宠物外周血直接冻存试剂和方法与流程

本发明涉及宠物外周血冻存技术领域，具体地说，涉及一种用于宠物外周血直接冻存的试剂及方法。

背景技术：

宠物(主要指作为伴侣动物的狗和猫)能够陪伴人类，缓解日常生活中的压力，愉悦心情，促进人类健康，成为家庭中的一员。随着我国经济的发展、老龄化程度的加重，对宠物的需求越来越大。宠物数量增加的同时，宠物食品、宠物用品、宠物培训等产业得到了蓬勃的发展。宠物健康领域并没有受到足够的关注，也尚未形成规范。相比人类健康市场，宠物健康市场有很大的空间尚待挖掘。关爱宠物，关注宠物健康。

宠物外周血中除了占绝大多数的血细胞外，还含有丰富的单核细胞、细胞因子。最近研究表明，通过置换年轻动物和老年动物的血液，可以让年轻动物表现出衰老状态，而老年动物可以返老还童，这些奥秘可能与年轻血液中的细胞因子有关。外周血不仅取材方便，而且功能丰富，其中T淋巴细胞可以经过嵌合抗原受体改造，体外扩增后用于治疗淋巴瘤等恶性肿瘤；NK细胞可以帮助机体抵抗衰老，用于美容；MSC细胞可以有效缓解机体炎症反应，用于治疗关节炎等。然而这些有益效果均取决于一份健康的外周血，一旦宠物衰老或者患病后这些细胞的活力都会显著下降，使用非自体的外周血细胞又会产生免疫排斥反应。因此，在宠物年轻健康的时候为其冻存一份外周血十分必要。

目前市面上尚未有针对宠物外周血直接冻存的产品存在。参考人类健康领域，外周血一般通过两种方式冻存，一种是离心浓缩后加入冻存试剂冻存，另一种是提取血液中的不同细胞进行分别冻存。这两种方式操作上都十分复杂，而且会丢失诸如细胞因子在内的一些有益成分。

技术实现要素：

发明要解决的技术问题

鉴于上述技术课题，发明人反复研究后意外地发现，将二甲基亚砜、羟甲基纤维素钠、MEM培养基配制成冻存试剂，并将二甲基亚砜、羟甲基纤维素钠的浓度调整为远高于传统冻存试剂中的浓度时，可以实现直接冻存的效果，即，使用该浓度的冻存试剂时，无需对外周血进行浓缩离心等操作，将该冻存试剂与外周血以大致1:1的比例混合后直接冻存于-80℃左右，复苏后总细胞活力几乎与新鲜血液相同，可以达到非常优良的冻存效果。

用于解决上述技术问题的方案

(1)一种冻存试剂，包括：羟甲基纤维素钠10～20W/V％，二甲基亚砜15～35V/V％，MEM培养基65～85V/V％。

(2)一种冻存试剂，包括：羟甲基纤维素钠10～15W/V％，二甲基亚砜15～30V/V％，MEM培养基65～85V/V％。

(3)如(1)或(2)所述的冻存试剂，还包括：

聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％，肌苷3～7W/V％，碳酸氢钠0.5～2.5W/V％。

(4)如(1)或(2)所述的冻存试剂在宠物外周血冻存中的用途。

(5)如(3)所述的冻存试剂在宠物外周血冻存中的用途。

(6)一种外周血直接冻存方法，包括如下步骤：

a.将(1)～(3)中任一项所述的冻存试剂分别注入细胞冻存管；

b.采集宠物外周血；

c.30分钟内，将步骤b中采集的外周血加入步骤a的冻存管中，混匀；

d.将冻存管-80±5℃下冻存一天一夜；

e.将冻存管移入液氮长期存储。

发明效果

本发明的宠物外周血冻存试剂可以直接冻存宠物外周血，与传统方法相比，无需对血液进行离心浓缩，最大限度的保留了血液中的有益成分。使用过程中，只需将冻存试剂与血液以大致1：1的比例混合，混匀后可直接在-80℃左右冻存，无需使用传统冻存试剂时的程序降温步骤。除此之外，本发明的宠物外周血冻存冻存方法配合该冻存试剂使用，方便、快捷，效果稳定，冻存的外周血在复苏后，细胞活率高，可以方便宠物在衰老状态及疾病状态时利用自身健康外周血中细胞成分进行美容、治疗关节炎、抗衰老、肿瘤的免疫治疗等。

附图说明

图1是对照组的单核细胞2h差速贴壁100X明场照片。

图2是本发明实施例4的9m单核细胞2h差速贴壁100X明场照片。

具体实施方式

本发明的第一方面是宠物外周血冻存试剂。

本发明的宠物外周血冻存试剂中，主要成分为羟甲基纤维素钠、二甲基亚砜(DMSO)和MEM培养基。

本发明的冻存试剂中，羟甲基纤维素钠的浓度优选为10～20W/V％，如果羟甲基纤维素钠的浓度低于10W/V％，外周血在该试剂中直接冻存的话，复苏后的细胞存活率较低，无法满足冻存的要求。如果羟甲基纤维素钠的浓度高于20W/V％，外周血在该试剂中直接冻存的话，高浓度的羟甲基纤维素钠会导致外周血中细胞脱水，直接导致细胞死亡。羟甲基纤维素钠的浓度更优选为10～15W/V％。

