一种基于改良培养基的五针白皮松组培快繁方法与流程

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种基于改良培养基的五针白皮松组培快繁方法。

背景技术：

五针白皮松(Pinus squamata X.W.Li)是李乡旺于上世纪90年代发现的仅分布于我国云南省巧家县的珍稀树种(李乡旺.云南松属一新系一新种.云南植物研究，1992，14:259-260.)。天然状态下该种仅存立木31株，其野外种群低于稳定存活界限(野生株数≤5000株)，随时有灭绝的危险，2008年被列入云南省极小种群物种，2010年云南省林业厅、云南省绿色环境发展基金会指导资助开展实施野外救护项目，且被列入全球100种最濒危物种名录。

五针白皮松干形优美、生长较快、适应力强、木材结构细、纹理通直，具有很高的观赏价值、经济价值和科研价值(朱宝华.五针白皮松的生态特性及生长过程.云南林业科技，1933，1:29-33.)。然而，由于上述推测的各种原因，五针白皮松正处于极度濒危状态。针对种源稀缺的问题，普通栽培技术难以达到五针白皮松种源大量繁殖的目的，所以采取一些快速繁殖的措施将有利于该物种的保护与利用。李桐森曾尝试将五针白皮松嫁接在华山松和云南松的砧木上，并且在华山松上获得较高的成活率与较好的长势(李桐森，李乡旺，毓伟.五针白皮松异砧嫁接试验初报.西南林学院学报，1997，17:11-16.)，但是由于接穗数量少，采穗困难，以及嫁接技术本身存在的局限性，使得该方法的进一步推广仍存在问题。普晓兰曾以五针白皮松种子为材料进行离体胚培养，但是不定芽诱导率过低，仅为29％，不能满足快繁要求(普晓兰，林平，李乡旺.五针白皮松离体培养初步研究.西南林学院学报，1997，17:17-20.)。

组织培养是近几十年来应用较为普遍的快繁与育苗技术。在林木组织培养快速繁殖中，通过器官发生方式产生再生植株是最成功的离体培养繁殖方式。松树作为主要的造林树种，其组培快繁技术在20世纪六、七十年代开始起步，并得到快速发展。针对云南白皮松现存株数极少，普通繁殖技术难以实现规模化育苗的现状，基于组织培养快速繁殖技术具有繁殖周期短，效率高，可整年进行生产，节省材料，且能保持植物原有优良性状等优势，利用组织培养快速繁殖技术仍然是扩大五针白皮松种群的最佳方案。

然而，根据国内外关于松树组织培养育种方面的研究和探索的众多报道，松树组织培养快速繁殖育种技术仍然存在不定芽诱导困难、诱导苗增殖率低，增殖速度慢等技术性难题。而导致这系列困难存在的一个重要原因是目前所使用的普通松树组培培养基营养成分不能使得松树不定芽很好地增殖。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是在于提供一种基于改良培养基的五针白皮松组培快繁方法，对所使用的培养基添加成熟土豆泥和成熟香蕉泥为天然有机基质的改良，从而促进五针白皮松规模化繁殖育种。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

一种基于改良培养基的五针白皮松组培快繁方法，其过程为：

步骤1，种子的灭菌消毒

将五针白皮松种子洗净后，采用以下任意一种方法灭菌消毒：(1)先用75％的酒精消毒1min、无菌水冲洗两次，再用2％次氯酸钠溶液消毒15min、无菌水冲洗5次，吸干水分后备用；(2)先用酒精消毒1min、无菌水冲洗两次，再用0.1％升汞溶液消毒10min、无菌水冲洗5次，吸干水分后备用；

步骤2，种胚萌发诱导培养获取组培苗

(1)获取种胚：将所述步骤1中灭菌消毒后的种子在超净台上，在无菌条件下吸干水分后剥种壳，获取种胚；

(2)诱导培养种胚：将处理后的种胚接种到1/3GD改良诱导培养基中，在24-26℃条件下暗培养4-7天；待种仁萌发后在26-28℃条件下光照培养25-30天，平均每天光照12小时，光照强度为1500-2000lux，使诱导培养的苗长至4-6cm，并且伴有侧芽萌发，即为初代诱导的组培苗；

步骤3，组培苗增殖培养

将所述步骤2初代诱导的增殖苗切割分株后接种于GD改良培养基上，于26-28℃条件下培养20-25天为继代增殖苗，平均每天光照14小时，光照强度为3000-3500lux；

