用于生物组织的流态化加载或取出低温保护剂的装置的制作方法

本发明涉及低温保存技术领域，具体涉及一种用于生物组织的流态化加载或取出低温保护剂的装置。

背景技术：

低温保存是指将活的生物样品采用特殊的方法冷却至低温，一般为-196℃并长期保存；待需要时，将生物样品按特殊的方法加热至正常温度，仍可获得活的生物样品。低温保存生物样品时，除了极简单的微生物、病毒和细菌等外，一般而言添加低温保护剂是必需的。

低温保护剂虽能在低温下对生物样品起保护作用，但要想这种保护起作用，必须将足够多的低温保护剂载入到生物样品内。然而，低温保护剂对生物样品来说是外来物质，对其有一定的毒性。这种毒性与低温保护剂的种类、浓度、处理温度和时间等因素密切相关，浓度越大、处理温度越高、处理时间越长，则毒性损伤越严重。假设需载入生物样品的低温保护剂的浓度确定，那么显然加载温度越低、加载时间越短，对低温保存越有利。不像悬浮细胞等生物样品，低温保护剂自然渗透生物组织往往需要较长的时间，导致加载低温保护剂时，生物组织更易遭受毒性损伤，这也是目前低温保存生物组织的难点所在。降低加载温度虽然可以减小毒性损伤，但同时也使得低温保护剂渗透生物组织的速率减慢，这意味着载入相同量的低温保护剂需要更长的时间，而加载时间加长又会增加遭受毒性损伤的风险。另外，当低温保护剂溶液的浓度确定时，最低加载温度一般认为是其平衡冻结点温度，若再继续降低则会发生冻结，这意味着在现有技术条件下，通过降低加载温度来减小毒性损伤是有限的。将低温保护剂从生物组织中取出时也存在同样的问题。

因此，若能使最低极限处理温度降至平衡冻结点温度以下，即增强过冷，同时又能加快低温保护剂渗透生物组织的速率，则能大大降低生物组织所遭受的毒性损伤，即能使低温保存生物组织的成功率大大提高，而目前尚没有可实现此种功能的自动化装置。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：提供一种能够在降低极限处理温度的同时加快低温保护剂载入和取出生物组织的速率的自动化装置。

本发明的技术解决方案是：一种用于生物组织的流态化加载或取出低温保护剂的装置，其特征在于：它包括溶液循环模块、溶液供给模块、样品容器、温控箱和控制器，所述样品容器设置在温控箱内，所述样品容器设有进液口和出液口，所述溶液循环模块与样品容器的进液口和出液口相连通以使溶液循环流经样品容器，所述溶液供给模块与溶液循环模块相连通以向溶液循环模块供给溶液，所述控制器分别与溶液供给模块、溶液循环模块和温控箱电连接。

采用上述结构后，本发明具有以下优点：

本发明低温保护剂溶液通过溶液循环模块变成一种持续循环流动的液体，这种流动性使得低温保护剂溶液在温度降低到平衡冻结点温度以下也不会凝固，即出现了过冷现象，从而可以降低极限处理温度；而同时这种流动性又可以加快低温保护剂溶液渗透生物组织的速率，从而使得本装置在降低极限处理温度的同时能加快低温保护剂载入和取出生物组织的速率，弥补了这一领域的空白；除此之外，由于溶液供给模块、溶液循环模块和温控箱均由控制器控制，使得整个装置实现了自动化。

作为优选，还包括气体供给模块，所述样品容器还设有进气口和出气口，所述气体供给模块与样品容器的进气口相连通，以使进入样品容器内的气体对样品容器内的溶液产生扰动并从出气口处排出，所述气体供给模块与控制器电连接。该设置通过气体供给模块使样品容器内的溶液产生扰动，并因为溶液的流动性，使得扰动程度增强，可进一步降低极限处理温度，并加快低温保护剂载入和取出生物组织的速率。