本发明的冻存试剂中，二甲基亚砜的浓度优选为15～35V/V％，如果二甲基亚砜的浓度低于15V/V％，外周血在该试剂中直接冻存的话，复苏后的细胞存活率较低，无法满足冻存的要求。如果二甲基亚砜的浓度高于35V/V％，外周血在该试剂中直接冻存的话，高浓度的二甲基亚砜会导致严重的细胞膜毒性，影响冻存复苏效率。二甲基亚砜的浓度更优选为15～30V/V％，例如更优选为20V/V％。

本发明的冻存试剂优选还包含增效成分聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％，肌苷3～7W/V％，碳酸氢钠0.5～2.5W/V％。通过添加这些成分，可以使发明效果更好。

较优的，本发明的冻存试剂含有羟甲基纤维素钠10W/V％，二甲基亚砜20V/V％，MEM培养基80V/V％；以及聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％，肌苷4W/V％，碳酸氢钠1.5W/V％。

本发明的第二方面是配合该直接冻存试剂使用的外周血的冻存方法，包括如下步骤：

a.将本发明的外周血冻存试剂分别注入细胞冻存管；

b.采集宠物外周血；

c.30分钟内，将步骤b中采集的外周血加入步骤a的冻存管中，混匀；

d.将冻存管-80±5℃下冻存一天一夜；

e.将冻存管移入液氮长期存储。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。例如，W/V％表示每100ml中含有的重量，单位为g。V/V％表示每100ml中含有的体积，单位为ml。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

1.宠物外周血冻存试剂的制备

分别按照表1所示的量，量取二甲基亚砜(简称DMSO，购自SIGMA)、MEM培养基(购自GIBCO)放入250ml蓝口瓶(购自蜀牛)，轻摇混匀。然后按照表1所示的量称取羟甲基纤维素钠(购自SIGMA)、聚乙烯吡咯烷酮(简称PVP，购自SIGMA)、葡萄糖(购自SIGMA)、肌苷(购自SIGMA)、碳酸氢钠(购自SIGMA)加入上述蓝口瓶中，摇晃混匀。待固体全部溶解后用0.22μm滤器(购自MILLIPORE)过滤除菌，过滤至经过高压灭菌的100ml蓝口瓶(购自蜀牛)，制备实施例和比较例，保存于4℃冰箱备用。

表1：冻存试剂的制备

2.宠物外周血的冻存方法

依次按照如下步骤冻存宠物外周血：

a.将大约5ml如表1所示制备的各实施例和比较例的冻存试剂分别注入各10ml细胞冻存管(购自SIGMA)中；

b.使用含乙二胺四乙酸抗凝剂的紫色头盖真空采血管(购自康捷)采集宠物外周血约5ml，轻柔颠倒混匀，置于冰上；

c.30min内，将步骤b中采集的外周血分别加入步骤a的冻存管中，轻柔颠倒混匀；

d.立即放入-80℃冰箱(购自PANASONIC)短期冻存；

e.在-80℃冰箱冻存24h后移入液氮(购自MVE)长期存储；

f.需复苏时，取出冻存管后迅速放入37℃水浴中，摇晃解冻，解冻后马上进行后续操作。

3.效果试验

3.1宠物外周血冻存复苏后总细胞活力检测

分别取出含有实施例/比较例的冻存试剂和外周血的冻存管后，迅速放入37℃水浴箱(购自力辰科技)中，摇晃解冻，设置不同冻存复苏时间点，冻存3个月后复苏标记为3m，冻存6个月后复苏标记为6m，冻存9个月后复苏标记为9m。

另取5ml新鲜的外周血与5ml实施例4的冻存液混合均匀，未经冻存，标记为空白对照组。

使用自动细胞计数仪(购自LIFE TECH)，对各组进行细胞计数及存活率计算。各组分别重复三次，取平均值作为结果。

表2：宠物外周血冻存复苏后总细胞活力检测(n＝3)

由实验结果可知，使用本发明的实施例1～6的冻存试剂直接冻存外周血3个月、6个月、9个月复苏后总细胞活力相较新鲜血液没有显著变化，说明本发明的直接冻存试剂在方便、快捷实现冻存的同时能很好的保护外周血中细胞。

比较例1、2中，羟甲基纤维素钠的浓度低于10W/V％，复苏后的细胞存活率较低，无法满足冻存的要求。

比较例3的冻存试剂中，二甲基亚砜的浓度低于15V/V％，复苏后的细胞存活率较低，无法满足冻存的要求。

比较例4的冻存试剂中，羟甲基纤维素钠的浓度高于20W/V％，复苏后的细胞普遍皱缩，存活率较低，无法满足冻存的要求。

比较例5的冻存试剂中，二甲基亚砜的浓度高于35V/V％，复苏后的细胞碎片较多，存活率较低，无法满足冻存的要求。

3.2宠物外周血冻存复苏后单核细胞差速贴壁法培养比较

在上述3.1项中计数完毕后，将空白对照组和实施例4的9m复苏的外周血移至15ml无菌离心管中。离心机(购自湘仪)900转3min离心，弃去上清，使用10ml含有10％胎牛血清(购自GIBCO)的DMEM高糖培养基(购自GIBCO)重悬。种入100mm细胞培养皿(购自CORNING)中，5％CO₂，37℃培养箱培养。2h后换液，弃去未贴壁细胞，贴壁细胞大多数为单核细胞。实验结果如图1和图2所示，图1为空白对照组单核细胞2h差速贴壁100X明场照片，图2为在实施例4冻存试剂中冻存24h并移入液氮9m后，单核细胞2h差速贴壁100X明场照片。由图1和图2可见，两者无明显差别，说明本发明的直接冻存试剂在方便、快捷实现冻存的同时能很好的保护外周血中细胞。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。