一种用于获得无标记转基因植物的农杆菌转化载体组合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于获得无标记转基因植物的农杆菌转化载体组合物及其应用。本发明提供了一种用于获得无标记转基因植物的农杆菌专用载体组合物，由独立包装的重组载体和pClean系列载体的pClean-Soup载体组成；所述重组载体为将目的基因插入pClean系列载体的pClean-Green载体T-DNA区中，且将标记基因插入所述pClean-Green载体的另一个T-DNA区中，得到表达所述目的基因和标记基因的重组载体。从上述可以看出，本发明利用标记基因和目的基因在同一载体的不同T-DNA区的5TBTG154组合物，后代均可以获得较高比例的无选择标记转基因植株。本发明对转基因植物研究，尤其是小麦无选择标记转基因植株的获得和利用具有重要意义。
【专利说明】一种用于获得无标记转基因植物的农杆菌转化载体组合物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种用于获得无标记转基因植物的农杆菌转化载体组合物及 其应用。
【背景技术】
[0002]植物转基因技术是进行基因功能研究和通过基因工程进行植物遗传改良的重要工具。自1996年首例转基因作物商业化种植以来，目前世界各国已累计批准23种转基因作物进行商业化生产，涉及13类目标性状，包括抗虫、抗除草剂、抗病、育性改变、品质改良等。以抗除草剂和抗虫为主的大豆、玉米、棉花、油菜等转基因作物已经在全球22个国家和地区种植，2012年种植面积已达1.7亿公顷。转基因作物产业化已成为全球新的经济增长点，是增强农业国际竞争力的重要保障。
[0003]目前植物遗传转化方法众多，其中根癌农杆菌介导法(Agrobacterium-mediatedtransformation)和基因枪轰击法(particle bombardment transformation)是植物遗传转化的主要方法。两种方法各有优缺点，农杆菌介导法外源基因在植物遗传转化中的转化机理清楚、整合位点较稳定、拷贝数低、整合后的外源基因结构变异较小、遗传稳定性好，但存在受体基因型限制和骨架序列整合的缺点；基因枪转化法基本不受材料基因型的限制，但却存在转基因植株中整合有载体骨架序列和抗生素标记、目的基因的多拷贝、转基因沉默以及转基因后代遗传稳定性差等问题。
[0004]尽管多数国家对转基因产品的态度日趋积极，但转基因作物的潜在安全风险问题仍然受到公众的普遍关注，特别在欧洲一些国家转基因作物的争议非常激烈。在转基因作物中争议最大的是抗除草剂和抗生素类选择标记可能带来的潜在风险。如在环境方面，由于花粉飘移可能形成超级杂草、增加靶标生物抗性、对生物多样性影响等。在食品安全方面，包括标记基因所表达蛋白质致敏性，以及对受体作物本身营养成分、天然毒素和抗营养物质含量等方面的影响及其它可能的非预期效应。另外标记基因的存在也不利于基因的重复转化。因此建立安全转基因技术体系和培育无标记转基因植物已成为转基因技术研发的主要方向，也是各国在转基因【技术领域】进行技术创新的热点之一。
[0005]双元载体的发展和Gateway克隆技术的应用大大促进了农杆菌介导的遗传转化在植物基因工程改良中的应用，同时也使其成为获得无选择标记转基因植物的重要工具。从1983年Hoekema等把根癌农杆菌Ti质粒上的vir区和T-DNA区分离并置于两个复制子中，提出双元载体策略以来，双元载体的发展已取得了突破性的进展。双元载体的种类从最早pBinl9和pBI121的构建至今二十几年间，已发展了二十多个系列几十种载体,如:pCAMBIA, pMDC和pGreen双元载体系列等。与此同时,双元载体在以下几个方面得到了大幅度的优化:添加广适的复起制点，使其在大肠杆菌和农杆菌中能够自由复制；运用高拷贝复制子，以提高质粒的产量，便于体外亚克隆操作；降低载体质粒的长度和增加T-DNA内限制性内切酶位点，便于外源基因的亚克隆操作。在提高转化效率和增强外源基因表达稳定性方面，通过添加额外的vir基因、T-DNA转移增强序列(overdrive)、基因沉默抑制子等方面的改良，提高植物遗传转化效率和外源基因的稳定表达。双元载体的发展，使农杆菌介导的植物遗传转化技术广泛应用于植物基因研究的各个领域，如RNA干扰、基因过表达、多基因传递、功能基因组和蛋白质组研究等。然而通过传统的酶切、连接方法构建不同用途的载体，不仅耗时耗力，而且还受到酶切位点的限制，特别是对于高通量的功能基因组和蛋白质组研究来说，载体构建是一个最大的‘瓶颈’。Gateway技术的出现,克服了传统载体构建中遇到的上述问题。