作为优选，所述样品容器包括气体流动腔以及设置在气体流动腔内的样品腔，所述进液口和出液口设置在样品腔上，所述进气口和出气口设置在气体流动腔上，所述溶液循环模块与样品腔的进液口和出液口相连通，所述气体供给模块与气体流动腔的进气口相连通，所述样品腔上还设有若干透气不透水的透气孔，以使进气口处进入的气体能穿过样品腔并从出气口处排出。该设置将液体通道和气体通道独立开来，液体通道内的溶液不会进入到气体通道内，但气体通道内的气体会进入液体通道内来增强溶液的扰动，整体结构简单，工作可靠。

作为优选，所述样品腔横向贯穿设置在气体流动腔内，以将气体流动腔分隔为上半腔室和下半腔室，所述进液口和出液口分别设置在样品腔的两端，所述进气口设置在气体流动腔的下半腔室上，所述出气口设置在气体流动腔的上半腔室上，所述透气孔设置在样品腔的侧壁上。该设置使溶液沿样品腔横向流过，而气体由下而上穿过样品腔，使得扰动作用较强，从而可以较大程度降低极限处理温度，并加快低温保护剂载入和取出生物组织的速率。

作为优选，所述进气口和出气口所在的第一直线L1垂直于进液口和出液口所在的第二直线L2。该设置使液体通道和气体通道相互垂直，可最大程度增强溶液的扰动，从而可最大程度降低极限处理温度，并加快低温保护剂载入和取出生物组织的速率。

作为优选，所述样品腔内沿横向方向均匀间隔设置若干隔板。该设置可将多个生物组织样品分开放置而不发生重叠，从而可以提高低温保护剂载入和取出生物组织的速率。

作为优选，所述溶液循环模块包括单向阀、混匀容器、第一蠕动泵、第一换热器和排液阀，所述单向阀、混匀容器、第一蠕动泵、第一换热器沿溶液流动方向依序连接，所述第一换热器位于温控箱内，所述排液阀的进液口分别与样品容器的出液口和单向阀的进液口相连通；所述溶液循环模块与样品容器的进液口和出液口相连通是指溶液循环模块的第一换热器的出液口、单向阀的进液口分别与样品容器的进液口、出液口相连通；所述控制器与溶液循环模块电连接是指控制器与第一蠕动泵电连接。该设置可以控制低温保护剂溶液以一定的流速循环流经样品容器，有利于提高低温保护剂载入和取出生物组织的速率以及降低低温保护剂溶液的极限处理温度；同时，溶液可以循环使用以节省试剂，混匀容器兼具调节循环系统容积、保持循环系统内压力以及利于排出循环系统内溶液的功能。

作为优选，所述溶液供给模块包括第一储液罐、第二储液罐、第二蠕动泵、第三蠕动泵、电导电极和铂电阻温度传感器，所述第一储液罐与第二蠕动泵的进液口相连通，所述第二储液罐与第三蠕动泵的进液口相连通，所述电导电极和铂电阻温度传感器位于混匀容器内；所述溶液供给模块与溶液循环模块相连通是指第二蠕动泵的出液口与第三蠕动泵的出液口连通后分别与单向阀的出液口、混匀容器的进液口相连通；所述控制器与溶液供给模块电连接是指控制器分别与第二蠕动泵、第三蠕动泵、电导电极和铂电阻温度传感器电连接。该设置有利于向溶液循环模块精准供给所要求浓度的低温保护剂溶液。

作为优选，所述气体供给模块包括气体发生器、第二换热器，气体发生器与第二换热器相连，所述第二换热器位于温控箱内；所述气体供给模块与样品容器的进气口相连通是指第二换热器的出气口与样品容器的进气口相连通；所述控制器与气体供给模块电连接是指控制器与气体发生器电连接。该设置结构简单、操作方便，更有利于本发明的实施及推广。