步骤4，增殖苗壮苗培养

将所述步骤3的继代增殖苗切割分株后接种于MS改良培养基上，在26-28℃条件下培养10-15天，平均每天光照14小时，光照强度为3000-3500lux；

步骤5，增殖苗生根诱导培养

将所述步骤4壮苗培养后的增殖苗分株接种于1/2MS改良培养基，在26-28℃条件下培养20-25天，平均每天光照14小时，光照强度为3000-3500lux；

步骤6，生根苗的练苗培养

包含两阶段：第一阶段将生根苗连同组培瓶一起放到大棚内培养，培养温度为25-28℃，光照为大棚内非太阳直接照射的自然光，培养时间为7-14天；第二阶段将瓶苗移栽到经过消毒处理的练苗土壤中，培养温度为25-28℃，光照为大棚内非太阳直接照射的自然光，培养30-50天，即可。

所述步骤2中1/3GD改良诱导培养基为1/3GD+土豆1％+香蕉1％+蔗糖20.0g/L+琼脂5.0g/L+6-BA 0.1-0.5mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L。

所述步骤3中GD改良培养基为GD+土豆1％+香蕉1％+蔗糖20.0g/L+琼脂5.0g/L+6-BA 0.5-2.0mg/L+NAA 0.1mg/L。

所述步骤4中MS改良培养基为MS+土豆1％+香蕉1％+蔗糖20.0g/L+琼脂5.0g/L+6-BA 0.1-1.0mg/L+NAA 0.5mg/L。

所述步骤5中1/2MS改良培养基为1/2MS+土豆1％+香蕉1％+蔗糖20.0g/L+琼脂5.0g/L+6-BA 0.1mg/L+NAA 1.0-5.0mg/L。

本发明方法的有益效果为：

(1)本发明的改良培养基含有更丰富的植物生长所必须的碳源、氮源和其他微量营养元素，从而使得五针白皮松不定芽和植株更容易增殖，并且植株长势良好；

(2)本发明方法操作步骤简便，培养周期短，所培养的五针白皮松种苗质量良好，可以运用于五针白皮松的产业化繁殖育种。

附图说明

图1表示不同浓度水平的6-BA和NAA对五针白皮松种胚不定芽的诱导出芽率；

图2表示不同浓度水平的6-BA对五针白皮松不定芽和植株增殖的影响；

图3表示不同浓度水平的NAA对五针白皮松植株诱导生根的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

(1)改良培养基的配制

将去皮土豆切小块或片，用100倍体积蒸馏水煮烂，然后将成熟香蕉切碎混入其中，再用匀浆机将其充分打碎为混合泥，将处理好的混合泥分别添加到GD基本培养基或MS基本培养基中，使1/3GD改良诱导培养基、GD改良培养基、1/2MS改良培养基和MS改良培养基中成熟土豆泥和成熟香蕉泥的比例均为1％。

(2)种子的选择

种子选取：良种系五针白皮松优种子采集于云南省昭通市巧家县药山国家自然保护区，采集时间为2015年3月份。

(3)种子的灭菌消毒

将五针白皮松种子洗净后，先用75％的酒精消毒1min、无菌水冲洗两次，再用2％次氯酸钠溶液消毒15min、无菌水冲洗5次，吸干水分后备用。

(4)种仁萌发诱导

获取种胚：将灭菌消毒后的种子在超净台上，在无菌条件下吸干水分后剥种壳，获取种胚。

表1

诱导培养种胚：将处理后的种胚接种到1/3GD改良诱导培养基中，其中：6-BA浓度为0.2mg/L，NAA浓度为0.2mg/L，在24-26℃条件下暗培养4-7天；待种仁萌发后在26-28℃条件下光照培养25-30天，平均每天光照12小时，光照强度为1500-2000lux，使诱导培养的苗长至4-6cm，并且伴有侧芽萌发，即为初代诱导的组培苗。参照图1，本实施例的不定芽诱出率为75％。其中，1/3GD培养基的具体配方见表1。

(5)组培苗增殖培养

将初代诱导的增殖苗切割分株后接种于GD改良培养基上，6-BA浓度为0.5mg/L，NAA浓度为0.1mg/L，于26-28℃条件下培养20-25天为继代增殖苗，平均每天光照14小时，光照强度为3000-3500lux。参照图2，相对较低浓度的6-BA不能使不定芽明显增殖，增殖率仅为200％。其中，GD培养基的具体配方见表2。

表2

(6)增殖苗壮苗培养

将继代增殖苗切割分株后接种于MS改良培养基上，6-BA浓度为0.1mg/L,NAA浓度为0.5mg/L，在26-28℃条件下培养10-15天，平均每天光照14小时，光照强度为3000-3500lux。其中，MS培养基的具体配方见表3。

表3

(7)增殖苗生根诱导培养

将壮苗培养后的增殖苗分株接种于1/2MS改良培养基，细胞分裂素6-BA浓度为0.1mg/L,生长素NAA浓度为2.0mg/L，在26-28℃条件下培养20-25天，平均每天光照14小时，光照强度为3000-3500lux。参照图3，植株生根率为65％，相对较低。其中，1/2MS培养基的具体配方见表4。