[0006]Gateway克隆技术是Invitrogen公司基于λ曬菌体介导的位点特异性整合和删除系统而开发的。位于特异性位点att间的DNA片段,在重组酶BP Clonase或LR ClonaseEnzyme Mix的作用下,通过一步反应(attBXattP或attLXattR)便可将DNA片段转移到含相应重组位点的目的载体中，避免了载体构建中的酶切、连接等繁琐步骤。目前已报道了多种 Gateway兼容的双元载体,如pW、pMDC、pEarleyGate系列载体，每种载体系列都含有多种不同用途的载体类型。如PW系列载体包括过表达和反义表达载体、用于启动子分析含有LUC、GUS和GFP-GUS等基因的载体、用于基因融合的含GFP基因的载体和用于基因沉默的RNA干扰载体。
[0007]农杆菌介导的共转化标记基因剔除法以其操作简单、适用性广，且易产生非连锁位点而被广泛应用。共转化法将目的基因和标记基因分别置于两个独立的T-DNA中，农杆菌介导转化时，两个独立T-DNA可随机整合到染色体的不同位点，产生连锁或非连锁的共整合植株，这些非连锁的共整合植株通过自交和后代的分离便可获得无标记转化植株。两个独立的T-DNA可位于同一质粒上或各位于一个质粒上，共存于同一农杆菌中或各位于一个质粒上，存在于不同的农杆菌中。此外，其它形式结构的载体如利用载体骨架上的筛选基因和双RB边界等方法，也可通过农杆菌介导的共转化法获得无标记的转基因植株。如Huang等把目的基因置于T-DNA内，而将标记基因置于T-DNA左边界外的骨架序列上，将此载体转化玉米，实验结果表明，此法比利用多T-DNA法可获得较高的无标记植株；Lu等构建了含双R B和一个LB结构的T-DNA的载体，将标记基因置于两个RB序列间，而目的基因位于LB和RB间，用此载体转化水稻，有36-64%!；植株的后代发生了分离，并获得了抗水稻齿叶矮缩病毒无标记基因的转基因水稻植株。
[0008]Hellens等基于pBluescript载体构建了 pGreen/pSoup双元载体。其具有以下特点:减少了质粒长度，提高了在E.coli中拷贝数，便于体外操作和克隆；pGreen质粒只含有pSa-ori基因，只有在辅助质粒pSoup中pSa-RepA的存在下,才能够在农杆菌中复制,这样pGreen在非选择性条件下是不稳定的，在一定程度上增强了质粒的生物安全性；适应性广，可适合于单双子叶植物的转化；便于载体的改良和构建不同用途的载体，如可在pSoup质粒的多克隆位点附加额外的vir基因，从而提高大片段基因的转化和提高谷类作物的转化效率。通过将pSoup上连接一个T-DNA，使得pGreen和pSoup载体中均含有独立的T-DNA，从而产生marker-free转基因植株。
[0009]目前，pGreen载体已经广泛地应用于多种植物的转化，如拟南芥、烟草、豌豆、番爺等。此外，一些改良的新型pGreen/pSoup载体也已成功地应用于谷类作物如小麦、水稻的转化，用于提高转化效率或用于产生marker-free转基因植株的研究。如Wu等利用含Komari片段(包含VirB、VirC和VirG基因)pSoup载体,作为辅助质粒同pGreen载体转化四倍体小麦，结果表明，与pSoup载体(转化效率O)相比,含有Komari片段的改良载体可显著提高四倍体小麦Ofanto的转化效率(平均转化效率3.0%，最高可达9.7%)。用此改良载体在另一四倍体小麦Steward的转化中，也获得了一个较高的转化效率(平均转化效率
4.7%，最高可达12.3%)。Afolabi等通过在pSoup质粒中引入T-DNA，使之成为T载体，期望与pGreen载体中独立T-DNA的共转化,可获得marker-free的植株。在水稻转化实验中，成功分离获得了无选择标记的转基因水稻植株，并发现在Ttl阳性植株中，有50%的植株中标记基因和目的基因位于非连锁位点。
[0010]Thole等通过对pGreen载体改良，构建了 pClean系列载体。pClean系列双元载体，包括pClean-Green和pClean-Soup两种质粒。与pGreen载体相比,pClean系列载体具有如下特点:进一步减少了 T-DNA中的非必需序列(全长102nt，包括52nt的多克隆位点，而pGreen T-DNA结构全长777nt，包含728nt的多克隆位点);降低了 pClean-G与pSoup载体的同源性，增加了质粒的稳定性，pClean-G/pClean-S可与pGreen/pSoup匹配使用；优化了部分载体的LB序列，使其与胭脂型和章鱼碱型T-DNA的LB序列一致，扩大了宿主范围；部分质粒的RB外添加了额外VirGwt基因以提高转化效率；pClean-S质粒上添加了独立的T-DNA,可用于多基因的传递或marker-free植株的产生；pClean_G质粒LB外的骨架序列上含有多个单酶切位点，便于backnone的利用，如通过在backnone上插入选择标记基因，可获得maker-free植株的载体；部分载体含有双LB序列，以降低T-DNA的通读频率,减少骨架序列的整合。