作为优选，所述气体供给模块中的气体为氮气。氮气便宜且使用安全。

附图说明：

图1为本发明用于生物组织的流态化加载或取出低温保护剂的装置的结构示意图；

图2为本发明样品容器的结构示意图；

图中：1-第一储液罐，2-第二储液罐，3-第二蠕动泵，4-第三蠕动泵，5-混匀容器，6-电导电极，7-第一蠕动泵，8-第一换热器，9-样品容器，9.1-样品腔，9.2-隔板，9.3-气体流动腔，9.4-进液口，9.5-出液口，9.6-进气口，9.7-出气口，10-排液阀，11-单向阀，12-气体发生器，13-第二换热器，14-温控箱，15-控制器，16-铂电阻温度传感器，17-上半腔室，18-下半腔室，19-透气孔，L1-第一直线，L2-第二直线。

具体实施方式

下面结合附图，并结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例：

如图1、图2所示，一种用于生物组织的流态化加载或取出低温保护剂的装置，其特征在于：它包括溶液循环模块、溶液供给模块、样品容器9、温控箱14和控制器15，所述样品容器9设置在温控箱14内，所述样品容器9设有进液口9.4和出液口9.5，所述溶液循环模块与样品容器9的进液口9.4和出液口9.5相连通以使溶液循环流经样品容器9，所述溶液供给模块与溶液循环模块相连通以向溶液循环模块供给溶液，所述控制器15分别与溶液供给模块、溶液循环模块和温控箱14电连接。

本发明低温保护剂溶液通过溶液循环模块变成一种持续循环流动的液体，这种流动性使得低温保护剂溶液在温度降低到平衡冻结点温度以下也不会凝固，即出现了过冷现象，从而可以降低极限处理温度；而同时这种流动性又可以加快低温保护剂溶液渗透生物组织的速率，从而使得本装置在降低极限处理温度的同时能加快低温保护剂载入和取出生物组织的速率，弥补了这一领域的空白；除此之外，由于溶液供给模块、溶液循环模块和温控箱14均由控制器15控制，使得整个装置实现了自动化。

作为优选，还包括气体供给模块，所述样品容器9还设有进气口9.6和出气口9.7，所述气体供给模块与样品容器9的进气口9.6相连通，以使进入样品容器9内的气体对样品容器内的溶液产生扰动并从出气口9.7处排出，所述气体供给模块与控制器15电连接。该设置通过气体供给模块使样品容器内的溶液产生扰动，并因为溶液的流动性，使得扰动程度增强，可进一步降低极限处理温度，并加快低温保护剂载入和取出生物组织的速率。

作为优选，所述样品容器9包括气体流动腔9.3以及设置在气体流动腔9.3内的样品腔9.1，所述进液口9.4和出液口9.5设置在样品腔9.1上，所述进气口9.6和出气口9.7设置在气体流动腔9.3上，所述溶液循环模块与样品腔9.1的进液口9.4和出液口9.5相连通，所述气体供给模块与气体流动腔9.3的进气口9.6相连通，所述样品腔9.1上还设有若干透气不透水的透气孔19，以使进气口9.6处进入的气体能穿过样品腔9.1并从出气口9.7处排出。该设置将液体通道和气体通道独立开来，液体通道内的溶液不会进入到气体通道内，但气体通道内的气体会进入液体通道内来增强溶液的扰动，整体结构简单，工作可靠。

作为优选，所述样品腔9.1横向贯穿设置在气体流动腔9.3内，以将气体流动腔9.3分隔为上半腔室17和下半腔室18，所述进液口9.4和出液口9.5分别设置在样品腔9.1的两端，所述进气口9.6设置在气体流动腔9.3的下半腔室18上，所述出气口9.7设置在气体流动腔9.3的上半腔室17上，所述透气孔19设置在样品腔9.1的侧壁上。该设置使溶液沿样品腔9.1横向流过，而气体由下而上穿过样品腔9.1，使得扰动作用较强，从而可以较大程度降低极限处理温度，并加快低温保护剂载入和取出生物组织的速率。

作为优选，所述进气口9.6和出气口9.7所在的第一直线L1垂直于进液口9.4和出液口9.5所在的第二直线L2。该设置使液体通道和气体通道相互垂直，可最大程度增强溶液的扰动，从而可最大程度降低极限处理温度，并加快低温保护剂载入和取出生物组织的速率。