表4

(8)生根苗的练苗培养

第一阶段将生根苗连同组培瓶一起放到大棚内培养，培养温度为25-28℃，光照为大棚内非太阳直接照射的自然光，培养时间为7-14天；第二阶段将瓶苗移栽到经过消毒处理的练苗土壤中，培养温度为25-28℃，光照为大棚内非太阳直接照射的自然光，培养30-50天即可。

实施例2

(1)改良培养基的配制

改良培养基的配制方法同实施例1。

(2)种子的选择

种子选取同实施例1。

(3)种子的灭菌消毒

先用酒精消毒1min、无菌水冲洗两次，再用0.1％升汞溶液消毒10min、无菌水冲洗5次，吸干水分后备用。

(4)种仁萌发诱导

获取种胚：获取种胚方法同实施例1；

诱导培养种胚：将处理后的种胚接种到含0.4mg/L 6-BA和0.4mg/L NAA的1/3GD改良培养基中，在24-26℃条件下暗培养4-7天；待种仁萌发后在26-28℃条件下光照培养25-30天，平均每天光照12小时，光照强度为1500-2000lux，使诱导培养的苗长至4-6cm，并且伴有侧芽萌发，即为初代诱导的组培苗。1/3GD培养基的具体配方同实施例1。参照图1，6-BA与NAA浓度水平为最适水平，不定芽诱出率可达94％。

(5)组培苗增殖培养

将初代诱导的增殖苗切割分株后接种于GD改良培养基上，细胞分裂素6-BA浓度为1.2mg/L和生长素NAA浓度为0.1mg/L，于26-28℃条件下培养20-25天为继代增殖苗，平均每天光照14小时，光照强度为3000-3500lux。GD培养基的具体配方同实施例1。参照图2，随着细胞分裂素浓度的升高，植株增殖率迅速升高且可达500％。

(6)增殖苗壮苗培养

增殖苗壮苗培养同实施例1。

(7)增殖苗生根诱导培养

将壮苗培养后的增殖苗分株接种于1/2MS改良培养基，细胞分裂素6-BA浓度为0.1mg/L，生长素NAA浓度为3.0mg/L，在26-28℃条件下培养20-25天，平均每天光照14小时，光照强度为3000-3500lux。1/2MS培养基的具体配方同实施例1。参照图3，此浓度的生长素生根率可达92％，是本发明中的最适浓度水平。

(8)生根苗的练苗培养

生根苗的练苗培养同实施例1。

实施例3

(1)改良培养基的配制

改良培养基的配制同实施例1。

(2)种子的选择

种子选取同实施例1。

(3)种子的灭菌消毒

种子的灭菌消毒同实施例2。

(4)种仁萌发诱导

获取种胚：获取种胚方法同实施例1；

诱导培养种胚：将处理后的种胚接种到含0.5mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA的1/3GD改良诱导培养基中，在24-26℃条件下暗培养4-7天；待种仁萌发后在26-28℃条件下光照培养25-30天，平均每天光照12小时，光照强度为1500-2000lux，使诱导培养的苗长至4-6cm，并且伴有侧芽萌发，即为初代诱导的组培苗。1/3GD培养基的具体配方同实施例1。参照图1，继续升高细胞分裂素和生长素浓度水平对不定芽诱出率没有提高。

(5)组培苗增殖培养

将初代诱导的增殖苗切割分株后接种于GD改良培养基上，6-BA浓度为2.0mg/L和NAA浓度为0.1mg/L，于26-28℃条件下培养20-25天为继代增殖苗，平均每天光照14小时，光照强度为3000-3500lux。GD培养基的具体配方同实施例1。参照图2，1.6-2.2mg/L是6-BA浓度的最适水平，这个水平浓度可使植株增殖率高达700％。

(6)增殖苗壮苗培养

增殖苗壮苗培养同实施例1。

(7)增殖苗生根诱导培养

将壮苗培养后的增殖苗分株接种于1/2MS改良培养基，6-BA浓度为0.1mg/L和NAA浓度为5.0mg/L，在26-28℃条件下培养20-25天，平均每天光照14小时，光照强度为3000-3500lux。1/2MS培养基的具体配方同实施例1。参照图3，用相对较高浓度的NAA，植株的生根率没有提高，反而有下降的趋势，生根率为85％。

(8)生根苗的练苗培养

生根苗的练苗培养同实施例1。

以上所述，仅是本发明的较佳案例，并不对本发明做出任何限制，凡是针对本发明技术内容对以上实施案例所做的任何简单修改、变更、模仿均属于本发明技术方案的保护范围。