[0011]综上所述，上述研究只采用了一种载体构建策略并应用于个别植物的遗传转化，目前在小麦和其它作物中的应用尚未见报道。此外，大部分载体的构建是为了验证农杆菌传递2独立T-DNA，产生mark-free植株的可行性，因此很多载体只在模式植物如烟草等中进行了转化，并未在重要农作物如小麦中应用。另外，目前报道的用于产生marker-free植株的载体，多数是通过传 统酶切连接构建的，很多载体是以gus基因为目的基因的，因为受酶切位点的限制，有些载体不便于用于目的基因的替换。
【发明内容】
[0012]本发明的一个目的是提供一种用于获得无标记转基因植物的农杆菌专用载体组合物。
[0013]本发明提供的专用载体组合物(5TBTG154)，由独立包装的重组载体和pClean系列载体的pClean-Soup载体组成；
[0014]所述重组载体(pG1854-UG)为将目的基因和标记基因插入pClean系列载体的pClean-Green载体2个不同的T-DNA区中，得到表达所述目的基因和标记基因的重组载体。
[0015]上述的载体组合物中，
[0016]所述目的基因通过通过gatway重组到pClean系列载体的pClean-Green载体的T-DNA 区；
[0017]所述标记基因以两端分别融合2LB和RB的DNA分子的形式插入pClean系列载体的酶切位点间，形成另一个含有标记基因的T-DNA区。
[0018]上述的载体组合物中，
[0019]所述pClean-Green 载体为 pCG181 或 pCG185 ；所述 pClean-Green 载体具体为pCG185 ；
[0020]所述pClean-Soup 载体为 pALl54。
[0021]上述的载体组合物中，
[0022]所述目的基因为⑶S基因，所述标记基因为bar基因。 [0023]上述的载体组合物中，
[0024]所述gus基因以gus表达盒的形式插入所述pClean-Green载体中；所述gus表达盒包括启动子Ub1、gus基因和终止子Nos ；
[0025]所述两端分别融合2LB和RB的DNA分子包括LB、第二个LB、启动子ub1、bar基因、终止子Nos和RB。
[0026]上述的载体组合物中，所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第1-3149位所示的核苷酸；序列I自5’末端第10-34位核苷酸为LB序列，35-60为间隔序列，61-85为LB序列，第1009-3004位核苷酸为ubi，第421-972位核苷酸为bar，第147-406位核苷酸为nos，第3079-3103位核苷酸为RB。
[0027]所述gus表达盒的核苷酸序列为序列表中序列2所示的核苷酸。
[0028]序列2所示的ub1:gus:nos表达盒，自5’末端第1-2034位核苷酸为ub1、自5’末端第2044-4059位核苷酸为gus、自5’末端第4069-4377位核苷酸为nos。
[0029]所述重组载体按照如下方法制备:
[0030]I)将 DNA 片段 attRl-cmR-ccdB_attR2 插入所述 pClean-Green 载体,得到中间载体A ;
[0031]2)将所述以两端分别融合2LB和RB的DNA分子的形式插入所述中间载体A酶切位点间，，形成另一个含有标记基因的T-DNA区，得到中间载体B ；
[0032]3)将所述目的基因与入门载体进行TOPO反应得到入门重组载体，再将所述入门重组载体与所述中间载体B进行LR反应，使所述目的基因插入所述中间载体B的另一T-DNA区，得到重组载体。
[0033]所述DNA片段attRl-CmK-CCdB-attR2的核苷酸序列为序列表中的序列3。
[0034]上述的载体组合物在鉴定或培育无标记转基因植物中的而应用也是本发明保护的范围；所述培养为利用农杆菌转染植物进行；
[0035]所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
[0036]所述单子叶植物具体为小麦。