作为优选，所述样品腔9.1内沿横向方向均匀间隔设置若干隔板9.2，为清楚显示样品腔9.1和隔板9.2的结构，氮气流动腔9.3在图2中只给出一半，样品腔9.1也被切除一部分。该设置可将多个生物组织样品分开放置而不发生重叠，从而可以提高低温保护剂载入和取出生物组织的速率。

作为优选，所述溶液循环模块包括单向阀11、混匀容器5、第一蠕动泵7、第一换热器8和排液阀10，所述单向阀11、混匀容器5、第一蠕动泵7、第一换热器8沿溶液流动方向依序连接，所述第一换热器8位于温控箱14内，所述排液阀10的进液口分别与样品容器9的出液口9.5和单向阀11的进液口相连通；所述溶液循环模块与样品容器9的进液口9.4和出液口9.5相连通是指溶液循环模块的第一换热器8的出液口、单向阀11的进液口分别与样品容器9的进液口9.4、出液口9.5相连通；所述控制器15与溶液循环模块电连接是指控制器15与第一蠕动泵7电连接。该设置可以控制低温保护剂溶液以一定的流速循环流经样品容器9，有利于提高低温保护剂载入和取出生物组织的速率以及降低低温保护剂溶液的极限处理温度；同时，溶液可以循环使用以节省试剂，混匀容器5兼具调节循环系统容积、保持循环系统内压力以及利于排出循环系统内溶液的功能。

作为优选，所述溶液供给模块包括第一储液罐1、第二储液罐2、第二蠕动泵3、第三蠕动泵4、电导电极6和铂电阻温度传感器16，所述第一储液罐1与第二蠕动泵3的进液口相连通，所述第二储液罐2与第三蠕动泵4的进液口相连通，所述电导电极6和铂电阻温度传感器16位于混匀容器5内；所述溶液供给模块与溶液循环模块相连通是指第二蠕动泵3的出液口与第三蠕动泵4的出液口连通后分别与单向阀11的出液口、混匀容器5的进液口相连通；所述控制器15与溶液供给模块电连接是指控制器15分别与第二蠕动泵3、第三蠕动泵4、电导电极6和铂电阻温度传感器16电连接。该设置有利于向溶液循环模块精准供给所要求浓度的低温保护剂溶液。

作为优选，所述气体供给模块包括气体发生器12、第二换热器13，气体发生器12与第二换热器13相连，所述第二换热器13位于温控箱14内；所述气体供给模块与样品容器9的进气口9.6相连通是指第二换热器13的出气口与样品容器9的进气口9.6相连通；所述控制器15与气体供给模块电连接是指控制器15与气体发生器12电连接。该设置结构简单、操作方便，更有利于本发明的实施及推广。

作为优选，所述气体供给模块中的气体为氮气。氮气便宜且使用安全。

上述第一换热器8和第二换热器13由一段较长的管路弯折制得，也可以加装翅片等利于换热的结构，凡是能够实现流体流过并进行热交换的结构均适用于第一换热器8和第二换热器13所表示的结构；上述温控箱14为现有技术典型的温控装置，可以为机械制冷或液氮制冷结合电加热装置、温度传感器实现，为示图简介清楚，所有部件均由图中方框表示；所述混匀容器5应用的是典型的现有技术，即电磁搅拌，为示图简介清楚，搅拌子和电磁搅拌器未给出。图中实心箭头表示溶液流动方向，空心箭头表示氮气流动方向。

本发明主要由四部分组成：溶液浓度控制、温度控制、溶液流速控制和氮气流速控制。溶液浓度控制部分的作用是使循环流经样品容器9的低温保护剂溶液的浓度按照设定的程序变化，包括第一储液罐1、第二储液罐2、第二蠕动泵3、第三蠕动泵4、电导电极6、铂电阻温度传感器16和控制器15。所述温度控制部分的作用是使流经样品容器9的低温保护剂溶液和氮气的温度均按照设定的程序变化，包括温控箱14、第一换热器8、第二换热器13和控制器15。所述溶液流速控制部分的作用是使循环流经样品容器9的低温保护剂溶液的流速保持在某一个定值或按照设定的程序变化，包括第一蠕动泵7和控制器15。所述氮气流速控制部分的作用是使流经样品容器9的氮气的流速保持在某一个定值或按照设定的程序变化，包括氮气发生器12和控制器15。

