg/L、KH2P04170mg/L、CaCl2.2H20 440mg/L、MnS04.4H2022.3mg/L、ZnS04.7H20 8.6mg/L、H3B036.2mg/L、ΚΙ0.83mg/L、NaMo04.2H200.25mg/L、CuS04.5H20 0.025mg/L、CoCl2.6H20 0.025mg/L、Na2_EDTA37.3mg/L、FeS04.7H20 27.8mg/L、NaFe-EDTA 36.7mg/L、肌醇 100mg/L、甘氨酸 2.0mg/L、盐酸硫胺素 0.5mg/L、盐酸批口多锌 0.5mg/L、烟酸 0.5mg/L ;其中大量元素化合物为:KN03、NH4N03> MgS04.7Η20、ΚΗ2Ρ04、CaCl2.2H20。
7.根据权利要求1所述的离体快繁短月藓配子体的方法，其特征在于，步骤(1)中短月藓孢蒴表面消毒方法为:分别用75%体积分数的酒精溶液消毒30秒钟和用0.1 %质量体积比浓度的升汞溶液消毒5分钟。
【文档编号】A01H4/00GK103651140SQ201310669936
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】娄玉霞, 丁雪, 郭水良, 胡治祥 申请人:上海师范大学