[0037]本发明的另一个目的是提供一种用于获得无标记转基因植物的方法。
[0038]本发明提供的方法，包括如下步骤:
[0039]I)将上述的载体组合物中的重组载体和pClean-Soup载体共转染到植物外植体中，得到TO代转基因植物；
[0040]2)从TO代转基因植物中选取目的基因和标记基因共表达的TO代转基因植物，进行播种，收获Tl代转基因植物；
[0041]3)选取所述Tl代转基因植物中无标记基因且有目的基因的植株，得到无标记转基因植株。
[0042]上述选取所述Tl代转基因植物中无标记基因且有目的基因的植株的方法如下:
[0043]鉴定无标记基因bar的方法为PCR检测或BAR氨盐检测；[0044]鉴定有目的基因gus的方法为PCR检测或⑶S染色。
[0045]上述方法中，所述植物外植体为胚；
[0046]所述目的基因为gus基因，所述标记基因为bar基因。
[0047]上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
[0048]所述单子叶植物具体为小麦。
[0049]本发明利用pClean双元载体系列中的pClean_G181、pClean_G185和pClean-S167作为基础载体，对其T-DNA和载体骨架进行了一系列改良，如在pClean_G181、pClean_G185、pClean-S167T_DNA内引入Gateway系统，便于载体的快速构建；pClean-S167T-DNA内分别引入Ubiqutin启动子驱动的bar选择标记基因，可直接用于单子叶转化中的筛选标记；在pClean_G181和pClean_G185载体的backnone上插入了带不同T-DNA边界结构的bar表达盒,如含多个左边界或独立T-DNA等。构建了系列Gateway兼容的新型pClean安全高效双元载体,并用此转化小麦，成功获得了 marker-free转化植株。
[0050]本发明的实验证明，本发明通过gateway重组技术直接把目的基因或表达盒定向引入目的载体的T-DNA内，而另一 T-DNA内含有选择标记基因bar。利用此系统，通过把目的基因和选择基因分别置于同一质粒的两T-DNA内或2质粒的T-DNA内或把标记基因置于载体骨架上，通过农杆菌转化，可获得无选择标记的转基因小麦。所述获得无标记转基因小麦的方法是，通过2个独立的T-DNA或载体骨架与T-DNA共转化小麦未成熟胚，经筛选获得转基因植株，整合到 染色体不同位点的非连锁的T-DNA植株，经自交和后代分离，通过PCR检测，便可获得无标记的转基因小麦植株。利用本发明可进行植物尤其是小麦、玉米和水稻表达载体的高通量构建和培育无选择标记的转基因小麦、玉米和水稻。
[0051]从上述可以看出，本发明利用2种组合载体可以获得高的筛选无bar基因而只含有gus的无标记转基因植株效率，其中利用标记基因和目的基因在不同载体的T-DNA区5G7B组合物和利用标记基因和目的基因在同一载体的两个不同T-DNA区5TBTG154组合物，均可以获得高转化效率(分别为2.8±0.8%和4.0±2.1%)。结合后代获得无选择标记的转基因植株比例(分别为23.4%和19.7%)，我们认为，这两个载体组合更适合于获得无选择标记的转基因植物研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0052]图1为pClean双元载体
[0053]图2为Gateway兼容的pClean双元载体酶切鉴定
[0054]图3 为 pENTR/D-T0P0_ub1:bar:nos 载体构建及验证
[0055]A:ub1: bar: nos 表达盒的扩增；B:pENTR/D-T0P0_ub1: bar: nos 菌液 PCR 检测；C:SspI酶切鉴定；D:载体结构。
[0056]图4为中间载体pG185_ub1:bar:nos载体
[0057]A:Pme1-PacI酶切验证；B:载体结构
[0058]图5 为 pCG1852、pCG1853 和 pCG1854 载体的构建
[0059]图6为pCS1671-UB载体的构建
[0060]A:菌液PCR检测结果；B:载体结构
[0061]图7 为 T0P0_ub1: gus:nos 载体构建[0062]图8为LR重组在各载体中引入gus cassette
[0063]图9为用于农杆菌转化的5个载体组合
[0064]图10为农杆菌介导的不同载体组合转化小麦过程
[0065]图11为转5G7B载体部分植株的PCR检测
[0066]M =Marker DL2000 ；CK:非转基因植株;1_15:转基因植株。其中株系1、2、4、6、9、