对生物组织样品进行流态化加载或取出低温保护剂处理之前，首先要建立采用的低温保护剂溶液的电导率与浓度和温度之间的关系模型，并输入到控制器15中。对于二甲亚砜/氯化钠/水、甘油/氯化钠/水、乙二醇/氯化钠/水、丙二醇/氯化钠/水、海藻糖/氯化钠/水这五种低温保护剂溶液，氯化钠的浓度为定值0.9％wt，电导率与浓度和温度之间的关系模型如下：

$\mathrm{\κ}={\mathrm{\κ}}_0\exp (-\frac{E_a}{RT})\·(C_0+C_{1}x+C_2{x}^2)$

式中，κ为电导率，单位：mS/cm，T为温度，单位：K，x为低温保护剂的质量分数，R为摩尔气体常数，其值为8.314J/(mol·K)，κ₀、E_a、C₀、C₁和C₂为模型系数，其值如下表所示：

本发明以向关节软骨组织中加载二甲亚砜为例，加载过程如下：

打开内置在控制器15内的程序，输入二甲亚砜/氯化钠/水溶液的电导率与浓度和温度之间的关系模型，并设定好浓度、温度和流速变化程序；将0.9％wt的氯化钠溶液和高浓度二甲亚砜/氯化钠/水溶液分别装入到第一储液罐1和第二储液罐2中；将1个或多个大小合适的关节软骨组织置于样品腔9.1内隔板9.2之间；开启第一蠕动泵7、第二蠕动泵3、第三蠕动泵4、氮气发生器12和温控箱14。

所述溶液循环模块中二甲亚砜溶液的浓度是通过改变第二蠕动泵3和第三蠕动泵4的转速来控制。所述氯化钠溶液和二甲亚砜在混匀容器5里充分混匀，电导电极6检测溶液的电导率，铂电阻温度传感器16检测溶液的温度，两者分别把信号传送给控制器15转化为浓度数值，并与预设浓度进行比较，控制器15根据处理结果输出信号到第一蠕动泵7和第二蠕动泵3，控制两者的转速。

所述温控箱14内温度按照设定的程序变化，溶液循环模块中的溶液通过第一换热器8被冷却后进入样品腔9.1内，所述氮气供给模块中的氮气通过第二换热器13被冷却，流经样品腔9.1以对样品腔9.1内的溶液产生扰动，最后从出气口9.7处排出。

所述溶液循环模块中溶液的流速通过改变第一蠕动泵7的转速来控制，所述第一蠕动泵7的转速保持一定值或按照设定的程序变化；所述氮气供给模块中氮气的流速保持一定值或按照设定的程序变化。

加载过程结束后，关闭第二蠕动泵3、第三蠕动泵4、氮气发生器12和温控箱14，打开排液阀10，待溶液循环模块中的溶液排净后关闭第一蠕动泵7和排液阀10，取出关节软骨组织以进行后续处理；最后将蒸馏水装入第一储液罐1，打开第二蠕动泵3，将一定量的蒸馏水输送入溶液循环模块，打开第一蠕动泵7，用蒸馏水冲洗溶液循环模块，然后打开排液阀10将冲洗液排净，此时装置已被清洗干净，可以进行下一次加载。

以上为本装置低温保护剂溶液的加载过程，而取出过程与加载过程类似，这里不再赘述，不同之处在于：加载过程中溶液循环模块中溶液的浓度是逐渐升高的，且温控箱14内的温度是逐渐下降的，而取出过程中溶液循环模块中溶液的浓度是逐渐降低的，且温控箱14内的温度是逐渐上升的。