11、12、13为bar、gus共整合植株;3、5、7、8、10、14、15为只含bar的植株。
[0067]图12为TO代转5G7B小麦的Southern杂交
[0068]左图为Southern杂交图；右图为pG1851_UG载体结构图
[0069]图13为Ttl代转5G7B小麦独立株系后代个体在Tl代的分离分析
[0070]图14为Ttl代转5G7B小麦独立株系后代个体的遗传分离分析
[0071 ] A:bar和gus基因的PCR检测。bar和gus PCR产物混合跑样；B:⑶S染色验证；C:bar表达验证;图A、B、C中1-15相对应。
[0072]图15为边界整合检测各引物位置示意图
[0073]图16为5G7B株系 边界整合PCR检测结果
【具体实施方式】
[0074]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0075]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0076]质粒pGreenll-UB 记载在如下文献中:Hellens RP, Edwards EA, LeylandNR，Bean Sj Mullineaux PM.2000.pGreen: a versatile and flexible binary Tivector for Agrobacterium-mediated plant transformation.Plant MolecularBiology42, 819 - 832，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0077]质粒pClean 系列包括:pClean_G181 (pCG181)、pClean_G185 (pCG185)、pClean_S167 (pCS167)，上述质粒均记载在如下文献中:Tholej V.，Worland B.，SnapeJW.，Vain P.2007.The pCLEAN dual binary vector system for Agrobacterium-mediatedplant transformation.Plant Physiologyl45:1211-1219.公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0078]质粒PAL156 均记载在如下文献中:He，Y.，Jones, HD.，Chen, XM.，Chen,Wang,DW.，Li，KX.，XiajLQ.2010.Agrobacterium-mediated transformation ofdurum wheat(Triticum turgidum L.var.durum cv Stewart)with improvedefficiency.61:1567-1581.公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0079]质粒PAL154 记载在如下文献中:He，Y.，Jones, HD.，Chen, XM.，Chen, Wang, DW.，Li,KX., Xiaj LQ.2010.Agrobacterium-mediated transformation of durum wheat (Triticumturgidum L.var.durum cv Stewart)with improved efficiency.61:1567-1581.公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。
[0080]PrimerStar平末端高保真聚合酶、Taq DNA聚合酶、dNTP购自大连宝生物工程有限公司。减性憐酸酶 SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase)、Klenow Fragment 和 T4DNA聚合酶购自Ferments公司。各种限制性内切酶购自NEB公司。pENTR? DirectionalTOPO Cloning Kits、Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdBSurvival2TICompenent Cells购自 Invitrogen公司。DH5 α 感受态、克隆载体pEASY-Blunt购自北京全式金生物技术有限公司。质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司。其它试剂均为国产分析纯产品。
[0081]实施例1、用于获得无标记转基因植物的农杆菌专用载体组合物
[0082]一、Gateway 兼容的 pCG1811、pCG1851、p C S1671 通用双元载体的构建
[0083]pCG181、pCG185、pCS167载体的结构如图1，分别在其T-DNA内插入ccdB读码框的DNA片段attRl-CmK-CCdB-attR2 (该DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列3，购自Invitrogen公司),得到双元载体pCG1811、pCG1851、p C S1671 ;具体过程如下:
[0084]l、pCG1811载体的构建
[0085]I)去P的平末端载体骨架的获得
[0086]将pCG181载体用Not I酶切，回收2718bp的酶切产物；再将上述回收的酶切产物依次经Klenow片段补平突出末端、纯化、去P反应，得到去P的平末端pCG181载体骨架，具体步骤和体系如下:
[0087]将上述回收的酶切产物经Klenow片段补平突出末端，得到补平产物；
[0088]反应体系如表1所示:
[0089]表1为补平突出末端反应体系
【权利要求】
1.一种用于获得无标记转基因植物的农杆菌专用载体组合物，由独立包装的重组载体和pClean系列载体的pClean-Soup载体组成； 所述重组载体为将目的基因和标记基因插入pClean系列载体的pClean-Green载体2个不同的T-DNA区中，得到表达所述目的基因和标记基因的重组载体。
2.根据权利要求1所述的载体组合物，其特征在于: 所述目的基因通过通过gatway重组到pClean系列载体的pClean-Green载体的T-DNA区； 所述标记基因以两端分别融合2LB和RB的DNA分子的形式插入pClean系列载体的pClean-Green载体的酶切位点间，形成另一个含有标记基因的T-DNA区。
3.根据权利要求1或2所述的载体组合物，其特征在于: 所述 pClean-Green 载体为 pCG181 或 pCG185 ;所述 pClean-Green 载体具体为 pCG185 ； 所述 pClean-Soup 载体为 pAL154。
4.根据权利要求3所述的载体组合物，其特征在于: 所述目的基因为GUS基因，所述标记基因为bar基因。
5.根据权利要求4所述的载体组合物，其特征在于: 所述gus基因以gus表达盒的形式插入所述pClean-Green载体中；所述gus表达盒包括启动子ub1、gus基因和终止子Nos ； 所述两端分别融合2LB和RB的DNA分子包括LB、第二个LB、启动子ub1、bar基因、终止子Nos和RB。
6.根据权利要求1-5中任一所述的载体组合物，其特征在于: 所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第1-3149位所示的核苷酸； 所述gus表达盒的核苷酸序列为序列表中序列2所示的核苷酸。
7.权利要求1-6中任一所述的载体组合物在鉴定或培育无标记转基因植物中的而应用； 所述植物为单子叶植物或双子叶植物； 所述单子叶植物具体为小麦。
8.一种用于获得无标记转基因植物的方法，包括如下步骤: 1)将权利要求1-6中任一所述的载体组合物中的重组载体和pClean-Soup载体共转染到植物外植体中，得到TO代转基因植物； 2)从TO代转基因植物中选取目的基因和标记基因共表达的TO代转基因植物，进行播种，收获Tl代转基因植物； 3)选取所述Tl代转基 因植物中无标记基因表达且有目的基因表达的植株，得到无标记转基因植株。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:所述植物外植体为胚； 所述目的基因为gus基因，所述标记基因为bar基因。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于: 所述植物为单子叶植物或双子叶植物； 所述单子叶植物具体为小麦。
【文档编号】A01H5/00GK103966257SQ201410160278
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月21日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】夏兰琴, 王根平, 杜文明, 孙永伟 申请人:中国农业科学院作物科学研究所